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远锡邴
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1 - ( 征求意见稿 ) 1 范围本方法规定了面膜类化妆品中氟轻松的超高效液相色谱 - 串联质谱测定方法本方法适用于面膜类化妆品中氟轻松的定性定量测定 2 方法提要面膜类化妆品用饱和氯化钠溶液分散, 用乙腈从分散液中提取氟轻松, 用亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀提取液中大分子基质, 经固相萃取小柱净化, 用超高效液相色谱仪分离, 质谱检测器检测, 采用保留时间和特征离子对丰度比定性, 以待测物质相对应离子峰面积定量, 以标准曲线法计算含量本方法的检出限为 0.03 µg/g, 定量限为 0.05 µg/g 3 试剂和材料除另有规定外, 本方法所用试剂均为分析纯或以上规格, 水为纯化水 3.1 甲醇 : 色谱纯 3.2 乙腈 : 色谱纯 3.3 冰醋酸 : 优级纯 3.4 饱和氯化钠溶液 % 亚铁氰化钾溶液 : 称取 115 g 亚铁氰化钾 K 4 Fe(CN) 6 3H 2 O 固体, 用水溶解定容至 1000 ml % 乙酸锌溶液 : 称取 239 g 乙酸锌 C 4 H 6 O 4 Zn 2H 2 O 固体, 用水溶解定容至 1000 ml 3.7 Oasis HLB 固相萃取小柱或相当者 :60 mg,3 ml 3.8 标准物质 : 氟轻松, 纯度不小于 99.0%; 标准物质的分子式相对分子质量 CAS 登录号化学结构图参见附录 A 1

2 3.9 标准储备液 (ρ=1 g/l): 准确称取氟轻松标准物质 (3.8)10 mg, 精确到 0.01 mg, 置于 10 ml 量瓶中, 用甲醇溶解并定容, 于 -18 下冷冻保存 3.10 标准工作溶液 : 临用时, 取标准储备液 (3.9) 适量, 用乙腈稀释成 0.05 μg/ml 0.10 μg/ml 0.20 μg/ml 0.40 μg/ml 0.80 μg/ml 系列浓度的标准工作溶液 4 仪器和设备 4.1 超高效液相色谱 - 三重四极杆质谱联用仪 (ESI 源 ) 4.2 分析天平 : 感量 g; g 4.3 涡旋混合器 4.4 离心机 : 转速 5000 r/min, 容量 10 ml;50 ml 4.5 固相萃取装置 5 分析步骤 5.1 样品处理提取称取样品 ( 带有载体的面膜, 去除载体后取样 )0.2 g, 精确至 g, 置 15 ml 具塞离心管中, 加入 3 ml 饱和氯化钠溶液 (3.4), 于涡旋混合器上混合使样品分散, 准确加入 2 ml 乙腈, 充分涡旋提取 2 min, 以 5000 r/min 离心 10 min, 吸出上层清液置于另一 50 ml 具塞离心管中, 下层溶液用 2 ml 乙腈重复提取一次, 合并两次乙腈提取液, 向提取液中加入 40 ml 纯化水, 混匀, 加入 10% 亚铁氰化钾溶液 (3.5)0.2 ml, 混匀, 加入 20% 乙酸锌溶液 (3.6)0.2 ml, 混匀, 以 5000 r/min 离心 10 min, 取全部上清液待进行净化处理净化将 Oasis HLB 固相萃取小柱 (3.7) 接上固相萃取装置, 小柱预先依次用甲醇 5 ml 水 10 ml 进行活化将待净化的样品上清液 (5.1.1) 倒入漏斗, 经滤纸滤过后, 滤液流经小柱, 待样品溶液自然流尽后, 用 10% 乙腈水溶液 10 ml 清洗小柱, 待清洗液自然流尽后, 用吸球吹出小柱中的残留液在柱出口处接一 10 ml 具塞离心管, 用甲醇 4 ml 淋洗小柱, 待甲醇自然流尽后, 用吸球吹出小柱中的残留液取下离心管, 将接收的甲醇用氮气吹干, 用 50% 的甲醇水溶液 0.2 ml 重新溶解后测定 ( 或根据需要的浓度用 50% 的甲醇水溶液重新溶解定容后测定 ) 5.2 基质标准曲线溶液制备称取空白样品 5 份 ( 带有载体的面膜, 去除载体后取样 ), 每份 0.2 g, 精确到 g, 置 15 ml 具塞离心管中, 分别精密加入各浓度的标准工作溶液 (3.10)0.2 ml, 按样品处理 2

3 (5.2) 步骤操作, 将接收的甲醇用氮气吹干, 用 50% 的甲醇水溶液 0.2 ml 重新溶解后测定 5.3 色谱 - 质谱参考条件超高效液相色谱参考分析条件色谱柱 :SB C18,50 mm 2.1 mm( 内径 ),1.8 μm, 或相当者 ; 柱温 : 室温 ; 超高效液相色谱流动相及参考分离条件见表 2; 进样量 :5 μl 表 2 超高效液相色谱流动相及参考分离条件时间流速流动相 A 流动相 B / min / (ml/min) ( 水, 含 0.1% 醋酸 ) ( 乙腈, 含 0.1% 醋酸 ) % 32% % 32% % 75% % 75% % 32% % 32% 质谱检测参考条件电离方式 : 电喷雾电离,ESI(+) 离子喷雾电压 :4 kv; 雾化气 : 氮气,38 Psi; 干燥气 : 氮气, 流速 :12 L/min, 温度 :350 ; 碰撞气 : 氩气 ; 检测方式 : 多反应监测 (MRM) 氟轻松的质谱测定参考参数见表 3 表 3 氟轻松的质谱测定参考参数药物名称出峰时间相对分子质量母离子 ( 锥孔电压 ) 子离子 ( 碰撞能量 )* 337.2(13 ev) 氟轻松 3.84 min (117 V) 121.0(34 ev) *: 选择稳定且无干扰的子离子作为定量离子对 6 测定结果 6.1 定性判定在相同实验条件下测定基质标准曲线溶液和样品溶液, 如果样品溶液中检出的色谱峰的保留时间与标准溶液中的氟轻松峰的保留时间一致, 并且所选择的两对子离子的质荷比一致, 3

4 样品定性离子相对丰度与浓度相当标准工作溶液的定性溶液的定性离子的相对丰度进行比较时, 相对偏差不超过表 4 规定的范围, 则可判定样品中存在氟轻松表 4 定性判定时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度比 (k) k 50% 50%>k 20% 20%>k 10% k 10% 最大允许偏差 ±20% ±25% ±30% ±50% 6.2 定量测定相同实验条件下测定基质标准曲线溶液和样品溶液, 制作标准曲线, 样品中氟轻松的含量用标准曲线法定量, 按下式计算含量式中 : V D m ω 样品中氟轻松含量,μg /g; ρ 由标准曲线计算得到的样品溶液中氟轻松的浓度,μg/mL; V 样品定容体积,mL; m 样品取样量,g; D 稀释倍数 ( 不稀释则取 1) 4

5 附录 A ( 资料性附录 ) 氟轻松的英文名称分子式相对分子质量 CAS 登录号及化学结构图中文名称 : 氟轻松英文名称 :Fluocinolone Acetonide CAS 登录号 : 结构式 : 分子式 :C 24 H 30 F 2 O 6 分子量 :

6 附录 B ( 资料性附录 ) 氟轻松标准品溶液 MRM( ) 质谱图 ( 浓度 :0.20 μg/ml) 氟轻松 6

7 - 为加强面膜类化妆品中禁限用物质的监督管理, 确保面膜类化妆品质量安全, 2015 年 1 月, 北京市药品检验所开展了面膜类化妆品中氟轻松检测方法标准建立和验证工作, 现就起草工作有关情况说明如下 : 一起草的必要性糖皮质激素是由肾上腺皮质分泌的一种激素, 可以在短时间内产生强大的抗炎和抑制免疫反应, 可以使皮肤的毛细血管强烈收缩, 临床表现出的效果就是祛痘祛红美白等然而激素的作用治标不治本, 并且会抑制肌肤的新陈代谢, 久而久之会导致皮肤萎缩变薄毛细血管扩张色素斑炎性丘疹等典型的激素依赖性皮炎症状我国已明确规定面膜类化妆品中严禁添加各种糖皮质激素, 但仍有部分面膜类化妆品生产企业为追求经济利益, 不顾消费者的健康安全, 在生产过程中违法添加这类禁用物质目前, 面膜类化妆品中糖皮质激素的检测方法为 GB/T 化妆品中四十一种糖皮质激素的测定液相色谱 / 串联质谱法和薄层层析法, 检测成分不包括氟轻松氟轻松作为糖皮质激素在欧洲药典中有收载, 经 SFDA 数据库查询, 我国仅批准上市醋酸氟轻松, 未批准氟轻松上市部分面膜类化妆品生产企业为规避检查, 利用标准的盲点, 在其产品中添加氟轻松, 危害消费者的健康因此, 建立面膜类化妆品中氟轻松的检测方法具有紧迫性和现实意义本标准的制定宗旨是为面膜类化妆品中氟轻松的测定提供准确的实验方法, 有力的支撑未来市场面膜类化妆品的监管, 为面膜类化妆品中氟轻松的监测和风险评估提供参考依据二起草依据 ( 一 ) 化妆品卫生规范 2007 年版 ( 二 ) 化妆品中禁用物质和限用物质检测方法验证技术规范 ( 三 )GB/T 化妆品中四十一种糖皮质激素的测定液相色谱 / 串联质谱法和薄层层析法三起草原则 7

8 本检测方法兼具先进性准确性以及可操作性强的特点, 尽量采用目前化妆品检测实验室具备的先进分析技术, 选择准确可行便于实际操作的分析条件, 保证检测方法的精确性和重现性四起草过程 2014 年 12 月, 北京市药品检验所在某面膜类化妆品稽查查案检验中, 发现样品中含有现行标准 GB/T 中未包括的糖皮质激素氟轻松, 于是在 2015 年 1 月, 开始了面膜类化妆品中氟轻松检测方法标准建立和验证工作 2015 年 3 月, 中国食品药品检定研究院与山西省食品药品检验所对建立的面膜类化妆品中氟轻松检测方法进行了协同验证 2016 年 1 月, 国家食品药品监督管理总局药品化妆品监管司组织专家, 对建立的面膜类化妆品中氟轻松检测方法进行了论证, 专家一致认为该方法适用于作为标准化的检验方法之后, 根据论证会专家意见, 对材料进一步完善, 形成最终报批稿材料上报国家食品药品监督管理总局五重点说明的问题 ( 一 ) 关于体例本检测方法的体例主要参照现行 2007 年版化妆品卫生规范的卫生化学检验方法的体例, 便于化妆品检验领域相关检验人员的阅读和实际操作 ( 二 ) 关于氟轻松氟轻松作为糖皮质激素在欧洲药典中有收载, 经 SFDA 数据库查询, 我国未批准氟轻松上市在面膜类化妆品中添加氟轻松, 虽然短期内可能起到祛痘祛红美白等作用, 但会抑制肌肤的新陈代谢, 久而久之会导致皮肤萎缩变薄毛细血管扩张色素斑炎性丘疹等典型的激素依赖性皮炎症状我国已明确规定面膜类化妆品中严禁添加各种糖皮质激素 ( 三 ) 关于检测方法的建立和验证参照 GB/T , 最终建立了面膜类化妆品中氟轻松的超高效液相色谱 - 串联质谱检测方法方法验证表明, 本研究所建立的面膜类化妆品中氟轻松的检测方法专属性强, 在 0.05 µg/ml~0.8 µg/ml 浓度范围内线性关系良好 ( 相关系数大于 0.99), 检出浓度为 0.03 µg/g, 最低定量浓度为 0.05 µg/g, 高中低三个浓度水平的方法 8

9 回收率平均值在 97.3%~108.6% 之间, 日内精密度在 0.7~5.0% 之间 (n=6), 日间精密度在 4.1~9.0% 之间 (n=3), 日内稳定性日间稳定性符合要求上述结果表明, 所建立方法满足相关技术要求, 可以作为面膜类化妆品中氟轻松的检测方法两家实验室协同验证结果表明, 回收率精密度标准曲线均符合要求, 验证了所建立方法可以作为面膜类化妆品中氟轻松的检测方法 9

10 - 1 研究背景糖皮质激素是由肾上腺皮质分泌的一种激素, 可以在短时间内产生强大的抗炎和抑制免疫反应, 可以使皮肤的毛细血管强烈收缩, 临床表现出的效果就是祛痘祛红美白等然而激素的作用治标不治本, 并且会抑制肌肤的新陈代谢, 久而久之会导致皮肤萎缩变薄毛细血管扩张色素斑炎性丘疹等典型的激素依赖性皮炎症状我国已明确规定面膜类化妆品中严禁添加各种糖皮质激素, 但仍有部分面膜类化妆品生产企业为追求经济利益, 不顾消费者的健康安全, 在生产过程中违法添加这类禁用物质目前, 面膜类化妆品中糖皮质激素的检测方法为 GB/T 化妆品中四十一种糖皮质激素的测定液相色谱 / 串联质谱法和薄层层析法, 检测成分不包括氟轻松氟轻松作为糖皮质激素在欧洲药典中有收载, 经 SFDA 数据库查询, 我国仅批准上市醋酸氟轻松, 未批准氟轻松上市而部分面膜类化妆品生产企业为规避检查, 利用标准的盲点, 在其产品中添加氟轻松, 危害消费者的健康因此, 建立面膜类化妆品中氟轻松的检测方法具有紧迫性和现实意义本标准的制定宗旨是为面膜类化妆品中氟轻松的测定提供准确的实验方法, 有力的支撑未来市场面膜类化妆品的监管, 为面膜类化妆品中氟轻松的监测和风险评估提供参考依据 2 氟轻松信息 2.1 中文名称 : 氟轻松 2.2 英文名称 :Fluocinolone Acetonide 2.3 CAS 号 : 分子式 :C 24 H 30 F 2 O 分子量 : 结构式 : 10

11 3 方法提要面膜类化妆品用饱和氯化钠溶液分散, 用乙腈从分散液中提取氟轻松, 用亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀提取液中大分子基质, 经固相萃取小柱净化, 用超高效液相色谱仪分离, 质谱检测器检测, 采用保留时间和特征离子对丰度比定性, 以待测物质相对应离子峰面积定量, 以标准曲线法计算含量本方法的检出限为 0.03 µg/g, 定量限为 0.05 µg/g 4 材料与方法 4.1 实验材料仪器美国 Thermo 公司 TSQ VANTAGE 超高效液相色谱 - 三重四极杆质谱联用仪 (ESI 源 ) 对照品氟轻松 (FluocinoloneAcetonide), USP 对照品, 纯度 99.7% 试剂氯化钠亚铁氰化钾乙酸锌均为分析纯试剂 ; 冰醋酸为优级纯试剂 ; 甲醇乙腈均为色谱纯试剂 ; 水为纯净水 10% 亚铁氰化钾溶液 : 称取亚铁氰化钾 (K 4 Fe(CN) 6 3H 2 O)115 g, 加水溶解并稀释至 1000 ml 20% 乙酸锌溶液 : 称取乙酸锌 (C 4 H 6 O 4 Zn 2H 2 O)239 g, 加水溶解并稀释至 1000 ml 固相萃取小柱 Waters 公司 Oasis HLB 固相萃取小柱,60 mg,3 ml 4.2 实验方法超高效液相色谱条件 11

12 色谱柱 :Agilent ZORBAX SB C18(2.1mm 50mm,1.8μm); 流动相 :A: 水, 含 0.1% 乙酸 ;B: 乙腈, 含 0.1% 乙酸 ; 洗脱程序见表 1; 表 1 梯度洗脱程序时间 (min) 流动相 A 流动相 B 0 68% 32% 3 68% 32% 12 25% 75% 14 25% 75% % 32% 16 68% 32% 流速 :0.3 ml/min; 柱温 : 室温 ; 进样量 :5 μl 质谱条件离子源 : 电喷雾离子源 (ESI 源 ); 喷雾电压 :4 kv; 检测方式 : 正离子检测 ; 鞘气 : 氮气, 流速 40 arb; 辅助气 : 氮气, 流速 10 arb; 毛细管温度 :350 ; 碰撞气 : 氩气 ; 扫描方式 : 选择反应监测 ; 锥孔电压 :117 V; 离子对及碰撞能量 : ,CE=13 ev; ,CE=34 ev 对照品溶液的制备精密称取氟轻松对照品 10 mg, 置 100 ml 量瓶中, 加甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀, 精密量取 5 ml, 置 50 ml 量瓶中, 加乙腈溶解并稀释至刻度, 摇匀, 作为对照品溶液储备液 ( 浓度为 10 μg/ml) 量取对照品溶液储备液, 按表 2 中所述步骤, 用乙腈稀释制成浓度分别为 12

13 0.05 μg/ml 0.08 μg/ml 0.1 μg/ml 0.2 μg/ml 0.4 μg/ml 0.6 μg/ml 0.8 μg/ml 的系列浓度对照品溶液表 2 对照品溶液稀释步骤编号操作步骤浓度 1 量取对照品溶液储备液 2 ml 25 ml 0.8 μg/ml 2 量取对照品溶液储备液 2 ml 50 ml 0.4 μg/ml 3 量取对照品溶液储备液 2 ml 100 ml 0.2 μg/ml 4 量取对照品溶液储备液 1 ml 100 ml 0.1 μg/ml 5 量取对照品溶液 4 5 ml 10 ml 0.05 μg/ml 6 量取对照品溶液储备液 3 ml 50 ml 0.6 μg/ml 7 量取对照品溶液 2 5 ml 25 ml 0.08 μg/ml 8 量取对照品溶液 4 3 ml 10 ml 0.03μg/mL 供试品溶液的制备称取样品 ( 带有载体的面膜, 去除载体后取样 )0.2 g, 置 15 ml 具塞离心管中, 加入饱和氯化钠溶液 3 ml, 涡旋振荡使样品分散, 加入乙腈 2 ml, 涡旋 2 min, 以 5000 r/min 离心 10 min, 吸出上层清液置于另一 50 ml 具塞离心管中, 下层溶液用 2 ml 乙腈重复提取一次, 合并两次乙腈提取液, 向提取液中加入水 40 ml, 混匀, 加入 10% 亚铁氰化钾溶液 0.2 ml, 混匀, 加入 20% 乙酸锌溶液 0.2 ml, 混匀, 以 5000 r/min 离心 10 min, 取全部上清液进行固相萃取小柱净化将固相萃取小柱接上固相萃取装置, 小柱预先依次用甲醇 5 ml 水 10 ml 进行活化将待净化的上清液倒入漏斗滤过, 滤液流经小柱, 待样品溶液自然流尽后, 用 10% 的乙腈水溶液 10 ml 清洗小柱, 待清洗液自然流尽后, 用吸球吹出小柱中的残留液在柱出口处接一 10 ml 具塞离心管, 用甲醇 4 ml 淋洗小柱, 待甲醇自然流尽后, 用吸球吹出小柱中的残留液将接收的 4 ml 甲醇用氮气吹干, 精密加入 50% 的甲醇水溶液 0.2 ml, 涡旋 30 s, 作为供试品溶液 5 实验室内方法验证 5.1 特异性取液态空白样品固态空白样品和半固态空白样品各 0.2 g, 按项下方法操作, 所得溶液按和项下条件进行 HPLC-MS 分析, 得 13

14 到液态空白样品色谱图固态空白样品色谱图和半固态空白样品色谱图取液态空白样品固态空白样品和半固态空白样品各 0.2 g, 分别精密加入对照品溶液 3 各 0.2 ml, 按项下方法操作, 所得溶液按和项下条件进行 HPLC-MS 分析, 得到液态空白样品加标色谱图固态空白样品加标色谱图和半固态空白样品加标色谱图空白样品色谱图见图 1 空白样品加标色谱图见图 2, 结果表明, 三种空白基质中的共存物质对氟轻松的测定均无干扰, 方法特异性良好图 1 空白样品色谱图 A 液态基质 B 固态基质 C 半固态基质图 2 空白样品加标色谱图 A 液态基质 B 固态基质 C 半固态基质 14

15 5.2 线性和范围量取对照品溶液储备液, 按表 2 中所述步骤, 用 40% 乙腈稀释制成浓度分别为 0.05 μg/ml 0.1 μg/ml 0.2 μg/ml 0.4 μg/ml 0.8 μg/ml 的系列浓度对照品溶液, 按和项下条件进行 HPLC-MS 分析, 记录色谱图, 分别测定氟轻松峰面积以氟轻松峰面积为纵坐标, 溶液中氟轻松实际浓度为横坐标, 进行线性回归计算, 得到溶液标准曲线的线性方程和相关系数取液态空白样品 5 份, 每份 0.2 g, 分别精密加入对照品溶液 1 对照品溶液 2 对照品溶液 3 对照品溶液 4 和对照品溶液 5 各 0.2 ml, 按项下方法操作, 所得溶液按和项下条件进行 HPLC-MS 分析, 记录色谱图, 分别测定氟轻松峰面积以氟轻松峰面积为纵坐标, 溶液中氟轻松实际浓度为横坐标, 进行线性回归计算, 得到液态基质标准曲线的线性方程和相关系数取固态空白样品 5 份, 每份 0.2 g, 分别精密加入对照品溶液 1 对照品溶液 2 对照品溶液 3 对照品溶液 4 和对照品溶液 5 各 0.2 ml, 按项下方法操作, 所得溶液按和项下条件进行 HPLC-MS 分析, 记录色谱图, 分别测定氟轻松峰面积以氟轻松峰面积为纵坐标, 溶液中氟轻松实际浓度为横坐标, 进行线性回归计算, 得到固态基质标准曲线的线性方程和相关系数取半固态空白样品 5 份, 每份 0.2 g, 分别精密加入对照品溶液 1 对照品溶液 2 对照品溶液 3 对照品溶液 4 和对照品溶液 5 各 0.2 ml, 按项下方法操作, 所得溶液按和项下条件进行 HPLC-MS 分析, 记录色谱图, 分别测定氟轻松峰面积以氟轻松峰面积为纵坐标, 溶液中氟轻松实际浓度为横坐标, 进行线性回归计算, 得到半固态基质标准曲线的线性方程和相关系数溶液标准曲线液态基质标准曲线固态基质标准曲线和半固态基质标准曲线的线性方程和相关系数见表 3, 结果表明, 氟轻松在 0.05 µg/ml~0.8 µg/ml 浓度范围内线性关系良好 15

16 表 3 线性和范围测定结果标准曲线线性方程相关系数线性范围溶液标准曲线 y = x µg/ml~0.8 µg/ml 液态基质标准曲线 y = x µg/ml~0.8 µg/ml 固态基质标准曲线 y = x µg/ml~0.8 µg/ml 半固态基质标准曲线 y = x µg/ml~0.8 µg/ml 5.3 检出限和定量下限取对照品溶液储备液, 逐级稀释, 所得溶液按和项下条件进行 HPLC-MS 分析, 记录色谱图, 分别计算氟轻松色谱峰信噪比当氟轻松的浓度为 0.03 µg/ml 时, 氟轻松色谱峰信噪比约为 3:1, 因此方法的检出限为 0.15 ng; 当氟轻松的浓度为 0.05 µg/ml 时, 氟轻松色谱峰信噪比约为 10:1, 因此方法的定量下限为 0.25 ng 5.4 检出浓度取液态空白样品固态空白样品和半固态空白样品各 0.2 g, 分别精密加入浓度为 0.03 µg/ml 的对照品溶液各 0.2 ml, 按项下方法操作, 所得溶液按和项下条件进行 HPLC-MS 分析, 记录色谱图在三种基质中, 氟轻松浓度为 0.03 µg/g 的色谱图中氟轻松色谱峰信噪比均约为 3:1, 因此方法的检出浓度为 0.03 µg/g 5.5 最低定量浓度取液态空白样品固态空白样品和半固态空白样品各 0.2 g, 分别精密加入浓度为 0.05 µg/ml 的对照品溶液各 0.2 ml, 平行制备 3 份, 按项下方法操作, 所得溶液按和项下条件进行 HPLC-MS 分析, 记录色谱图, 分别测定氟轻松峰面积, 代入各基质标准曲线方程, 求得实测浓度, 计算方法回收率和相对标准偏差 RSD 三种基质中各样品溶液测得的结果见表 4, 结果显示, 三种基质中, 方法回收率均在 80%~120% 之间,RSD 均未超过 5%, 并且各样品色谱图中氟轻松色谱峰信噪比均约为 10:1, 因此方法的最低定量浓度为 0.05 µg/g 16

17 表 4 最低定量浓度测定结果基质加入浓度实测浓度平均值方法回收率平均值 RSD 液态固态半固态精密度取液态空白样品固态空白样品和半固态空白样品各 0.2 g, 分别精密加入浓度为 0.08 µg/ml 0.2 µg/ml 和 0.6 µg/ml 的对照品溶液各 0.2 ml, 按项下方法操作, 所得溶液按和项下条件进行 HPLC-MS 分析, 重复测定 6 次, 记录色谱图, 分别测定氟轻松峰面积, 计算各峰面积的平均值和相对标准偏差 RSD, 考察日内精密度 ; 另于第二天和第三天分别重复测定 6 次, 记录色谱图, 分别测定氟轻松峰面积, 计算不同日测得各峰面积平均值的相对标准偏差 RSD, 考察日间精密度三种基质中各浓度水平溶液的精密度测定结果见表 5, 结果显示, 三种基质中, 三个浓度水平的日内精密度和日间精密度均未超过 10%, 表明方法可重现表 5 精密度测定结果基质浓度水平日内精密度 RSD 日间精密度 RSD 液态固态半固态回收率 17

18 取液态空白样品固态空白样品和半固态空白样品各 0.2 g, 分别精密加入浓度为 0.08 µg/ml 0.2 µg/ml 和 0.6 µg/ml 的对照品溶液各 0.2 ml, 每个浓度各制备 3 份, 按项下方法操作, 所得溶液按和项下条件进行 HPLC-MS 分析, 记录色谱图, 分别测定氟轻松峰面积, 代入溶液标准曲线方程, 求得实测浓度, 计算提取回收率和相对标准偏差 RSD; 另代入各基质标准曲线方程, 求得实测浓度, 计算方法回收率和相对标准偏差 RSD 三种基质中各浓度水平溶液的提取回收率测定结果见表 6, 结果显示, 三种基质中, 三个浓度水平的提取回收率平均值均小于 85%,RSD 均未超过 10% 表 6 提取回收率测定结果基质加入浓度实测浓度平均值提取回收率平均值 RSD 液态固态半固态三种基质中各浓度水平溶液的方法回收率测定结果见表 7, 结果显示, 三种基质中, 三个浓度水平的方法回收率平均值均在 85%~115% 之间,RSD 均未超过 10% 18

19 表 7 方法回收率测定结果基质加入浓度实测浓度平均值方法回收率平均值 RSD 液态固态半固态综上, 方法的提取回收率结果较低, 三种基质中三个浓度水平的结果均小于 85%, 而方法的方法回收率结果较好, 三种基质中三个浓度水平的结果均在 85%~115% 之间, 表明采用基质标准曲线进行定量测定时结果准确 5.8 稳定性取液态空白样品固态空白样品和半固态空白样品各 0.2 g, 分别精密加入浓度为 0.08 µg/ml 0.2 µg/ml 和 0.6 µg/ml 的对照品溶液各 0.2 ml, 按项下方法操作, 所得溶液按和项下条件分别于第小时进行 HPLC-MS 分析, 记录色谱图, 分别测定氟轻松峰面积, 代入各基质标准曲线方程, 求得实测浓度, 计算回收率和相对标准偏差 RSD, 考察日内稳定性 ; 另分别于第 48 和 72 小时进行 HPLC-MS 分析, 记录色谱图, 分别测定氟轻松峰面积, 代入各基质标准曲线方程, 求得实测浓度, 计算回收率, 并计算小时回收率结果的相对标准偏差 RSD, 考察日间稳定性三种基质中各浓度水平溶液的稳定性测定结果见表 8, 结果显示, 三种基质中, 三个浓度水平的回收率平均值均在 85%~115% 之间,RSD 均未超过 10% 表明样品溶液在 72 小时内稳定 19

20 表 8 稳定性测定结果基质浓度水平日内稳定性回收率平均值 RSD 日间稳定性回收率平均值 RSD 液态固态半固态实际样品检测严格按照已建立的检测方法对 10 份实际样品进行检测, 结果在 3 份样品中检出氟轻松, 其他样品中均未检出由于三批检出氟轻松的样品溶液中氟轻松峰面积超出线性范围, 因此对其进行了适当稀释后进行检测将测得的氟轻松峰面积代入基质标准曲线方程, 计算样品溶液中氟轻松的浓度, 按下式计算含量式中 : V D m ω 样品中氟轻松含量,μg /g; ρ 由标准曲线计算得到的样品溶液中氟轻松的浓度,μg/mL; V 样品定容体积,mL; m 样品取样量,g; D 稀释倍数 ( 不稀释则取 1) 三份检出样品测定结果见表 9 20

21 样品编号表 9 实际样品测定结果测定结果 (μg /g) 标准偏差 (μg /g) 阳性结果判定三批检出氟轻松的实际样品溶液和浓度为 0.4 μg/g 的液态基质对照品溶液的色谱图中, 氟轻松色谱峰保留时间两对子离子的相对丰度比结果见表 10, 结果显示, 三批样品色谱图中检出的色谱峰保留时间与氟轻松对照品一致, 并且离子对相对丰度比在 ±20% 以内, 可判定三批样品中含有氟轻松表 10 实际样品阳性结果判定名称保留时间相对丰度比相对偏差 (min) 对照品实验室间方法验证 6.1 特异性同 5.1 项下操作步骤, 空白样品色谱图见图 3 空白样品加标色谱图见图 4, 结果表明, 两个单位三种空白基质中的共存物质对氟轻松的测定均无干扰, 方法特异性良好 21

22 图 3 验证单位空白样品色谱图 A 液态基质 B 固态基质 C 半固态基质图 4 验证单位空白样品加标色谱图 ( 典型色谱图, 两个单位显示结果一致 ) A 液态基质 B 固态基质 C 半固态基质 6.2 线性和范围同 5.2 项下操作步骤, 溶液标准曲线液态基质标准曲线固态基质标准曲线和半固态基质标准曲线的线性方程和相关系数见表 11, 结果表明, 两单位测定氟轻松在 0.05 µg/ml~0.8 µg/ml 浓度范围内线性关系良好 22

23 表 11 验证单位线性和范围测定结果标准曲线线性方程相关系数线性范围溶液标准曲线 ( 单位 1/2) 液态基质标准曲线 ( 单位 1/2) 固态基质标准曲线 ( 单位 1/2) 半固态基质标准曲线 ( 单位 1/2) y = x µg/ml~0.8 µg/ml y = x µg/ml~0.8 µg/ml y = x µg/ml~0.8 µg/ml y = x µg/ml~0.8 µg/ml y = x µg/ml~0.8 µg/ml y = x µg/ml~0.8 µg/ml y = x µg/ml~0.8 µg/ml y = x µg/ml~0.8 µg/ml 6.3 检出限和定量下限同 5.3 项下操作步骤, 当氟轻松的浓度为 0.03 µg/ml 时, 氟轻松色谱峰信噪比约为 3:1, 因此方法的检出限为 0.15 ng; 当氟轻松的浓度为 0.05 µg/ml 时, 氟轻松色谱峰信噪比约为 10:1, 因此方法的定量下限为 0.25 ng 两单位验证结果一致 6.4 检出浓度同 5.4 项下操作步骤, 在三种基质中, 氟轻松浓度为 0.03 µg/g 的色谱图中氟轻松色谱峰信噪比均约为 3:1, 因此方法的检出浓度为 0.03 µg/g 两单位验证结果一致 6.5 最低定量浓度同 5.5 项下操作步骤, 三种基质中各样品溶液测得的结果见表 12 和表 13, 结果显示, 三种基质中, 方法回收率均在 80%~120% 之间,RSD 均未超过 5%, 并且各样品色谱图中氟轻松色谱峰信噪比均约为 10:1, 因此方法的最低定量浓度为 0.05 µg/g 两单位验证结果一致 23

24 表 12 验证单位 1 最低定量浓度测定结果基质加入浓度实测浓度平均值方法回收率平均值 RSD 液态固态半固态表 13 验证单位 2 最低定量浓度测定结果基质加入浓度实测浓度平均值方法回收率平均值 RSD 液态固态半固态精密度同 5.6 项下操作步骤, 三种基质中各浓度水平溶液的精密度测定结果见表 14, 结果显示, 三种基质中, 三个浓度水平的日内精密度和日间精密度最高为 10.1%, 表明方法可重现表 14 精密度测定结果基质浓度水平日内精密度 RSD ( 单位 1/2) 日间精密度 RSD ( 单位 1/2) / /7.6 液态 / / / / / /10.1 固态 / / / / / /0.5 半固态 / / / / 回收率 24

25 同 5.7 项下操作步骤, 三种基质中各浓度水平溶液的方法回收率测定结果见表 15 和表 16, 结果显示, 三种基质中, 三个浓度水平的方法回收率平均值均在 85%~115% 之间,RSD 均未超过 10% 表 15 验证单位 1 方法回收率测定结果基质加入浓度实测浓度平均值方法回收率平均值 RSD 液态固态半固态表 16 验证单位 2 方法回收率测定结果基质加入浓度实测浓度平均值方法回收率平均值 RSD 液态固态半固态综上, 方法的方法回收率结果较好, 三种基质中三个浓度水平的结果均在 85%~115% 之间, 表明采用基质标准曲线进行定量测定时结果准确 25

26 6.8 稳定性同 5.8 项下操作步骤, 三种基质中各浓度水平溶液的稳定性测定结果见表 17, 结果显示, 三种基质中, 三个浓度水平的日内和日间稳定性的 RSD 均未超过 10% 表明样品溶液在 72 小时内稳定表 17 验证单位稳定性测定结果基质浓度水平日内稳定性 ( 单位 1/2) 日间稳定性 ( 单位 1/2) 回收率平均值 RSD 回收率平均值 RSD / / / /2.9 液态 / / / / / / / / / / / /7.8 固态 / / / / / / / / / / / /5.9 半固态 / / / / / / / / 实际样品检测两家单位分别严格按照已建立的检测方法对同一批实际样品进行检测, 结果均检出氟轻松将测得的氟轻松峰面积代入基质标准曲线方程, 计算样品溶液中氟轻松的浓度, 并计算含量表 18 验证单位实际样品测定结果样品编号测定结果 (μg /g) 平均值 (μg /g) 标准偏差 (μg /g) 1( 单位 1) ( 单位 2) 阳性结果判定检出氟轻松的实验用样品溶液和浓度为 0.2 μg/ml 的液态基质对照品溶液的色谱图中, 氟轻松色谱峰保留时间两对子离子的相对丰度比结果见表 19, 结 26

27 果显示, 样品色谱图中检出的色谱峰保留时间与氟轻松对照品一致, 并且离子对相对丰度比在 ±20% 以内, 可判定样品中含有氟轻松表 19 实验用样品阳性结果判定 ( 单位 1/2) 名称保留时间 (min) 相对丰度比对照品 4.33/ /39.91 样品 4.39/ /42.68 单位 1: 中国食品药品检定研究院单位 2: 山西省食品药品检验所 27

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