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攸召麻
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1 微生物学通报 Microbiology China MAR 20, 2010, 37(3): by Institute of Microbiology, CAS 研究报告一株新的 α- 糖苷酶抑制剂生产菌株 PW0852 的初步研究白芳 1 张奇 1 彭臻臻 2 齐西珍 1 白钢 1,2* (1. 南开大学药学院天津 ) (2. 南开大学生命科学学院天津 ) 摘要 : 从土壤中分离并筛选得到了一株 α- 糖苷酶抑制剂生产菌 PW0852 根据形态特征培养特征生理生化特征及 16S rrna 序列相似性分析等多相分类方法, 初步判定菌株 PW0852 为淡紫灰链霉菌 (Streptomyces lavendulae) 该菌经 10 L 发酵罐水平发酵, 发酵液中可积累一定量的 α- 糖苷酶抑制剂采用膜过滤技术离子交换树脂吸附及冷冻干燥等方法, 从 PW0852 发酵液中分离获得混合型 α- 糖苷酶抑制剂 GIB852 GIB852 对人类胰腺 α- 淀粉酶和 α- 麦芽糖酶都有明显的抑制作用, 其对麦芽糖酶的抑制性比同剂量的市售双糖酶抑制剂米格列醇强 28.7 倍, 而对 α- 淀粉酶的抑制性较弱通过小鼠糖耐量实验, 发现 α- 糖苷酶抑制剂 GIB852 对哺乳动物餐后高血糖的形成有明显改善作用, 具有开发为糖尿病药物的潜力关键词 : 淡紫灰链霉菌, 多相分类, 发酵, α- 糖苷酶抑制剂 Study of a Novel Strain PW0852 Producing α-glucosidase Inhibitor BAI Fang 1 ZHANG Qi 1 PENG Zhen-Zhen 2 QI Xi-Zhen 1 BAI Gang 1,2* (1. College of Pharmacy, Nankai University, Tianjin , China) (2. College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin , China) Abstract: Actinomycete strain PW0852 with high production of α-glucosidase inhibitor was isolated from soil samples. Based on the results of morphological, physiological, chemotaxonomic characteristics and 16S rrna analysis, strain PW0852 was placed within the genus Streptomyces and identified as the species Streptomyces lavendulae. After fermentation in a 10 L fermentor, α-glucosidase inhibitors were accumulated in the harvested broth of strain PW0852. The mixed-type α-glucosidase inhibitor GIB852 we obtained was isolated and purified after ultra-filtration, nano-filtration, resin-adsorption and desiccation. GIB852 could efficaciously inhibit human pancreatic α-amylase and α-maltase glucoamylase. The inhibition of maltase is stronger than the same dose of the commercial α-glucosidase inhibitor miglitol 28.7 times, while the inhibition of α-amylase is weak. GIB852 could significantly depress blood glucose levels in mammalian systems 基金项目 : 国家 863 计划项目 (No. 2006AA020502) * 通讯作者 :Tel/Fax: ; : gangbai@nankai.edu.cn 收稿日期 : ; 接受日期 :

2 376 微生物学通报 2010, Vol.37, No.3 and be developed towards a possible therapeutic agent for diabetes. Keywords: Streptomyces lavendulae, Polyphasic taxonomy, Fermentation, α-glucosidase inhibitor α- 糖苷酶抑制剂是目前临床治疗 2 型糖尿病的一线口服降糖药物, 它通过可逆性地抑制肠系膜刷状缘的 α- 糖苷酶, 延缓 α- 糖苷酶将多糖 ( 如淀粉寡糖等 ) 分解为葡萄糖, 从而减慢葡萄糖的吸收速度, 降低餐后血糖 [1 2] 目前用于临床糖尿病治疗的 α- 糖苷酶抑制剂代表性药物主要有阿卡波糖 (Acarbose) 福格列波糖(Voglibose) 米格列醇 (Miglitol) [3 5] 等其中, 阿卡波糖对淀粉酶的抑制作用最强, 对双糖酶 ( 蔗糖酶和麦芽糖酶 ) 的抑制作用差 ; 而伏格列波糖和米格列醇则恰好相反, 因此, 后两者的肠胀气副作用比前者轻一些 [6] 链霉菌是土壤中种类和数量庞大的一个微生物类群, 具有强大的生物合成能力, 一直以来都是人们筛选新型天然化合物的资源宝库阿卡波糖就发现于游动放线菌 (Actinoplanes sp. SE50) 的发酵液中 [7] 本实验室利用稀释分离法从京津黑辽鲁皖闽桂滇等地区的 200 多份土壤样品中共分离到 3000 余株放线菌随后进行发酵培养, 应用 α- 糖苷酶抑制剂筛选模型对菌株发酵液进行初筛和复筛, 优选出一株 α- 糖苷酶抑制剂产生菌, 编号为 PW0852 本文采用 16S rrna 序列相似性分析等多相分类方法对菌株 PW0852 进行菌种鉴定, 确认其分类地位, 然后在 10 L 发酵罐水平考察其发酵过程, 对发酵产物进行初步分离纯化, 得到混合型 α- 糖苷酶抑制剂 GIB852, 并对 GIB852 进行了初步的生物学活性分析 1 材料和方法 1.1 材料放线菌 PW0852 菌株为本实验室从土壤中自行分离获得实验动物为昆明种小鼠, 体重 g, 雌雄各半, 为二级实验动物, 由军事医学科学院实验动物中心提供人胰腺 α- 淀粉酶 (Human pancreatic α-amylase, HPA) 和人 α- 麦芽糖酶 (Maltase glucoamylase, MGAM) 均由本实验室克隆表达获得 16S rrna 序列测定工作由上海生工公司完成 ; 阿卡波糖片 (Acarbose, 拜唐苹 ) 为德国拜耳医药保健有限公司产品 ; 米格列醇片 (Miglitol, 奥恬苹 ) 为四川维奥制药有限公司产品 ; 葡萄糖体外诊断试剂盒 (GOD.PAP 法 ) 为北京中生生物工程公司产品 ; 超滤膜和纳滤膜设备均购自上海朗极化工科技有限公司 ; 各型树脂均购自南开大学化工厂 ; 其余试剂均为国产分析纯 1.2 方法菌株 PW0852 的多相分类 : 所有相关方法参照文献 [8] 进行菌株 PW0852 的发酵 : 于高氏 1 号液体培养基接种菌株 PW0852 斜面孢子, 摇床 140 r/min 28 C 培养 48 h 后作为发酵种子在 10 L 不锈钢机械搅拌全自动型发酵罐中投入 6 L 相同组分的培养基, Pa 灭菌 30 min 后冷却, 以 5% 接种量接入种子, 开始发酵, 搅拌转速 200 r/min, 通气量 3 L/min, 在 28 C 发酵 50 h 后收集发酵液 ( 约 5 L) 菌株 PW0852 发酵液中 α- 糖苷酶抑制剂的分离制备 : 将发酵液经 5000 r/min 低温离心 20 min 后, 收集上清液, 先后过截留分子量为 6000 D 的超滤膜和 1000 D 的纳滤膜, 收集具有 α- 糖苷酶抑制活性部分, 再通过 180 D 纳滤膜浓缩浓缩液经型强阳离子交换吸附树脂柱吸附 α- 糖苷酶抑制剂, 以 1 mol/l 氨水洗脱, 收集具有 α- 糖苷酶抑制活性部分洗脱液经减压旋蒸去氨后, 真空冻干获得 α- 糖苷酶抑制剂混合物, 命名为 GIB α- 糖苷酶抑制剂抑制效果分析 : 对人胰腺 α- 淀粉酶抑制效果的测定以 200 μl 0.1% 可溶性淀粉为底物, 加入 100 μl 系列稀释的 α- 糖苷酶抑制剂溶液, 随后加入 100 μl HPA 启动反应, 37 C 孵育 30 min 后沸水浴 5 min 终止反应, 加入 50 μl 卢戈氏碘液, 于 630 nm 测定光吸收值以抑制剂浓度为横坐标, α- 淀粉酶的相对活力为纵坐标做图, 绘制剂量依赖的抑制曲线对人 α- 麦芽糖酶抑制效果的测定以 200 μl 0.1% 麦芽糖为底物, 加入 100 μl 系列稀释的 α- 糖苷酶抑制剂溶液, 随后加入 100 μl MGAM 启动反应, 37 C 孵育 30 min 后沸水浴 5 min 终止反应, 取 50 μl 反应液用葡萄糖氧化酶法测定 490 nm 光吸收值, 具体操作方法详见葡萄糖体外诊断试剂盒使用说明

3 白芳等 : 一株新的 a- 糖苷酶抑制剂生产菌株 PW0852 的初步研究 377 书以抑制剂浓度为横坐标, α- 麦芽糖酶的相对活力为纵坐标做图, 绘制剂量依赖的抑制曲线 α- 糖苷酶抑制剂对餐后血糖升高的抑制作用 : 将正常小鼠按体重随机分为空白对照组阿卡波糖组米格列醇组和 GIB852 组, 每组各 10 只实验前 16 h 禁食不禁水, 取同一剂量阿卡波糖米格列醇和 GIB852 与淀粉 (3 g/kg) 混合, 对小鼠灌胃给药, 分别在给药后 min 进行尾静脉采血, 用葡萄糖体外诊断试剂盒测定血浆葡萄糖水平氏一号培养基上, 基内菌丝发达, 颜色为浅乳脂色气生菌丝发达, 培养初期 (1 周 ) 呈淡肉桂粉, 后期 (2 周 ) 颜色略深为肉桂粉色在酪氨酸培养基上, 产生黑色色素 2 结果 2.1 α- 糖苷酶抑制剂生产菌株 PW0852 的分类地位菌株 PW0852 的形态特征与培养特征 : 菌株 PW0852 在固体培养基上表现出典型的链霉菌菌落特征菌落干燥致密, 不透明, 具有颜色不同的气生菌丝和基内菌丝 200 倍电镜下观察, 气生菌丝生长较密集倍电镜下观察, 气生菌丝较直, 无螺旋状结构, 孢子呈圆柱形, 竹节状成串生长, 且表面光滑无刺 ( 图 1) 在不同组分固体培养基上, 菌株 PW0852 均生长旺盛, 其培养特征如表 1 所示在高图 1 菌株 PW0852 的菌落及菌丝的电子显微镜照片 Fig. 1 Scanning electron micrograph of strain PW0852 注 : A: 200 倍扫描电镜 ; B: 倍扫描电镜. Note: A: Scanning electron microscope ( 200); B: Scanning electron microscope ( 10000) 菌株 PW0852 的生理生化特性与碳源利用能力 : 如表 2 所示, PW0852 可以使淀粉水解牛奶胨化和凝固, 并产生黑色素和硫化氢 ; 但不能使明胶液化, 不能水解纤维素除了木糖半乳糖和甘露醇, 菌株 PW0852 可以利用测试的所有碳源, 说明其利用碳源能力极强培养基 Media Gause s No. 1 synthetic medium agar Table 1 表 1 菌株 PW0852 在不同培养基上的培养特征 The culture characteristics of strain PW0852 on various agar media 基内菌丝 Substrate mycelia 气生菌丝 Aerial mycelia One week Two weeks One week Two weeks 色素 Pigments White White-yellow Light-Purple Purple-gray None Potato infusion agar Brown Brown Purple-gray Purple-gray Brown ISP4 medium agar White-yellow White-yellow White White None Czapek s medium agar White White Purple Purple None Glucose asparagines agar Yellow Yellow White White-gray None Tyrosine agar White-yellow White-yellow White White Black S rrna 序列分析 : 菌株 PW0852 的 16S rrna 核酸序列全长为 1477 bp, 该序列已提交 GenBank, 登录号 : FJ 将所得序列与 GenBank 数据库中的相关种进行比较, 发现 PW0852 菌株与链霉菌属 (Streptomyces) 的 16S rrna 序列同源性都很高, 其中与淡紫灰链霉菌 (S. lavendulae, 登录号 : EF371424, 菌株 3026) 具有 98.6% 的相似性, 与多产色链霉菌 (S. polychromogenes, 登录号 : AY999923, 菌株 NRRL B-3032) 的相似性为 98.7% 结合形态学特征培养特征和生理生化特征, 最终将菌株 PW0852 的分类地位初步确定为链霉菌属淡紫灰链霉菌 2.2 α- 糖苷酶抑制剂生产菌株 PW0852 的发酵菌株 PW0852 的整个发酵过程在 10 L 不锈钢机械搅拌全自动型发酵罐中完成, 发酵曲线如图 2 所示发酵过程的前 12 h, 菌株 PW0852 处于延滞期,

4 378 微生物学通报 2010, Vol.37, No.3 菌体生长缓慢, ph 快速降低 12 h 后, 直至 84 h, 菌株 PW0852 处于生长对数期, 在此期间, 菌体生长迅速, ph 恒定 ( 约 5.9) 从 96 h 开始, 菌株 PW0852 进入稳定期此后, 菌体几乎不再生长, 而糖苷酶抑制剂开始大量合成和分泌, 同时 ph 开始小幅降低, 到达 120 h 处, ph 达到最小值 ( 约 5.6), 而糖苷酶抑制剂的累积达到最大值发酵产物经超滤纳滤阳离子树脂吸附减压旋蒸和真空干燥等流程, 得到具备 α- 糖苷酶抑制剂活性的白色粉末状物质 200 mg, 命名为 GIB852, 用于后续实验分析表 2 菌株 PW0852 的生理生化反应与碳源利用情况 Table 2 The phenotypic characteristics of PW0852 特征 Characteristics Starch hydrolysis 结果 Results 特征 Characteristics 结果 Results + Fructose 菌株 PW0852 发酵产生的 α- 糖苷酶抑制剂 GIB852 的抑制活性以抑制剂浓度为横坐标, HPA 或 MGAM 的相对活力为纵坐标绘制剂量依赖的抑制曲线 ( 图 3) 将 GIB852 同时与市售的 α- 淀粉酶抑制剂阿卡波糖和 α- 双糖酶抑制剂米格列醇进行比较如图 3A 所示, GIB852 在酶学水平对 HPA 具有一定的抑制作用, GIB852 的半数抑制浓度 (IC50) 值为阿卡波糖的 44.5 倍, 即 GIB852 对淀粉酶的抑制活性较阿卡波糖弱 44.5 倍图 3B 显示, GIB852 对 MGAM 具有较强的抑制作用, 其 IC50 值为米格列醇的倍, 即同剂量的 GIB852 比米格列醇对人 α- 麦芽糖酶的抑制性强 28.7 倍 Gelatin liquefaciton Mick peptonization Mick solidification Melanin production Xylose + Rhamnose + + Sorbitol + + Sucrose + H 2 S production + Galactose Growth in cellulose Inositol + Glucose + Mannitol 图 2 菌株 PW0852 的发酵曲线 Fig. 2 Time courses of α glucosidase inhibitors production in fermentation of strain PW0852 注 : : 抑制剂含量 ; : 菌丝体干重 ; : ph 值. Note: : Total inhibitors; : Dried mycelia; : ph. 图 3 GIB852 对 α- 淀粉酶 / 糖苷酶的剂量依赖抑制曲线 Fig. 3 Dose-dependent inhibitory curves of the inhibitor GIB852 注 : A: 对人胰腺 α- 淀粉酶 (Human pancreatic α-amylase, HPA) 的剂量依赖抑制曲线 ; B: 对人 α- 麦芽糖酶 (Maltase glucoamylase, MGAM) 的剂量依赖抑制曲线. Note: A: Dose-dependent inhibitory curves of HPA; B: Dose-dependent inhibitory curves of MGAM.

5 白芳等 : 一株新的 a- 糖苷酶抑制剂生产菌株 PW0852 的初步研究 α- 糖苷酶抑制剂 GIB852 的应用为了确认 GIB852 在哺乳动物体内的降血糖效果, 分别设计空白对照组和给药组 ( 阿卡波糖组米格列醇组和 GIB852 组 ) 进行动物耐糖量实验, 测定小鼠在给予相同剂量淀粉后, 2 h 内的血糖变化分别于 min 时间点取血测定血浆葡萄糖浓度, 以时间点为横坐标, 以血糖值为纵坐标绘制小鼠餐后 2 h 内血糖变化曲线如图 4 所示, 健康小鼠在淀粉灌胃后血糖开始升高, 在 30 min 时血糖达到峰值, 120 min 时血糖基本降到空腹水平, 而同时给予 α- 糖苷酶抑制剂的 3 组小鼠, 其血糖高峰受到了明显的抑制和延迟, 30 min 时给药组和空白对照组之间的血糖值存在显著差异 (P < 0.01); 对于给药组来讲, 阿卡波糖组米格列醇组和 GIB852 组在 30 min 时血糖水平相当, 统计学分析无显著性差异即 α- 糖苷酶抑制剂 GIB852 可以明显降低正常小鼠的餐后血糖水平, 且与现有上市药物的降血糖效果相当菌株为研究对象, 首先通过形态特征培养特征生理生化特征以及 16S rrna 序列的同源性分析等多项分类的方法, 将 PW0852 菌株确认为淡紫灰链霉菌随后, 在 10 L 发酵罐水平对菌株 PW0852 进行发酵培养, 从糖苷酶抑制剂的产生过程来看, 基本符合次级代谢产物的合成特征, 说明该糖苷酶抑制剂是菌株 PW0852 的次级代谢产物随后, 采用一系列膜过滤技术阳离子树脂吸附等方法, 从 PW0852 发酵液中分离获得混合型 α- 糖苷酶抑制剂 GIB852, 并从酶学水平考察了 GIB852 对人类胰腺 α- 淀粉酶和 α- 麦芽糖酶的抑制效果, 结果显示, GIB852 对人类胰腺 α- 淀粉酶和 α- 麦芽糖酶都有明显的抑制作用, 对麦芽糖酶的抑制性较强, 比同剂量的市售双糖酶抑制剂米格列醇的抑制性强 28.7 倍, 而对 α- 淀粉酶的抑制效果较弱最后, 通过小鼠糖耐量实验, 证实 GIB852 对餐后高血糖的形成有明显的改善作用由于淀粉酶抑制剂类药物的副作用较大, 因此开发对双糖酶抑制性强, 而对 α- 淀粉酶抑制性弱的糖苷酶抑制剂将具有更好的市场前景 [10] 本研究从该要求着手, 通过上述系列研究与分析, 获得了有效的双糖酶抑制剂 GIB852, 对餐后高血糖有显著的改善效果, 具有开发治疗糖尿病肥胖症药物的潜力, 也可应用于相应的功能性食品的制备, 改善病人生活质量, 具备社会效益和经济价值参考文献图 4 α- 糖苷酶抑制剂 GIB852 对正常小鼠糖耐量的影响 Fig. 4 Suppressive effect of GIB852 on postprandial blood glucose elevation Group in normal mice 3 讨论自从 1970 年从玫瑰产色链霉菌 R-468 的发酵液中发现 β- 糖苷酶抑制剂野尻霉素 (Nojirimycin) 以来, 研究者陆续又从放线菌发酵液中发现了 Acarbose Trestatins 等多种淀粉酶 ( 糖苷酶 ) 抑制剂产生这些抑制剂的微生物, 大多数属于链霉菌属, 还有些属于芽孢杆菌属游动放线菌属等 [9] 本研究以从土壤中分离得到的链霉菌 PW0852 [1] Kim YM, Wang MH, Rhee HI. A novel α-glucosidase inhibitor from pine bark. Carbohydr Rs, 2004(339): [2] Puls W. Pharmacology of glucosidase inhibitors. In Handbook of Experimental Pharmacology: Oral Antidiabetics, 1996(119): [3] Balfour JA, McTavish D. Acarbose: an update of its pharmcology and therapeutic use in diabetes mellitus. Drugs, 1993, 46(6): [4] 王家驰. 新一代 α- 葡萄糖苷酶抑制剂伏格列波糖 ( 倍欣 ). 中国糖尿病杂志, 1999, 7(2): [5] 钟倩. 米格列醇首次上市用于 Ⅱ 型糖尿病. 国外医药 - 合成药生化药制剂分册, 1998, 19(6): [6] 王卫东, 徐婷娟, 徐维平. α- 糖苷酶抑制剂和二甲双胍联用对 2 型糖尿病患者治疗效果的 Meta- 分析. 中国临

6 380 微生物学通报 2010, Vol.37, No.3 床保健杂志, 2008, 11(6): [7] Sumitani JI, Tsujimoto Y, Kawaguchi T, et al. Cloning and secretive expression of the gene encoding the proteinaceous α-amylase inhibitor paim from Streptomyces corchorusii. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2000, 90(2): [8] Zhang L, Liu CQ, Gao ZH, et al. Research on the lassification of Streptomyces strain ZG0429 and urification of streptavidin. Acta Microbiologica Sinica, 2007, 47(1): [9] 王晓婧, 薛仁风, 李梅, 等. 微生物源 α- 淀粉酶抑制剂研究进展. 生物技术通讯, 2009(7): [10] Kelley DE, Bidot P, Freedman Z, et al. Clinical efficacy of acarbose in diabetes mellitus: a critical review of controlled trials. Diabetes Metab, 1998, 21(12): 征稿简则 1 刊物简介与栏目设置微生物学通报是由中国科学院微生物研究所和中国微生物学会主办的, 以微生物学应用基础研究及技术创新与应用为主的综合性学术期刊刊登内容包括 : 工业微生物学海洋微生物学环境微生物学基础微生物学农业微生物学食品微生物学兽医微生物学药物微生物学医学微生物学病毒学酶工程发酵工程代谢工程等领域的最新研究成果, 产业化新技术和新进展, 以及微生物学教学研究和改革等设置的栏目有 : 研究报告专论与综述生物实验室 ( 原技术与方法 ) 高校教改纵横( 原高等院校教学 ) 名师名课( 原名师讲堂 ) 教学与科研成果展示显微世界专题专栏专家论坛书讯会讯等 2 投稿方式投稿时请登陆我刊主页, 点击作者投稿区, 第一次投稿请先注册, 获得用户名和密码, 然后依照提示提交稿件, 详见主页投稿征稿须知作者必须在网站投.doc 格式的电子稿, 图与文字编好页码图号后合成一个文件上传凡不符合 ( 投稿须知 ) 要求的文稿, 本部恕不受理 3 写作要求来稿要求论点明确, 数据可靠, 简明通顺, 重点突出 3.1 篇幅以 A4 纸 5 号字计算, 综述教学和方法类文章最好在 4 页以内, 研究报告 4 7 页 ( 以上均包括图表 ) 3.2 图表文中的图表须清晰简明, 文字叙述应避免与图表重复所有小图的宽度应小于 8 cm( 占半栏 ), 大图的宽度应小于 17 cm( 通栏 ) 3.3 参考文献及脚注参考文献按文内引用的先后顺序排序编码, 未公开发表的资料请勿引用我刊的参考文献需要注明著者 ( 文献作者不超过 3 人时全部列出, 多于 3 人时列出前 3 人, 后加等或 et al., 作者姓前名后, 名字之间用逗号隔开 ) 文献名刊名年卷期及页码国外期刊名可以缩写, 但必须标准, 不加缩写点, 斜体参考文献数量不限参考文献格式举例 : 期刊 : [1] 刘杰, 成子强, 史宣玲. SARS 冠状病毒 nsp14 基因的克隆和表达. 微生物学通报, 2007, 34(2): 1 3. [2] Kajiura H, Mori K, Tobimatsu T, et al. Characterization and mechanism of action of a reactivating factor for adenosylcobalamin-dependent glycerol dehydratase. J Biol Chem, 2001, 276(39): 图书 : [3] 钱存柔, 黄仪秀. 微生物实验教程. 北京 : 北京大学出版社, 2000: 4. [4] 董志扬, 张树政, 方宣钧, 等. 海藻的生物合成及抗逆机理 // 华珞等. 核农学进展. 北京 : 中国农业出版社, 1996: 脚注 ( 正文首页下方 ): 基金项目 : 基金项目 (No. ) * 通讯作者 Tel: ; Fax: ; 收稿日期 : ; 接受日期 : ( 下转 p.406)

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Microsoft Word tb 曹小芳.doc 微生物学通报 Microbiology China tongbao@im.ac.cn 研究报告 DEC 20, 2012, 39(12): 1762 1768 2012 by Institute of Microbiology, CAS 应用柱前衍生化高效液相色谱法开辟了一种简单快速的 DNJ 产生菌的筛选途径 * 曹小芳王利强白芳白钢 ( 南开大学药学院天津市分子药物研究重点实验室天津 300071)