ZH_单克隆抗体以及高级聚集体的体积排阻色谱分析方法开发

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烽牛
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1 单克隆抗体及其高聚体的体积排阻色谱分析方法开发 Paula Hong 和 Kenneth J. Fountain 沃特世公司 ( 美国马萨诸塞州米尔福德市枫树街 34 号 ) 应用优势稳定分析 mab 单体和聚集体高通量 SEC 分离一致的纯度曲线高级聚集体的可重现定量分析简单的 SEC 方法开发简介自生物类似药问世以来, 其中存在的蛋白质聚集体就一直是影响其安全性和疗效的一大阻碍 1 因此, 在生物治疗药物的整个生产过程中, 我们通常都会对蛋白质聚集体进行监测尽管现在已有多种分析技术可用于分析可溶性聚集体, 但一直以来占主导地位的都是体积排阻色谱 (SEC) 2 SEC 采用的是二醇基涂层的硅胶色谱柱和 HPLC 仪器, 引入 UPLC 或结合亚 2 m 颗粒的低扩散系统后, 其等度分离效果已经得到了进一步的改善, 能够实现更高的分离度分析通量以及分析的灵敏度 3 但是, 就像所有 SEC 方法一样, 我们还可通过调整该方法所涉及的多个参数来改善分离效果和提高方法稳定性以下应用, 我们将研究其中几个参数对 SEC 分离的影响, 包括流动相组成流速以及色谱柱长度该应用中对分离效果的评估基于色谱柱校准分离度以及聚集体定量等多个标准沃特世解决方案 ACQUITY UPLC H-Class Bio 系统 ACQUITY UPLC BEH200 SEC 1.7 µm 色谱柱 Auto Blend Plus 技术 Empower 2 软件关键词体积排阻色谱,UPLC, 单克隆抗体, 方法开发, 聚集体 1

实验样品描述本实验所用的蛋白质标准品 (BioRad, 溶解于去离子水中 ) 含牛甲状腺球蛋白 (5 mg/ml) 牛 γ- 球蛋白 (5 mg/ml) 鸡卵清蛋白 (5 mg/ml) 马肌红蛋白(2.5 mg/ml) 以及维生素 B12(0.5 mg/ml) 所分析的小鼠单克隆抗体经蛋白 A 亲和层析法纯化, 样品浓度为 10 mg/ml, 溶于 M 碳酸氢钠和 0.

2 实验样品描述本实验所用的蛋白质标准品 (BioRad, 溶解于去离子水中 ) 含牛甲状腺球蛋白 (5 mg/ml) 牛 γ- 球蛋白 (5 mg/ml) 鸡卵清蛋白 (5 mg/ml) 马肌红蛋白(2.5 mg/ml) 以及维生素 B12(0.5 mg/ml) 所分析的小鼠单克隆抗体经蛋白 A 亲和层析法纯化, 样品浓度为 10 mg/ml, 溶于 M 碳酸氢钠和 0.5 M 氯化钠溶液中,pH = 8.3 实验中未进行样品的实验间条件控制方法条件 LC 条件 : 系统 : 配备 TUV 和钛合金流通池的 ACQUITY UPLC H-Class Bio 系统结果与讨论进行 SEC 方法开发时需对多个因素进行评估理想情况下,SEC 分离基于溶液中蛋白质的尺寸大小鉴于此, 我们对水相条件下原始状态的生物分子进行了体积排阻色谱分析然而, 混合模式的相互作用会对蛋白质尺寸的测定产生影响 4 具体而言, 填充材料上带电荷的位点会与蛋白质相互作用, 从而发生离子交换效应为了确认这些效应对测定的影响程度, 我们需要对流动相条件进行评估但是另一方面, 色谱分离的条件又会改变蛋白质的结构和状态盐的浓度组成以及 ph 都会影响蛋白质的三维结构以及蛋白质间的相互作用因此, 在评估 SEC 方法时还需要结合生物分子的生物活性信息在下面的讨论中, 我们将概述 SEC 方法开发的思路和参数虽然我们以 UP-SEC 为例阐述 SEC 方法开发步骤, 同样的原则也适用于所有 HP-SEC 分离的方法开发我们将基于峰形分离度校准准确度以及定量结果对方法进行评估利用四元洗脱液管理系统, 并结合能充分利用该四元洗脱液混合系统优势的软件, 可轻松完成对流动相离子强度和 ph 的优化 5 这一方法将贯穿于我们的整个研究波长 : 色谱柱 : 柱温 : 样品温度 : 214 和 280 nm ACQUITY UPLC BEH200 SEC 1.7 µm, 4.6 x 150 mm, 部件号 C 4 C 流动相离子强度为了最大限度降低填料与蛋白质之间的次级相互作用, 必须调整流动相的离子强度我们分析了溶于 mm 氯化钠的一组蛋白标准品, 以确定流动相浓度对校准曲线的影响选择氯化钠是因为它是 SEC 分离中最常用的盐缓冲液浓度 ( 磷酸钠 ) 和 ph 分别保持 25 mm 和 6.8 在所有的测试浓度下, 每种蛋白质的保留时间差异均小于 7 min, 其中卵清蛋白的保留时间变化最大 ( 图 1) 这些结果表明校准曲线对盐浓度不敏感进样体积 : 2 µl( 除非另有说明 ) 流速 : 0.4 ml/min( 除非另有说明 ) 流动相 : 采用 Auto Blend Plus 技术制备最终组成 : 25 mm 磷酸钠, ph 6.8, 200 mm 氯化钠 ( 除非另有说明 ) 数据管理软件 : Empower 2 2

3 mm 200 mm 蛋白质甲状腺球蛋白分子量 mm γ- 球蛋白卵清蛋白肌红蛋白 Log MW 4.5 维生素 B 洗脱体积 (ml) 图 1. 氯化钠对 SEC 校准曲线的影响注 : 由于蛋白质在溶液中的形状不同, 校准点并非呈一条直线除了蛋白质标准品外, 我们还评估了溶于 mm 氯化钠中的小鼠单克隆抗体 (mab) 的 SEC 分离情况 ( 图 2) 正如通常会在凝胶过滤填料上观察到的一样 2, 较大的离子强度可减少 mab 单体的峰拖尾现象并使峰形更窄当氯化钠浓度从 50 升至 200 mm 时,mAb 的峰高从 89 升至 89 USP 拖尾因子也从 1.64 降至 1.22 而当流动相离子强度从 200 升至 250 mm 氯化钠时, 上述变化不再明显 (USP 拖尾因子 = 1.20) mm 聚集体 = 1.19% USP 分离度 = 0.92 USP 拖尾因子 = 1.64 AU min 200 mm 聚集体 = 5.27% USP 分离度 = 1.57 USP 拖尾因子 = mm 聚集体 = 5.39% USP 分离度 = 1.58 USP 拖尾因子 = min 图 2. 氯化钠对小鼠 mab 的 SEC 分离的影响 3

4 我们还分析了缓冲液离子强度对观察到的聚集体量的影响在上述实验中, 当氯化钠浓度从 50 升至 200 mm 时, 我们得到了更高的聚集体回收率 ( 如插图所示 ) 聚集体的峰面积百分比从 1.18% 增加至 5.27% 但是, 当氯化钠浓度超过 200 mm 时, 聚集体量的变化不再显著这说明高于该浓度时基本没有发生次级相互作用正如已经在制备 SEC 填料上所观察到的那样, 保留时间的差异以及峰形的改变表明蛋白质与色谱柱填料间发生了次级相互作用这些相互作用会延长保留时间并导致不规则的峰形, 而通过增强缓冲液的离子强度即可轻松将这些相互作用降至最小流动相 ph 考虑到 ph 对次级相互作用以及蛋白质结构均有影响, 我们在进行 SEC 方法开发时还应对 ph 及其可能对生物分子的分离和定量分析造成的影响进行评估我们使用 ph 的蛋白标准品混合物对 BEH200 色谱柱进行了评估这一分析的目的是评估 ph 对色谱柱校准的影响 ph 范围的选择基于磷酸钠缓冲液的缓冲能力范围氯化钠的浓度保持 200 mm 实验结果表明蛋白质的保留时间没有出现明显变化所有保留时间的差异均在 2min 之内 ( 图 3), 这说明在测试条件下,pH 对校准没有显著影响 6.5 ph 6.0, 200 mm ph 6.8, 200 mm ph 7.6, 200 mm 蛋白质甲状腺球蛋白 γ- 球蛋白分子量卵清蛋白肌红蛋白 Log MW 4.5 维生素 B 洗脱体积 (ml) 图 3. 流动相 ph 对 SEC 校准曲线的影响注 : 由于蛋白质在溶液中的形状不同, 校准点并非呈一条直线为了测试 ph 对典型生物治疗药物的影响, 我们在相同的条件下 (ph ,200 mm 氯化钠 ) 对 mab 进行了分析 ( 图 4) 随着 ph 从 6.0 升至 7.6,mAb 单体的峰高降低, 且保留时间提前 ( 图 4) 但是, 聚集体量在 ph 范围内的变化小于 0.4%( %), 这说明流动相 ph 对测定部分没有影响 4

5 AU ph 6.0 USP 分离度 = 1.3 聚集体 = 5.3% ph 6.8 USP 分离度 = 1.3 聚集体 = 5.7% ph 7.6 USP 分离度 = 1.1 聚集体 = 5.3% min 图 4. 流动相 ph 对小鼠 mab 的 SEC 分离的影响流动相 :25 mm 磷酸钠,200 mm 氯化钠,pH 缓冲液 ph 会影响次级相互作用在本实验中, 我们发现单体的洗脱曲线发生了改变, 而二聚体的洗脱曲线则没有变化这说明发生变化的是流体动力学半径而非次级相互作用流速线性速度会影响基于蛋白质尺寸分离的分离度尽管采用低流速时运行时间会更长, 但这样可提高分离度, 从而获得更可靠的聚集体定量结果此外, 本应用采用了亚 2 m 颗粒填料, 因此我们可以使用更短的色谱柱, 从而使得 UPLC-SEC 的通量仍高于传统的 HP-SEC 3 为了测试方法的可靠性和稳定性, 我们分析了流速对 mab 的 SEC 分离的影响, 分别在和 0.4 ml/min 的流速下对 mab 进行三次重复进样分析 ( 图 5) 对分离结果进行的分析表明, 聚集体的定量并未随流速发生显著改变但是, 流速降低却使单体 / 二聚体的分离度提高了 15% 较低的流速可提高分离度, 而较高的流速则能够提高通量和缩短分析时间 5

6 ml/min 聚集体 = 3.14% USP 分离度 = min ml/min 聚集体 = 3.16 % USP 分离度 = min 图 5. 流速对小鼠 mab 的 SEC 分离的影响色谱柱长度通过增加色谱柱长度也可改善 SEC 分离度 SEC 分离基于物质通过色谱柱填料孔隙的进出扩散较大的蛋白质无法进入孔隙, 因此会更早洗脱出来蛋白质越小, 其在孔隙中的驻留时间越长, 保留时间也就越长根据上述原理, 色谱柱越长, 分离度越高为了展示这些影响, 我们在 4.6 x 150 mm 以及 4.6 x 300 mm 的色谱柱上运行了一组蛋白标准品校准曲线的对比结果显示, 与 150 mm 色谱柱相比,300 mm 色谱柱的校准曲线斜率更加平缓, 说明增加色谱柱长度可增强其分离能力 ( 图 6) Log Mw mm 300 mm 蛋白质甲状腺球蛋白 γ- 球蛋白卵清蛋白肌红蛋白维生素 B12 分子量洗脱体积 (ml) 图 6. 色谱柱长度对 SEC 校准曲线的影响注 : 由于蛋白质在溶液中的形状不同, 校准点并非呈一条直线 6

7 另外, 我们还在 4.6 x 150 mm 以及 4.6 x 300 mm 色谱柱上使用小鼠 mab 测试了色谱柱长度对 SEC 分离的影响在相同的条件下, 单体 / 二聚体在较长的色谱柱上能够实现更高的分离度 ( ) ( 图 7), 且聚集体量相当分离度的改善还明显地体现在单体的峰拖尾上,300 mm 色谱柱分离所得的峰拖尾上部分分离出了一个低分子量的小峰, 而 150 mm 色谱柱分离所得的峰拖尾上则没有出现该峰然而, 伴随分离度改善的是保留时间的延长 ( 从 3.0 min 延长至 6.0 min) mm USP 分离度 = 2.07 聚集体 = 1.12% min USP 分离度 = 2.81 聚集体 = 1.22% 300 mm min 图 7. 色谱柱长度对小鼠 mab 的 SEC 分离的影响这些结果表明改变色谱柱长度是进行方法开发的一个有效途径根据方法的不同需求, 可以通过选择色谱柱长度达到更高的分离度或实现更高的通量例如, 在生产环境下, 增加色谱柱长度可达到更高的分离度而在研发过程中, 较短的色谱柱则能够缩短分析时间并提高分析通量 7

8 结论体积排阻色谱一直以来都是分析单克隆抗体及其聚集体的标准技术但是, 任何 SEC 方法都必须进行充分评估以开发出最佳方法与耗时的 HP-SEC 相比, 使用 UP-SEC 能够在更短的时间内更加高效和可靠地预测方法优化结果此外,Auto Blend Plus 技术的使用也让我们能够更加轻松地系统性研究流动相对蛋白质结构以及次级相互作用的影响如前所述, 要优化方法, 我们必须对多个条件进行评估, 包括流动相 (ph 和离子强度 ) 流速以及色谱柱长度此外, 虽然文中没有详细介绍, 进样体积载样量以及温度也是影响 SEC 分离的因素因此, 我们推荐在进行方法开发时, 应评估涉及下列影响因子的实验组 : 1. 离子强度 2. ph 3. 色谱柱长度 4. 流速 5. 其它变量 ( 载样量进样体积温度等 ) 参考文献 1. Rosenberg, A.S., Effects of Protein Aggregates: An Immunologic Perspective, AAPS Journal 8(3): article 59 [2006]. 2. Philo, J.S., Is Any Measurement Method Optimal for All Aggregate Sizes and Types? AAPS Journal, 8(3), article 65 [2006]. 3. Fountain, K.J., Hong, P., Serpe, S., Bouvier, G.S.P., Morrison, D., Analysis of Biomolecules by Size-Exclusion UltraPerformance Liquid Chromatography, Waters Application Note [2010]; Part Number WA Golovchenko, N. P., Kataeva, I.A., Akimenko, V. K., Analysis of ph- Dependent Protein Interactions with Gel Filtration Medium, J. of Chromatogr. 591: 121 [1992]. 5. Hong, P., Fountain, K.J., Wheat, T.E., Morrison, D., IEX Method Development of a Monoclonal Antibody and Its Charge Variants, Waters Application Note, [2011]; Part Number EN. 这些实验还应结合蛋白质的生物活性信息如果已知的影响蛋白生物活性的因素有限, 我们推荐使用 PBS 作为初始流动相沃特斯中国有限公司沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司 Waters, T he Science of What s Possible, ACQUITY UPLC 和 UPLC 是沃特世公司的注册商标 Auto Blend Plus 和 Empower 是沃特世公司的商标其它所有商标均归各自的拥有者所有所有其它商标均为其各自所有者的资产 2011 年沃特世公司印制于中国 2011 年 10 月 ZH LS-PDF 北京 : 上海广州成都香港免费售后服务热线 800 (400)

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~ 1 ~ ~ 2 ~ 1-1 UHPLC-SEC 法对治疗性抗体的分析 TSKgel UP-SW3 UHPLC HPLC A TSKgel UP-SW3 2 μm (4.6 mm ID. 15 cm B UHPLC-SEC 1.7 μm (4.6 mm ID. 15 cm mmol/l (ph 6.7 + 2SO4 mmol/l Na +.5 % NaN3.35 ml/ 25 UV 28 nm 5