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俟花
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1 2014 年 6 月 Vol.32 No.6 June 2014 Chinese Journal of Chromatography 647 ~ 652 技术与应用 DOI: / SP.J 在线净化液相色谱串联质谱法快速测定牛奶中的 6 种孕激素段永生 1, 王炳玲 1, 艾连峰 1, 郭春海 1, 葛世辉 1, 张婧雯 1 2, 徐牛生 (1. 河北出入境检验检疫局, 河北石家庄 ; 2. 赛默飞世尔科技 ( 中国 ) 有限公司, 上海 ) 摘要 : 建立了在线净化液相色谱串联质谱同时测定牛奶中炔诺酮 17α 羟基孕酮甲羟孕酮乙酸甲地孕酮孕酮和醋酸美伦孕酮 6 种孕激素的方法本方法采用乙腈为提取溶剂提取目标化合物提取液经在线净化柱 Cyclone P 净化, 经 Phenyl Hexyl 色谱柱分离, 流动相采用 0 5% (v / v) 甲酸水溶液乙腈, 在电喷雾正离子模式下以多反应监测 (MRM) 方式测定, 内标法定量方法在 0 1~ 50 μg / L 范围内呈线性关系, 线性相关系数均大于种分析物的测定低限为 0 5 μg / kg, 在牛奶中 3 个水平的添加回收率在 90 8% ~ 107 5% 之间, 相对标准偏差在 6 3% ~ 11 8% 之间该方法快速简便, 灵敏度高, 选择性好, 可用于牛奶样品中孕激素的快速定性定量分析关键词 : 在线净化 ; 液相色谱串联质谱 ; 孕激素 ; 牛奶中图分类号 :O658 文献标识码 :A 文章编号 : (2014) Determination of six progesterones in milk by on line cleanup liquid chromatography tandem mass spectrometry DUAN Yongsheng 1, WANG Bingling 1, AI Lianfeng 1, GUO Chunhai 1, GE Shihui 1, ZHANG Jingwen 1, XU Niusheng 2 (1. Hebei Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shijiazhuang , China; 2. Thermo Fisher Scientific (China), Shanghai , China) Abstract: A new method using TurboFlow on line cleanup liquid chromatography combined with tandem mass spectrometry ( MS / MS) has been developed for simultaneous determination of six progesterones including 19 norethindrone, 17α hydroxyprogesterone, medroxyprogester one, megestrol acetate, progesterone and melengestrol acetate in milk. Samples were extracted by acetonitrile. The analytes in extract were on line purified directly on Cyclone P purification column where the sample matrices were washed away. Subsequently, the analytes which were eluted from the extraction column onto Phenyl Hexyl column were separated with a gradient elution, and detected with electrospray ionization mass spectrometry in the positive scan mode using multiple reaction monitoring ( MRM). The isotope internal standards were employed for quantification. As a result, the linearities were satisfactory with the correlation coefficients of >0 999 at concentrations ranging from 0 1 μg / L to 50 μg / L. Based on the repeated analysis of a known blank sample, the limit of quantification (LOQ) is 0 5 μg / kg. Average recoveries of the analytes fortified at three levels (1, 5 and 25 μg / kg) ranged from 90 8% to 107 5%, and the relative standard deviations (RSDs) ranged from 6 3% to 11 8%. This proposed method is sim ple, rapid, sensitive and highly selective, and can be applied to simultaneous identification and quantification of the six progesterones in milk. Key words: on line cleanup; liquid chromatography tandem mass spectrometry ( LC MS / MS); progesterones; milk 通讯联系人.Tel:(0311) ,E mail:ai_lianfeng@ 126.com. 基金项目 : 国家质检总局科技计划项目 (2013IK154,2014IK092). 收稿日期 :

2 648 色谱第 32 卷孕激素是维持妊娠所需要的二十一碳类固醇激素, 包括天然化合物和人工合成化合物这些物质一般都较稳定, 不易降解, 在人体内具有一定的生物活性, 长期食用含孕激素的食品会严重影响人体的正常生理功能, 更严重的会导致人体突变, 具致畸形致癌的潜在危害 [1] ; 已有研究表明, 儿童性早熟妇女乳腺癌和子宫癌发病率的上升与动物源性食品中性激素残留有关我国农业部 176 号公告明确规定, 禁止饲料和动物饮用水中添加炔诺醇左炔诺孕酮炔诺酮等孕激素, 并在 235 号公告规定了醋酸甲羟孕酮等外源性激素物质在动物性食品中的最高残留限量为不得检出但迫于利益驱使, 为提高奶牛产奶量, 仍有养殖户非法使用孕激素, 严重影响了人们的身体健康和我国的出口贸易目前, 对于孕激素类药物残留的检测方法已有很多, 用于食品中激素残留检测的方法主要有气相色谱质谱法 (GC MS) [2,3] 和液相色谱质谱法 ( LC MS) [4-11] 但其残留检测的前处理方法步骤较为繁琐, 多需要经酶解或固相萃取, 新的 QuEChERS 技术也需要旋蒸浓缩等步骤 [12,13], 实验时间长耗材消耗量大, 且前处理中大量有害试剂对操作人员可能有危害风险 TurboFlow 在线净化技术结合了扩散化学和体积排除的原理, 在捕获感兴趣分析物的同时, 快速净化样品 ; 结合高灵敏度高定性能力的串联质谱保证了方法的灵敏度, 该技术已应用于食品中化学污染物的分析 [14-17] 本文采用该技术建立了在线净化液相色谱串联质谱测定牛奶中炔诺酮 17α 羟基孕酮甲羟孕酮乙酸甲地孕酮孕酮和醋酸美伦孕酮 6 种孕激素类药物残留的方法, 为牛奶中孕激素的多残留分析提供了一个快速而有效的绿色解决方案 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 TurboFlow 在线净化液相色谱串联质谱仪 ( 美国 Thermo Fisher 公司 ), 由 CTC 多功能自动进样器 ( 配有 100 μl 定量环 ) 两个耐压 125 MPa 的四元梯度液相泵六通阀切换装置多元柱切换装置和 TSQ Quantum Ultra 三重四极杆质谱仪组成 ; PT2100 型均质器 ( 瑞士 Kinematica 公司 ); 高速冷冻离心机 ( 德国 Sigma 4K 18); 漩涡振荡器 ( 美国 Vortex Genie2); 超声波清洗器 (KQ 500E) 甲醇乙腈均为色谱纯 ; 水为 Milli Q 高纯水标准物质 : 炔诺酮 17α 羟基孕酮甲羟孕酮乙酸甲地孕酮孕酮醋酸美伦孕酮, 德国 Dr. Ehrenstorfer 公司, 纯度 99% 内标标准物质 : 炔诺酮 D6 孕酮 D9, 纯度 99% 精确称取适量标准品, 用乙腈配制成 100 mg / L 的标准储备液和内标标准储备液分别取标准储备液用乙腈配制成质量浓度为 1 mg / L 的混合标准工作液 ; 分别取内标标准储备液用乙腈配制成质量浓度为 1 mg / L 的混合内标工作液用混合标准工作液和内标工作液配制系列标准溶液, 孕激素质量浓度范围在 0 1 ~ 50 μg / L 范围内, 内标质量浓度为 5 μg / L 1.2 实验方法样品处理准确称取样品约 2 g( 精确到 0 01 g), 置于 50 ml 离心管中, 加入 50 μl 混合内标工作液和 10 ml 乙腈, 涡旋提取 0 5 min, 超声 15 min r / min 离心 10 min 取 1 ml 左右的上清液经 μm 微孔滤膜过滤后进样测定在线净化色谱条件在线净化柱为 Cyclone P 柱 ( 50 mm 0 5 mm); 在线净化流路流动相 A 为 10 mmol / L 乙酸铵 0 01% (v / v) 乙酸溶液,B 为乙腈,C 为丙酮乙腈异丙醇 (1 1 1, v / v / v); 其在线净化程序见表 1, 其中在线净化程序中每步的变化采用瞬变模式 ; Step No. Start Step time Table 1 表 1 在线净化及色谱分离的梯度洗脱程序 Gradient elution procedures of on line cleanup and chromatographic separation Loading pump Function Flow rate / (ml / min) A / % B / % C / % Elution pump Function Flow rate / (ml / min) A / % B / % loading conditioning transfer elution cleaning elution cleaning elution cleaning elution loop filling elution conditioning conditioning For loading pump, A was 10 mmol / L ammonium acetate 0 01% (v / v) acetic acid aqueous solution, B was acetonitrile, C was ace tone acetonitrile isopropanol (1 1 1, v / v / v). For elution pump, A was methanol, B was 0 5% (v / v) formic acid aqueous solution.

3 第 6 期段永生, 等 : 在线净化液相色谱串联质谱法快速测定牛奶中的 6 种孕激素 649 进样量为 50 μl HPLC 分析柱为 Thermo Phenyl Hexyl 柱 (100 mm 2 1 mm, 3 μm); 流动相 A 为甲醇, 流动相 B 为 0 5% ( v / v) 的甲酸溶液 ;HPLC 的洗脱梯度见表 1, 每步的变化除最后一步采用瞬变模式外其他步骤间改变采用渐变模式整个运行时间为 10 min 方法的流路模式见参考文献 [14] 质谱条件电喷雾离子源 (ESI); 多反应监测 (MRM) 正离子扫描模式 ; 电喷雾电压 (IS) V; 毛细管温度 350 ; 辅助气压力 45 unit; 鞘气压力 30 unit; 源内诱导解离电压 10 V; 碰撞气压力 200 Pa ( 1 5 mtorr); 定性离子对定量离子对, 碰撞能量见表 2 Table 2 表 2 6 种孕激素测定的质谱参数 MS parameters for the determination of the six progesterones Compound Retention time / min Internal standard Daughter ion ( m / z) Collision energy / ev 19 Norethindrone 6.68 norethindrone D / / α Hydroxyprogesterone 6.77 norethindrone D / / Medroxyprogesterone 6.90 progesterone D / / Megestrol acetate 6.95 progesterone D / / Progesterone 7.04 progesterone D / / Melengestrol acetate 6.98 progesterone D / / Norethindrone D / Progesterone D / Quantitative ion. 2 结果与讨论 2.1 质谱条件的选择用蠕动泵以 10 μl / min 向质谱系统注入 1 mg / L 的混合标准溶液来确定分析物的最佳质谱条件在 ESI + 扫描方式下分别对分析物进行一级全扫描 (Q1), 得到各标准物质的母离子, 分析物的分子离子峰 [M+H] + 响应值最高, 无 [ M+Na] + 和 [ M+ NH 4 ] + 分别选择各母离子进行子离子扫描 ( Q3) 得到特征碎片离子并优化碰撞能量选择响应值高稳定且无干扰的 Q1 / Q3 离子对为定量和定性离子对, 其优化的参数见表提取溶液的选择一般以乙腈甲醇乙酸乙酯及其他不同比例的混合提取液提取孕激素, 提取液用固相萃取柱净化本实验根据牛奶样品的特点及孕激素的化学性质, 考察了甲醇乙腈乙酸乙酯 1% 三氯乙酸乙腈 (7 3, v / v)4 种提取液的提取效果, 其回收率结果见表 3 结果表明乙酸乙酯作提取剂时回收率最低 ;1% 三氯乙酸乙腈 (7 3, v / v) 其次 ; 甲醇和乙腈的回收率相当 ; 但甲醇提取后溶液放置一段时间后会有白色絮状物析出, 说明甲醇沉淀蛋白效果较差, 乙腈作提取剂时回收率稳定, 且蛋白沉淀效果最好所以, 选择乙腈作为提取溶剂表 3 不同提取溶剂的回收率结果 (n = 5) Table 3 Recoveries with different extraction solvents ( n = 5) % Compound Methanol Acetonitrile Ethyl acetate 1% trichloroacetic acid solution acetonitrile (7 3, v / v) 19 Norethindrone 85.1± ± ± ±6.7 17α Hydroxyprogesterone 89.1± ± ± ±5.9 Medroxyprogesterone 90.2± ± ± ±5.5 Megestrol acetate 88.6± ± ± ±7.8 Progesterone 87.9± ± ± ± 在线净化条件的选择在线固相萃取是用液相泵驱动不同的溶液使分析物在不同阶段实现在在线净化柱上的保留洗脱并尽可能地淋洗掉干扰组分选择恰当的在线净化柱和每步的流动相组成是在线净化条件优化的关键孕激素极性较弱, 反相硅胶型的 C18 柱和极性修饰的 C18 P 柱以及聚合物型的 Cyclone 和极性修饰的 Cyclone P 柱均可有效保留孕激素 ; 但 Cy clone P 柱更易洗脱, 流动相中有机相比例在 60% 时就可将分析物完全洗脱 ; 使用较低比例的有机相会减小进入分析柱后产生的溶剂化效应, 改善峰形故选择 Cyclone P 柱为在线净化柱

4 650 色谱第 32 卷在线净化过程主要包括上样洗脱转移和淋洗选择 Cyclone P 柱为在线净化柱, 实验采用不接分析柱分流进质谱的方式, 优化每一步的分析条件上样溶液比较了 10 mmol / L 乙酸铵 0 02% 乙酸水溶液和 0 5% 甲酸水溶液, 结果显示用 10 mmol / L 乙酸铵 0 02% 乙酸水溶液作流动相时得到的色谱峰形较好在洗脱转移这一步骤, 对 10 mmol / L 乙酸铵 0 02% 乙酸水溶液和乙腈的使用比例进行了考察, 如图 1 所示, 当乙腈的使用比例小于 50% 时, 洗脱效果明显变差, 因此选定乙腈比例为 60% 淋洗这一步骤是分析物在分析柱分离和质谱检测过程中, 由净化泵带着洗脱能力较强的溶剂对净化柱进行淋洗, 并用洗脱溶剂充满洗脱环以备下一个样品的分析方法选择丙酮乙腈异丙醇 (1 1 1, v / v / v) 作为强洗脱溶剂, 充分淋洗净化柱, 绝大部分杂质可淋洗掉, 进样 500 余次后在线净化柱仍能有效净化分析物 2.4 分离条件的优化在流动相的选择上, 实验比较了甲醇和乙腈, 结果表明, 甲醇做流动相时分析物的信号明显增加在梯度的优化上, 因在洗脱转移时在线净化流路与 HPLC 流路合并, 两路混合后在线净化流路中的有机相对分析物的保留行为包括色谱峰形保留时间均有明显影响, 故在此步骤应设置高的 HPLC 流速且高水相比例实验发现当 HPLC 流动相起始水相比例高于 80% 时可有效稀释合并流路的有机相, 但水相过高会延长分析时间综上考虑, 方法选择了表 1 的梯度洗脱条件在优化的净化分析条件下, 其 MRM 色谱图如图 2 所示 2.5 基质效应线性范围和测定低限 [18] 实验采用 Matuszewski 等建立的基质效应确认方法, 即对比样品提取净化后的基质加标溶液和标准品溶液的响应值来考察方法的基质效应当比值等于或接近 1 时, 表明不存在基质效应的影响 ; 大于 1, 表明存在离子增强作用 ; 小于 1, 表明存在离子抑制作用实验在 5 μg / L 水平用牛奶提取液配制的基质标准溶液与用乙腈配制的标准溶液的响应值进行了对比, 结果发现比值均在 0 9 左右 ( 见表 4: Ratio 1), 说明存在一定的基质效应影响但经同位素校正后, 标准溶液中分析物与内标物的比值和基质标准溶液的分析物与内标物的比值基本一致 ( 见表 4: Ratio 2), 表明用同位素内标稀释法可有效消除基质效应的影响所以, 采用溶剂配制系列标准溶液, 内标法校正分析结果用乙腈配制系列标准溶液, 在选定的色谱和质图 1 洗脱剂中乙腈体积比不同时的 MRM 图 Fig. 1 MRM chromatograms under different volume ratios of acetonitrile in elution solvent Not connected to the analytical column. A: 10 mmol / L ammonium acetate 0 01% acetic acid aqueous solution; B: acetonitrile.

5 第 6 期段永生, 等 : 在线净化液相色谱串联质谱法快速测定牛奶中的 6 种孕激素 651 测定时所受的干扰情况, 确定牛奶中 6 种分析物的测定低限 (LOQ) 为 0 5 μg / kg 表 4 基质效应考察结果 Table 4 Results of matrix effect test Compound Response / 10 5 Milk Solvent Ratio 1 Ratio 2 19 Norethindrone α Hydroxyprogesterone Medroxyprogesterone Megestrol acetate Progesterone Melengestrol acetate Norethindrone D Progesterone D The ratio calibrated by internal standard. 表 5 Table 5 线性范围线性方程和相关系数 (R) Linear ranges, linear equations and correlation coefficients ( R) Hormone Linear equation R 19 Norethindrone Y = X α Hydroxyprogesterone Y = X Medroxyprogesterone Y = X Megestrol acetate Y = X Progesterone Y = X Melengestrol acetate Y = X Linear range: μg / L. Y: peak area ratio of analyte to internal standard. X: mass concentration of analyte, μg / L. 2.6 方法的回收率和精密度用牛奶样品做添加回收和精密度试验, 样品添加不同浓度的标准溶液后, 按 1 2 节方法进行提取净化和测定, 分析结果见表 6 3 个添加水平的回收率在 90 8% ~ 107 5% 之间, 相对标准偏差在 6 3% ~ 11 8% 之间, 方法回收率高, 稳定性好图 2 孕激素及内标物的多反应检测 (MRM) 色谱图 Fig. 2 MRM chromatograms of analytes and internal standards 谱条件下进样分析以分析物峰面积与内标峰面积的比值对标准工作溶液中被测组分的质量浓度作线性回归, 其线性范围线性方程和线性相关系数见表 5 由结果可知方法在 0 1 ~ 50 μg / L 范围内呈良好线性, 线性相关系数在 ~ 之间根据最终样液所代表的试样量定容体积以及表 6 方法的添加回收率和精密度 (n = 6) Table 6 Recoveries and precisions of the method (n = 6) Hormone Background / (μg / kg) Spiked / Recovery / RSD / (μg / kg) % % 19 Norethindrone α Hydroxyprogesterone Medroxyprogesterone Megestrol acetate Progesterone Melengestrol acetate

6 652 色谱第 32 卷 2.7 实际样品的测定对市售的 10 种牛奶及进口的乳清粉进行抽样分析, 发现样品均含有孕酮, 含量在 1 7 ~ 2 6 μg / kg 之间, 其他 5 种孕激素均未检出 3 结论本文建立了在线净化液相色谱串联质谱测定牛奶中 6 种常见孕激素类物质含量的方法方法采用乙腈提取, 提取液直接进样, 在线净化液相色谱串联质谱测定, 同位素内标法定量方法的 LOQ 为 0 5 μg / kg, 满足国内外的限量要求, 方法简单快速, 回收率高, 重现性好, 已应用在本实验室的日常检验中参考文献 : [1] Luo H T, Huang X L, Wu H Q, et al. Journal of Instrumental Analysis ( 罗辉泰, 黄晓兰, 吴惠勤, 等. 分析测试学报 ), 2011, 30(12): 1329 [2] Deng X L, Fan J, Huang T H, et al. China Food ( 邓晓丽, 范军, 黄涛宏, 等. 中国食品 ), 2011(4): 56 [3] Zhang H, Wang S H, Yang L X, et al. Modern Preventive Medicine ( 张宏, 王淑惠, 杨立学, 等. 现代预防医学 ), 2010, 37(4): 636 [4] Yang Y, Shao B, Zhang J, et al. J Chromatogr B, 2009, 877 (5 / 6): 489 [5] Gao Q, Luo D, Bai M, et al. J Agric Food Chem, 2011, 59 (16): 8543 [6] Kang H N, Ouyang S, Lin L, et al. Chinese Journal of Chro matography ( 康海宁, 欧阳姗, 林黎, 等. 色谱 ), 2012, 30 (10): 986 [7] Tim Harwood D, Handelsman D J. Clin Chim Acta, 2009, 409(1 / 2): 78 [8] Chen X H, Sheng X F, Jin M C. Chinese Journal of Health Laboratory Technology ( 陈晓红, 盛雪飞, 金米聪. 中国卫生检验杂志 ), 2010, 20(11): 2671 [9] Wang H X, Zhou Y, Jiang Q W. Chinese Journal of Analyti cal Chemistry ( 王和兴, 周颖, 姜庆五. 分析化学 ), 2011, 39 (9): 1323 [10] SN / T [11] Zhang H W, Cai X, Lin L M, et al. Chinese Journal of Chromatography ( 张鸿伟, 蔡雪, 林黎明, 等. 色谱 ), 2012, 30(10): 991 [12] Zeng Y Z, Zhang Y, Dong L F, et al. Chinese Journal of Chromatography ( 曾玉珠, 章勇, 董良飞, 等. 色谱 ), 2013, 31(12): 1176 [13] Wang M L, Yan H F, Fu S L, et al. Chinese Journal of Chromatography ( 王美玲, 颜鸿飞, 傅善良, 等. 色谱 ), 2012, 30(10): 980 [14] Ai L F, Ma Y S, Chen R C, et al. Chinese Journal of Ana lytical Chemistry ( 艾连峰, 马育松, 陈瑞春, 等. 分析化学 ), 2013, 41(8): 1194 [15] Mottier P, Hammel Y A, Gremaud E, et al. J Agric Food Chem, 2008, 56(1): 35 [16] Roach J A G, DiBussolo J M, Krynitsky A, et al. J Chrom atogr A, 2011, 1218: 4284 [17] Zhao K X, Ge B K, Chen X Y, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry ( 赵孔祥, 葛宝坤, 陈旭艳, 等. 分析化学 ), 2011, 39(9): 1341 [18] Matuszewski B K, Constanzer M L, Chavez Eng C M. Anal Chem, 2003, 75(13): 3019

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