本文工作分析 4 种不同蛋白提取液 SDT(2% SDS, 100 mm DTT,100 mm Tris-HCL, PH7.6) M-PER (ThermoFisher 哺乳动物细胞蛋白提取试剂盒, 专利去垢剂,25 mm bicine,ph7.6) T-PER (ThermoFisher 哺乳动物

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故明
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AN_C_LCMSMS_1_201704Y 不同蛋白提取液对动物组织全蛋白质组鉴定的影响孙佳楠唐家澍赛默飞世尔科技 ( 中国 ) 有限公司关键词蛋白质组深度鉴定, 小鼠肝组织, 蛋白提取液前言目前利用高分辨质谱仪能够对细胞的全蛋白质组进行深度覆盖, 鉴定细胞内接近全蛋白质组的蛋白数目 [1-3], 同时对于多种生物学过程中所涉及的翻译后修饰也能进行深度的鉴定和定量 [4]

1 AN_C_LCMSMS_1_201704Y 不同蛋白提取液对动物组织全蛋白质组鉴定的影响孙佳楠唐家澍赛默飞世尔科技 ( 中国 ) 有限公司关键词蛋白质组深度鉴定, 小鼠肝组织, 蛋白提取液前言目前利用高分辨质谱仪能够对细胞的全蛋白质组进行深度覆盖, 鉴定细胞内接近全蛋白质组的蛋白数目 [1-3], 同时对于多种生物学过程中所涉及的翻译后修饰也能进行深度的鉴定和定量 [4] 质谱仪的能力和样品前处理是影响实验结果的两大重要因素, 本文主要分析样品前处理过程中不同蛋白提取液对动物组织全蛋白质组鉴定的影响细胞裂解和蛋白质提取一般采取机械和物理两种方法相结合传统的机械裂解如研磨反复冻融超声与溶液内剪切等对细胞进行破碎, 为了提高蛋白提取效率, 机械裂解的同时加入表面活性剂或变性剂, 破坏细胞及细胞器脂膜同时增加蛋白溶解度 [5] 常用的表面活性剂分为离子型两性离子型和非离子型三大类, 最常添加的非离子型表面活性剂有 Triton X-100 和 NP-40 二者可使蛋白质最小化变性 ; 离子型的表面活性剂 SDS, 可完全溶解细胞膜, 蛋白提取效率最高, 但蛋白质完全变性失活常用的蛋白变性剂如尿素和盐酸胍, 能够断裂蛋白氢键, 使蛋白发生不同程度的变性, 同时增大疏水氨基酸残基在水相中的溶解度因此根据实验目的样品类型以及样品量选择合适的机械裂解与蛋白提取液, 将有助于提高蛋白质组研究的深度

6) 对灌流后的小鼠肝脏组织全蛋白质组鉴定的影响同时分析组织匀浆后结合探头超声对蛋白鉴定的影响实验方法 1.

2 本文工作分析 4 种不同蛋白提取液 SDT(2% SDS, 100 mm DTT,100 mm Tris-HCL, PH7.6) M-PER (ThermoFisher 哺乳动物细胞蛋白提取试剂盒, 专利去垢剂,25 mm bicine,ph7.6) T-PER (ThermoFisher 哺乳动物组织蛋白提取试剂盒, 专利去垢剂,25 mm bicine,150 mm sodium chloride, ph7.6) 以及 RIPA (50 mm Tris/HCl,150 mm NaCl,1% NP40,0.25% sodium deoxycholate,1 mm EDTA,pH7.6) 对灌流后的小鼠肝脏组织全蛋白质组鉴定的影响同时分析组织匀浆后结合探头超声对蛋白鉴定的影响实验方法 1. 样品处理分别使用 4 种不同蛋白提取液提取灌流后的小鼠肝脏全蛋白, 为保证蛋白酶解时酶的最佳活性, 因此需将蛋白样品中的去垢剂去除, 其中 SDT M-PER T-PER 采取 FASP 超滤方法去除 [6] RIPA 蛋白提取液中的 NP-40 在临界微团浓度 (CMC, critical micelle concentration) 以上时会形成分子量约为 90 kd 的聚合物微团, 不适合超滤法去除, 因此采用丙酮沉淀的方式去除去垢剂酶解后的肽段用高 PH 反相肽段预分级试剂盒 (P/N Thermo84868) 进行手工预分级, 实验设计及流程见图 1 A 小鼠灌流后的肝脏 B 分出 5 份, 每份 100 mg 500 ul PBS 初步匀浆 60 Hz,45s, 再加入 500 ul 2*SDT 提取液 4 度进行组织匀浆 (60 Hz,20s) 离心, 沸水浴 3 min 1 ml M-PER 1 ml T-PER1 1 ml T-PER2 1 ml RIPA 4 度进行组织匀浆 (60 Hz,40s) 4 度旋转孵育裂解约 10 min 再 4 度进行组织匀浆 (60 Hz,25s) 探头超声 40-50W 超声 5s, 间隔 5s, 一共 6 个 cycle 仅 T-PER2 温和超声仅 T-PER2 4 度旋转孵育裂解约 min 沸水浴 2 min g 离心 10 min 蛋白定量还原烷基化仅 RIPA 提取液丙酮沉淀蛋白定量还原烷基化合并成 6 个组分旋干 LC-MS/MS FASP 酶解溶液内酶解图 1. 不同蛋白提取液对样品处理流程 (A. 蛋白提取及酶解过程 ;B. 使用 Pierce High ph Reversed-Phase Peptide Fractionation Kit 对肽段进行分级过程 ) 注 : 由于 SDS 易产生泡沫不易去除, 因此 SDT buffer 实验时先采用 1*PBS 匀浆 ;M-PER 和 T-PER 均直接在裂解液中匀浆, 在裂解液中匀浆可直接变性蛋白, 使得蛋白质不易降解, 是更合适的选择另外只有 SDT buffer 需要加热, 因为 SDT buffer 中有 DTT, 高温更易打开二硫键, 而 T-PER,M-PER 中无还原剂, 加热意义不大 2. 色谱条件高效液相色谱仪 :EASY nlc1000(thermofisher Scientific) 分析柱 : 自制 C18 纳升级喷针柱, 长度 15 cm, 内径 75 µm, 粒径 3 µm 流动相 :A,0.1% 甲酸 / 水 ;B, 0.1% 甲酸 / 乙腈梯度 : 按照试剂盒说明共洗脱 8 个组分 ; 为了提高鉴定效率, 并且增加预分级方法和质谱前 Nano 液相分离的正交性将组分 1 与组分 7 合并, 组分 2 与组分 8 合并 ; 由于各个组分间肽段疏水性不同, 因此液相梯度稍有不同, 如表 1; 3-8%B 8-22%B 22-30%B 30-90%B 90-90%B F1+F7 F min min min min min F2+F min min min min min F4 F min min min min min F min min min min min 流速 :300 nl/min

3. 质谱采集方法质谱仪 :Q Exactive HF(ThermoFisher Scientific) 离子源 :Nanoflex; 离子极性 : 正离子 ; 喷雾电压 :2.

比较组织匀浆后探头超声对蛋白质组鉴定的影响经典的组织蛋白提取方法中为了将细胞裂解完全, 在匀浆沸水浴后再进行探头超声 [7], 我们因此比较使用 T-PER 裂解时探头超声对蛋白提取效果的影响为了减少整个实验过程其他因素的干扰, 所有步骤平行操作, 且在质谱鉴定时不同裂解液的同一组分依次被检测比较两组样品的 Protein

反相肽段预分级的效果如图 2B, 结果显示约有 62% 的肽段仅在一个组分中被鉴定到, 有着不错的分离效果, 且其分离效果与样品种类密切相关表 2.

103276 Search input 300995 304598 298519 295632 295708 A B T-PER_1 #Peptids(*1,000) T-PER_2 图 2A. 超声与非超声蛋白种类的覆盖度 ; 图 2B. 每条肽段在多少组分中被鉴定到以评价手工高 PH 反相试剂盒的分级效果 2.

3 3. 质谱采集方法质谱仪 :Q Exactive HF(ThermoFisher Scientific) 离子源 :Nanoflex; 离子极性 : 正离子 ; 喷雾电压 :2.0 kv; 离子传输管温度 :3000 C; S-Lense:60%; 分辨率 : 一级 60 k, 二级 30 k; AGC: 一级 3 e6 二级 1 e5; MaxIT: 一级 20 ms 二级 45 ms; 碰撞能量 :27%(NCE) 实验结果 1. 比较组织匀浆后探头超声对蛋白质组鉴定的影响经典的组织蛋白提取方法中为了将细胞裂解完全, 在匀浆沸水浴后再进行探头超声 [7], 我们因此比较使用 T-PER 裂解时探头超声对蛋白提取效果的影响为了减少整个实验过程其他因素的干扰, 所有步骤平行操作, 且在质谱鉴定时不同裂解液的同一组分依次被检测比较两组样品的 Protein Groups Peptide Groups PSM Search Input 的数目如表 2, 结果显示超声后对蛋白的鉴定有增加作用, 但增加数目有限二者鉴定蛋白种类的覆盖度达 84% 如图 2A, 具有高度的一致性因此综上所述, 对组织蛋白提取时, 组织匀浆后的探头内部超声对蛋白鉴定结果影响不大同时评估手工高 PH 反相肽段预分级的效果如图 2B, 结果显示约有 62% 的肽段仅在一个组分中被鉴定到, 有着不错的分离效果, 且其分离效果与样品种类密切相关表 2. 不同裂解液蛋白鉴定结果统计 SDT RIPA M-PER T-Per 非超声 T-Per 超声 Protein Groups Peptide Groups PSM Search input A B T-PER_1 #Peptids(*1,000) T-PER_2 图 2A. 超声与非超声蛋白种类的覆盖度 ; 图 2B. 每条肽段在多少组分中被鉴定到以评价手工高 PH 反相试剂盒的分级效果 2. 比较不同蛋白提取液对全蛋白质组鉴定的影响不同蛋白提取液鉴定结果 ( 表 2) 显示,SDT 的蛋白鉴定结果整体好于其他蛋白提取液不同提取液鉴定蛋白种类的覆盖度如图 3, 不同提取液间有一定的互补性 ; 并对鉴定到的蛋白进行亚细胞成分定位 (GO 功能分析 ) 如表 3 所示,SDT 提取组织全蛋白时, 对任意亚细胞成分蛋白的提取效果都好于其他裂解液或水平相当但值得注意的是 SDT 虽然具有很好的全蛋白提取效果, 但由于其含有强去垢剂 SDS, 使蛋白变性失活, 因此 SDT 蛋白提取液不适用于后续做与活性相关的实验, 如免疫共沉淀 ; 而其他几种则是较温和的蛋白提取液,M-PER T-PER 中都含有特殊去垢剂, 同样会使得蛋白质变性, 不能用于 Co-IP 和酶活性实验本次实验中的 RIPA 蛋白提取液含有 NP40 主要能溶解细胞膜, 但对核膜溶解能力有限 ; 此外脱氧胆酸

钠可溶解核膜, 但会使得蛋白质在一定程度上变性, 因此如果准备做胞浆蛋白的 Co-IP, 蛋白提取液不能加入脱氧胆酸钠 ; 如果准备做细胞核蛋白质的相互作用, 那么需要优化 buffer 体系中脱氧胆酸钠的含量, 溶解核膜和维持蛋白质 complex native 状态是天平的两端, 需要针对不同的实验要求来优化, 总而言之,

4 钠可溶解核膜, 但会使得蛋白质在一定程度上变性, 因此如果准备做胞浆蛋白的 Co-IP, 蛋白提取液不能加入脱氧胆酸钠 ; 如果准备做细胞核蛋白质的相互作用, 那么需要优化 buffer 体系中脱氧胆酸钠的含量, 溶解核膜和维持蛋白质 complex native 状态是天平的两端, 需要针对不同的实验要求来优化, 总而言之, 研究细胞核蛋白质的相互作用是当前生物化学和蛋白质组学研究中比较有挑战性的课题表 3. 蛋白亚细胞成分定位图 3. 不同蛋白提取液鉴定蛋白种类的覆盖度 SDT M-PER RIPA T-PER_1 T-PER_2 extracellular matrix protein cytoskeletal protein transporter transmembrane receptor regulatory/adaptor protein transferase oxidoreductase lyase cell adhesion molecule ligase nucleic acid binding signaling molecule enzyme modulator calcium-binding protein defense/immunity protein hydrolase transfer/carrier protein membrane traffic protein transcription factor chaperone cell junction protein structural protein storage protein isomerase receptor

讨论通过这部分工作的摸索, 我们得知对于 SDT 裂解液裂解细胞或组织时我们会采用探头超声来进一步促进细胞破碎, 并且打断 DNA 来降低样品粘度而对于 M-PER,T-PER, RIPA 等裂解液, 我们发现探头超声对蛋白质鉴定数量的提高很有限, 并且此时我们需要采用非常温和的超声条件, 以免蛋白质变性后产生大量絮状沉淀四种全蛋白提取液中,SDT 的提取效果最好,

在进行各种各样纷繁复杂的蛋白质组学实验时, 我们需要根据我们具体的实验目的来选择合适的裂解液和裂解方法, 才能保证我们后续实验顺利进行, 并且获得可信的结果参考文献 : [1] Wilhelm M, Schlegl J, Hahne H, et al. Massspectrometry-based draft of the human proteome.[j].

5 讨论通过这部分工作的摸索, 我们得知对于 SDT 裂解液裂解细胞或组织时我们会采用探头超声来进一步促进细胞破碎, 并且打断 DNA 来降低样品粘度而对于 M-PER,T-PER, RIPA 等裂解液, 我们发现探头超声对蛋白质鉴定数量的提高很有限, 并且此时我们需要采用非常温和的超声条件, 以免蛋白质变性后产生大量絮状沉淀四种全蛋白提取液中,SDT 的提取效果最好, 但不适用于下游活性蛋白相关实验在进行蛋白质浓度测定时由于 SDT 裂解液中含有 SDS 和 DTT, 因此 Bradford 法和 BCA 方法不适用, 而应选择去垢剂和还原剂均兼容的荧光法测定蛋白质浓度各种裂解液中含有的去垢剂均会影响胰蛋白酶活性, 并且对质谱分析产生很大影响, 因此均需要在蛋白质样品酶解前除去不同的去垢剂也均有不同的去除方法, 包括常用的超滤和丙酮沉淀等在进行各种各样纷繁复杂的蛋白质组学实验时, 我们需要根据我们具体的实验目的来选择合适的裂解液和裂解方法, 才能保证我们后续实验顺利进行, 并且获得可信的结果参考文献 : [1] Wilhelm M, Schlegl J, Hahne H, et al. Massspectrometry-based draft of the human proteome.[j]. Nature, 2014, 509(7502):582. [2] Kim M S, Pinto S M, Getnet D, et al. A draft map of the human proteome.[j]. Nature, 2014, 509(7502): [3] Feng Z, Yu L, Ficarro S B, et al. Genome-scale Proteome Quantification by DEEP SEQ Mass Spectrometry[J]. Nature Communications, 2013, 4(3):2171. [4] Bantscheff M, Hopf C, Kruse U, et al. Proteomicsbased strategies in kinase drug discovery.[j]. Ernst Schering Foundation Symposium Proceedings, 2007, 2007/3(3):1. [5] Garavito R M, Ferguson-Miller S. Detergents as tools in membrane biochemistry.[j]. Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(35): [6] Wiśniewski JR, Zougman A, Nagaraj N, et al. Universal sample preparation method for proteome analysis.[j]. Nature Methods, 2009, 6(5): [7] Jacek R. Wiśniewski, Nagarjuna Nagaraj, Alexandre Zougman, et al. Brain phosphoproteome obtained by a FASP-based method reveals plasma membrane protein topology.[j]. Journal of Proteome Research, 2010, 9(6):3280. Orbitrap 组学俱乐部赛默飞小分子质谱应用技术群赛默飞世尔科技 ( 中国 ) 有限公司全国服务热线 : ( 支持手机用户 )

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兽医临床诊断学实验指导兽医临床诊断学实验指导河北科技师范学院动物科学系临床兽医学实验室 2009 年 2 月目录学生实验守则... 3 实习一动物的接近保定和基本检查法...4 实习二临床基本检查法及一般检查...10 实习三循环系统的临床检查...15 实习四