2 2.3 质谱方法质谱仪 :Orbitrap Fusion 高分辨质谱仪扫描模式 :Top-Speed,cycle time 3 s, 动态排除 60 s 一级扫描 : 质量分析器 Orbitrap, 扫描范围 m/z , 分辨率 120K, 最大注入时间 50 ms,agc 2e

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1 Orbitrap Fusion 三合一 质谱在蛋白质组快速鉴定中的应用 张伟赛默飞世尔科技 ( 中国 ) 有限公司 Application Notes CM 前言 Orbitrap Fusion 超高分辨质谱系统是世界上第一款 三合一 质谱, 该系统革命性地将四极杆 Q (Quadrupole) 静电场轨 道阱 OT (Orbitrap) 线性离子阱 LTQ (Linear Ion Trap) 三种质量 分析器集为一体, 并利用创新的动态扫描管理技术实现 三种质量分析器的同时工作并相互协作, 一级 二级分 析同时进行, 达到最高分析效率 [1] Orbitrap Fusion 使蛋白质组学达到了史无前例的鉴定速度 和分析深度 整体运行速度, 包括离子注入 选择 稳 定 碎裂 扫描等全部过程,Orbitrap 可达 15Hz, 即每秒 可获得 15 张谱图,LTQ 可达 20Hz, 即每秒可获得 20 张 谱图 此外, 动态扫描管理技术采用了创新的 减一逻 辑, 即二级扫描与前次一级扫描相关联, 无需等待本 次一级扫描确定母离子及电荷, 实现一级二级平行运行 : 在 Orbitrap 进行一级扫描的同时, 四极杆与离子阱配合进 行二级扫描, 离子阱负责离子的碎裂和检测, 与此同时, 四极杆开始选择下一组离子进行下一个母离子的二级分析, 三种质量分析器同时运行 扫描速度和效率的提升为提高复杂样本的鉴定效率, 实现快速 高效的蛋白质组分析奠定基础 传统的蛋白质组学深度鉴定需要预分级 二维液相分离或者一维长梯度分离, 而本文使用 三合一 质谱 Orbitrap Fusion, 对 Hela 细胞和酵母细胞两种样本的全蛋白进行一维短梯度的 LC-MS/MS 鉴定, 实现快速蛋白质组分析 50 分钟有效梯度, 共从 1 μg Hela 全蛋白中鉴定到 条肽段, 对应到 3699 个非冗余蛋白 ;70 分钟有效梯度, 共从 1 μg 酵母全蛋白中鉴定到 条肽段, 对应到 2697 个非冗余蛋白 而同样的鉴定数量, 在前一代仪器上至少需要 2 倍的时间, Orbitrap Fusion 的分析效率提高了 2 倍以上 [2] 实验还比较了 Orbitrap Fusion 四种不同的扫描方式 2. 实验部分 2.1 样品信息 Hela 细胞和酵母细胞提取的全蛋白样品各一份 前处理使用二硫苏糖醇 (DTT) 碘乙酰胺(IAA) 对二硫键还原烷基化, 胰蛋白酶 (Trypsin) 酶解蛋白 样品最终稀释到 0.5 μg/μl 上样 2.2 纳流液相色谱方法色谱仪 : 纳流速超高效液相色谱 EASY-nLC 1000 色谱柱 : 纳流 C 18 色谱柱 EASY-Spray column (2 μm, 100 Å, 75 μm x 25 cm 或 75 μm x 50 cm) 上样量 :2 μl (1 μg) 流动相 :A: 0.1% 甲酸水溶液,B: 0.1% 甲酸乙腈溶液梯度如下 : (1) Hela(25 cm 色谱柱, 有效梯度 50 分钟,8%-35%) Time [mm:ss] Duration [mm:ss] Flow [nl/min] Mixture [%B] 00:00 00: :00 05: :00 10: :00 50: :00 10: :00 05: :00 10: (2) 酵母 (50 cm 色谱柱, 有效梯度 70 分钟,8%-30%) Time [mm:ss] Duration [mm:ss] Flow [nl/min] Mixture [%B] 00:00 00: :00 05: :00 55: :00 15: :00 05: :00 10:

2 2 2.3 质谱方法质谱仪 :Orbitrap Fusion 高分辨质谱仪扫描模式 :Top-Speed,cycle time 3 s, 动态排除 60 s 一级扫描 : 质量分析器 Orbitrap, 扫描范围 m/z , 分辨率 120K, 最大注入时间 50 ms,agc 2e5 二级扫描 : 离子选择 Quadrupole, 质量分析器 IonTrap, 扫描速度 Rapid, 最大注入时间 35 ms,agc 1e4, 碎裂模式 HCD 或 CID, 碎裂能量 35% 2.4 数据分析数据使用 Proteome Discoverer 1.4 软件搜库鉴定 搜索引擎 : SEQUEST HT; 数据库 :Uniprot 人和酵母蛋白数据库 ; 蛋白酶 :trypsin (full); 最大漏切位点 :2; 母离子质量精度 :10 ppm; 子离子质量精度 :0.6 Da; 固定修饰 :Carbamidomethyl (C Da); 可变修饰 :Acetyl (N-Terminus Da), Deamidated (N, Q Da),Oxidation (M Da) 搜库结 果使用 Percolator 卡值 同时, 使用 Preview 软件分析数据质量 3. 结果与讨论 3.1 Orbitrap Fusion 用于蛋白质组快速鉴定 Orbitrap Fusion 三合一结构的核心价值在于实现并列运行, 即三种质量分析器及离子通道相互配合, 同时工作, 尽可能减少扫描和循环间隙的等待时间 ( 图 1) 而多级离子通道 动态扫描管理 减一逻辑 等技术有效实现了大规模并列运行, 使仪器达到最快的分析速度和最高的分析效率 对复杂样本的蛋白质组分析而言, 传统方法需要进行在线二维或离线分级的方式简化样品, 或者采用超长梯度进行一维分析, 这样不仅操作费力, 也要消耗大量的时间 随着质谱速度的不断提升, 特别是 Orbitrap Fusion 技术的发展, 使得在短时间内实现复杂样本的蛋白质组深度鉴定成为现实 图 1. Orbitrap Fusion 仪器结构与并列运行原理 Orbitrap 一级全扫描的同时, 四极杆依次进行 10 个母离子选择, 离子阱依次进行 10 个母离子的二级扫描, 三者同时运行 同时, 三合一结构使得 Orbitrap Fusion 相比前一代仪器有着更加灵活多样的扫描方式 例如,CID/HCD/ETD 可以在任意一级使用, 也可以任意使用 Orbitrap 或离子阱检测, 从而产生多种组合的扫描方式 ;Top-speed 模式相比传统 Top-N 模式更能保证扫描点数 ;DDA 也不仅限于强度排列, 还可以根据电荷数排列和 m/z 排列, 更有利于 ETD 碎裂 具体 实验中, 可以根据样本的特点灵活多样地选择扫描方式 本实验对 1 μg Hela 全蛋白 (25 cm 色谱柱 ) 进行 OT-CID-IT 扫描, 即一级 Orbitrap 二级离子阱扫描, 采用 CID 碎裂 ; 对 1 μg 酵母全蛋白 (50 cm 色谱柱 ) 进行 OT-HCD-IT 扫描, 即一级 Orbitrap 二级离子阱扫描, 采用 HCD 碎裂 图 2 展示了两种样本在有效出峰时间内的 LC-MS/MS 总离子流图

3 3 图 2. Hela 和酵母全蛋白分析 LC-MS/MS 总离子流图 将 Hela 总离子流图中 RT min 处放大 ( 图 3), 可以看出, 仅 0.2 分钟的窗口就采集到超过 20 张一级谱图, 近 200 张 二级谱图, 相比前一代仪器, 扫描速度有了极大的提升 另外, 使用 Top-Speed 模式, 在 3 秒循环周期内尽可能多 地采集了二级谱图, 同时也保证了一级扫描点数, 有利于 同时定性定量 图 3. Hela 样本 RT min LC-MS/MS 放大图

4 4 最终,Hela 样本在 50 分钟有效梯度内共获得 张谱图, 平均每个循环获得 12.8 张二级谱图 ; 酵母样本在 70 分钟 有效梯度内共获得 张谱图, 平均每个循环获得 6.9 张二级谱图 ( 表 1), 印证了 Orbitrap Fusion 的扫描速度和 表 1. 有效梯度时间内采集的谱图数分析 运行效率 值得注意的是, 与酵母样本相比,Hela 样本每 个循环获得的二级谱图明显更多, 这主要是因为 Hela 比 酵母更为复杂, 存在更多的肽段和蛋白 样本 有效梯度 时间范围 扫描方式 一级谱图数 二级谱图数 总谱图数 Hela 50 min min OT-CID-IT 酵母 70 min min OT-HCD-IT 上述数据展示了 Orbitrap Fusion 在扫描速度和分析效率方面 的突出性能, 相比前一代仪器优势明显 3.2 全蛋白鉴定结果分析上述数据使用 SEQUEST HT 搜库鉴定和 Percolator 卡值, 鉴定结果如表 2 所示 结果表明, 仅 50 和 70 分钟有效梯度, 分别从 1 μg Hela 和酵母全蛋白中鉴定到 和 条肽段 (1%FDR), 分别对应到 3699 和 2697 个非冗余蛋白, 而同样的数量, 在前一代仪器上需要 2-3 小时 [2] 其中, 在有效梯度内鉴定到的肽段和蛋白占到总数的 95% 以上, 谱图鉴定率在 42%-55%, 表明仪器采集数据质量好, 鉴定效率高 表 2. Hela 和酵母全蛋白鉴定结果 样本 FDR 总蛋白数 有效梯度内蛋白数 总肽段数 有效梯度内肽段数 总 PSM 有效梯度内 PSM 有效梯度谱图鉴定率 Hela 1% % 5% % 酵母 1% % 5% % 以两种样本中共同鉴定到的肽段 ATAGDTHLGGEDFDNR 谱图为例 ( 图 4),Hela 和酵母分别使用 CID 和 HCD 碎裂, 从谱图可以看出, 两者均得到丰富的碎片信息, 碎裂效果相当 但两者有着各自的特点,HCD 在多极离子通道进行, 有效克服了 CID 的三分之一效应, 使得低分子量端信息没有丢失, 同时速度比 CID 快 5% 而 CID 灵敏度更高, 对低丰度肽段碎裂效果更好, 鉴定成功率更高 使用 Preview 软件对数据质量进行分析 结果如图 5 所示, Hela 样本母离子 (m/z) 质量精度平均为 0 ppm, 子离子质量精度 (m/z) 平均为 Da; 酵母样本母离子 (m/z) 质量精度平均为 1 ppm, 子离子质量精度 (m/z) 平均为 Da 结果表明,Orbitrap 具有超高质量精度, 并且质量轴能够长期保持稳定 离子阱的质量精度也较为理想, 绝大部分离子的偏差都保持在 ±0.15 Da 之内 数据搜库与解析结果表明,Orbitrap Fusion 在复杂全蛋白样本快速鉴定方面具有出色性能, 相比前一代质谱平台, 分析效率有了一倍的提升 图 4. 肽段 ATAGDTHLGGEDFDNR 在两种样本中的二级谱图及鉴定结果

5 5 图 5. 样本一级 二级质量精度 Preview 分析结果 3.3 不同扫描方式对比具有灵活多样的扫描组合方式是 Orbitrap Fusion 的优势之一, 包括可以使用 CID HCD ETD DDDT 等不同的碎裂模式, 可以使用 Orbitrap 或离子阱扫描检测, 可任意选择碎裂和检测模式进行 MS n 分析, 可同时选择多个二级离子进行三级定量分析 (SPS 技术 ) 等 本实验考察了蛋白质组学最常用的扫描方式 :OT-HCD-IT OT-CID-IT OT-HCD-OT OT-CID- OT, 使用这 4 种扫描方式对酵母全蛋白进行 60 分钟有效梯度的数据采集, 并对鉴定结果进行了分析 比较 图 6 比较了 4 种扫描方式在蛋白鉴定数量 肽段鉴定数 量 PSM 数量 谱图数 谱图鉴定率五方面的差异, 并以 OT-HCD-IT 结果作为 100% 进行归一化 结果表明,OT- HCD-IT 由于速度最快, 因为获得的谱图数和鉴定数最多 ; OT-CID-IT 相比前者扫描速度略慢 5%, 因此获得的结果略少, 谱图数和蛋白鉴定数约是前者的 95%;OT-HCD-OT 与 Q-Exactive 质谱的扫描方式相同, 由于无法实现一级二级的同时运行, 谱图数和蛋白鉴定数分别是 OT-HCD-IT 的 70% 和 85%;OT-CID-OT 速度最慢, 谱图数和蛋白鉴定数分别是 OT-HCD-IT 的 60% 和 75% 此外,4 种扫描方式的谱图鉴定率相差不大, 表明数据质量没有明显差异 图 6. 不同扫描方式结果比较 ( 以 OT-HCD-IT 结果为 100%)

6 与 HCD 相比,CID 虽然速度略慢且有三分之一效应, 但灵敏度更高, 更适合于低丰度蛋白和少量样本的分析 二级 Orbitrap 检测常用于定量蛋白质组学研究,TMT/ itraq 标记定量 PRM 定量都要用到二级高分辨率 高质量精度 4 种扫描方式有着各自的特点, 适用于不同的应用方向, 根据实验目的不同选择合适的扫描方式非常重要 4. 结论本文使用 三合一 质谱 Orbitrap Fusion, 对 1 μg Hela 和酵母样本进行了蛋白质组快速鉴定 50 分钟和 70 分钟有效梯度, 分别从 Hela 和酵母中鉴定到 条肽段, 分别对应到 个非冗余蛋白 实验还比较了 4 种常见的扫描组合方式, 显示了各种扫描方式的特点和适用方向 实验结果证明, 无论是扫描速度 分析效率 数据质量还是仪器的可操控性,Orbitrap Fusion 相比前一代质谱平台都有了较大突破 参考文献 : [1] [2] Kelstrup, C. D.; Young, C.; Lavallee, R.; Nielsen, M. L.; Olsen, J. V. Optimized Fast and Sensitive Acquisition Methods for Shotgun Proteomics on a Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer [J]. J. Proteome Res. 2012, 11 (6): Application Notes CM0092 赛默飞世尔科技 ( 中国 ) 有限公司 免费服务热线 : ( 支持手机用户 ) AN_CM0092

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