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放竦吴
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1 中国农学通报 22,28(6):7-2 Chinese Agricultural Science Bulletin 响应曲面法优化罗布麻愈伤组织中绿原酸的提取工艺邓倩, 王芳, 刘小锐, 计巧灵 ( 新疆大学生命科学与技术学院新疆, 乌鲁木齐 846) 摘要 : 通过优化罗布麻愈伤组织中绿原酸的提取工艺, 为进一步探索规模化提取罗布麻愈伤组织中的绿原酸奠定前期工作基础以罗布麻愈伤组织中绿原酸得率为指标, 通过 HPLC 法测定并比较, 得出最佳提取方法 ; 在单因素试验的基础上, 结合响应曲面法优化提取绿原酸的工艺从罗布麻愈伤组织中提取绿原酸的最佳方法是超声波辅助提取法 ; 在单因素试验的基础上, 结合响应曲面法优化超声波辅助提取绿原酸的最佳工艺条件为 : 提取时间 4 min, 提取功率 4 W, 料液比 :4, 绿原酸最高得率为.49 mg/g, 提取时间和提取功率的交互作用对得率有显著影响建立的二次多项式数学模型对从罗布麻愈伤组织中提取绿原酸具有重要的指导作用关键词 : 罗布麻愈伤组织 ; 绿原酸 ; 提取工艺 ; 响应曲面法中图分类号 :Q8. 文献标志码 :A 论文编号 : RSM in Extraction Process Optimization for Yield of Chlorogenic Acid in Callus of Apocynum venetum Deng Qian, Wang Fang, Liu Xiaorui, Ji Qiaoling (College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 846) Abstract: RSM in extraction process optimization for yield of chlorogenic acid (CGA) in callus of Apocynum venetum, the results laid the foundation for further exploration of extracting CGA in the callus on large scale. The yield of CGA was taken as the index, CGA yields in the callus were determined with HPLC and compared, the optimum extraction process was determined. On the basis of single factor analysis test, combined with central composite experimental design principle, response surface methodology (RSM) was used to optimize extraction process. The optimum extraction method from callus of A. venetum was microwave-assisted extraction. On the basis of single factor analysis test, experiments were carried out and combined with RSM, the optimum microwave-assisted extraction process was as follows: extraction time 4 min, extraction power 4 W, ratio of solid to liquid :4, the CGA maximum yield reached.49 mg/g, interaction between extraction time and extraction power had a significant impact. Establishment of the two polynomial mathematical models had the important role for CGA extraction from callus of A. venetum. Key words: callus of Apocynum venetum L.; chlorogenic acid; extraction process; response surface methodology 引言罗布麻全草入药, 作为药材历史悠久, 目前收载入 [-2] 25 2 年的中华人民共和国药典之中此 [] 外, 它还具有较高的生态价值和经济价值但近年报道罗布麻资源已匮乏 [4] 利用组织培养法生产重要的药效成份已成为天然药物生产的研究热点, 它具有代替原植物获得有效成份, 并可能高产的优点 978 [5] 年郑光植等在国际会议上提出了植物细胞有次级基金项目 : 国家自然科学基金项目亚麻与罗布麻体细胞杂交及其种质的耐盐性遗传研究 (6695) 第一作者简介 : 邓倩, 女,988 年出生, 在读硕士生, 研究方向 : 植物生物技术通信地址 :846 新疆大学胜利路 4 号生命科学与技术学院, @qq.com 通讯作者 : 计巧灵, 女,956 年出生, 安徽人, 教授, 硕士, 研究方向 : 植物生物技术通信地址 :846 新疆大学胜利路 4 号生命科学与技术学院, wji8@6.com 收稿日期 :22-5-2, 修回日期 :

化提取绿原酸的工艺从罗布麻愈伤组织中提取绿原酸的最佳方法是超声波辅助提取法 ; 在单因素试验的基础上, 结合响应曲面法优化超声波辅助提取绿原酸的最佳工艺条件为 : 提取时间 4 min, 提取功率 4 W, 料液比 :4, 绿原酸最

2 8 中国农学通报代谢的全能性的观点, 目前运用组织培养技术获得有效成分成功的药用植物已有几十种, 该技术是解决天然药用植物资源匮乏活性成分低或不稳定等问题的有效途径之一 [6] 绿原酸 (Chlorogenic acid,cga), 又名咖啡鞣酸, 是咖啡酸与奎尼酸的缩酚酸 [7], 常以羟基桂皮酸酯的形式广泛存在植物中, 是莽草酸途径的产物从 Kim [8] 等报道的罗布麻叶水提物及其成分对 Cu 2+ 诱导的低密度脂蛋白氧化的抑制作用表明, 罗布麻叶中的绿原酸抗氧化作用最强绿原酸除了具有强抗氧化能力 [9-] [-2] [-4] [5] 外, 还具有抗病毒降脂抗癌和抗肿瘤等疗效, 目前中国抑菌抗病毒药物的质量标准主要以绿 [9,6] [7] 原酸含量为主 Wang 等报道了杜仲悬浮培养物 [8] 中绿原酸的积累 ; 王亚琴等也对杜仲悬浮细胞产绿 [9-2] 原酸进行了初步研究在前期工作的基础上, 笔者通过响应曲面法优化了从罗布麻愈伤组织提取 CGA 的方法, 旨在为进一步探索规模化提取罗布麻愈伤组织中的绿原酸奠定前期工作基础材料与方法. 仪器与试药高效液相色谱仪 ( 日本岛津公司 )LC-A (LC-ATVP 泵,SPD-AVP 紫外检测器, CTO-AVP 柱温箱,2 化学工作站 );.22 μm 有机微孔纤维素滤膜 ( 上海兴亚公司 ); 减压浓缩装置 ; 紫外可见分光光度计 (UV-, 中国莱伯泰公司 ); 紫外透射反射仪 (WD-94C 型, 北京沃德生物医学仪器公司 ); 超声波细胞粉碎机 (JY-92D 型, 宁波新芝生物科技有限股份公司 ); 试验室常规仪器设备甲醇冰醋酸无水甲醇乙酸乙酯无水乙醇 ( 甲醇为色谱纯, 其余试剂与药品均为分析纯 ) 绿原酸标准品 ( 色谱纯 ) 购自南京青泽医药科技开发有限公司.2 材料用罗布麻无菌苗的下胚轴作外植体, 在 MB+6-BA (.5 mg/l)+naa(.5 mg/l)+ 蔗糖 g/l+ 琼脂 7 g/l 的培养基上诱导出愈伤组织, 并进行固体继代扩增, 继代周期为天将得到的一部分愈伤组织在常温下晾干, 用研钵研成粉, 过 4 目筛, 作为优化提取工艺的材料 ; 另一部分愈伤组织继续继代扩增. 方法.. 最佳提取方法的选择对愈伤组织粉末分别采用 [2] [22] [2] 超声波法索氏提取法和水提醇沉法提取绿原酸, 选出最佳的提取方法..2 对照品吸收峰值的确定精密称取绿原酸对照品. mg, 用甲醇溶解 ; 定容至 ml, 在紫外可见分光光度计下扫描, 由此确定绿原酸的最大吸收峰值.. 高效液相色谱条件绿原酸测定采用色谱柱 : Cl mm( 日本岛津公司 ); 流动相为甲醇 :% 冰乙酸 =4:6; 流速为.6 ml/min; 进样量为 2 μl; 柱温为室温 ; 检测系统为紫外检测器 ; 检测波长为确定的绿原酸最大吸收峰值..4 绿原酸标准曲线的绘制及线性关系的考察精密称取绿原酸对照品. mg, 用 8% 甲醇溶解, 定容至 5 ml, 浓度为.6 mg/ml 标准品溶液分别精确吸取绿原酸标准品 ml, 用 8% 甲醇定容至 ml, 分别用.22 μm 孔径滤膜过滤后, 取 2 μl 进样, 用高效液相色谱仪测定峰面积值..5 方法学考察 () 精密度试验将绿原酸对照品溶液 ( 浓度为 6 μg/ml) 连续进样 5 次, 每次 2 μl, 按色谱条件测定峰面积值 (2) 稳定性试验按最优提取工艺制备供试品溶液, 分别在 h 进样测定 () 重复性试验精确称取 5 份同种样品各. g, 按最优提取工艺制备 5 份供试溶液, 分别按色谱条件测定绿原酸含量 (4) 加样回收率试验精密称取 5 份已知绿原酸含量的样品各. g, 分别精确加入绿原酸对照品. mg, 按最优提取工艺制备 5 份供试溶液, 分别取 2 μl 进样测定..6 HPLC 检测将标准溶液按上述色谱条件进行测定, 确定绿原酸的保留时间, 作为供试品的参照用同样的色谱条件测定供试溶液..7 最佳提取工艺的优化设置最佳提取方法的影响因素和水平, 通过响应曲面法优化, 筛选绿原酸含量最高的提取条件 2 结果与分析 2. 绿原酸最佳提取方法的确定从比较种方法提取绿原酸的结果看出, 超声波法提取愈伤组织粉末中绿原酸的得率最高, 且方法简便因此之后的试验均采用超声波法提取 CGA 2.2 对照品最大吸收峰值和溶液的线性关系对照品绿原酸的最大吸收峰值为 28 nm 以绿原酸标准品浓度为横坐标, 峰面积为纵坐标, 得回归方程 :Y=7258X-225,r=.9999 绿原酸在 ~ 5 μg/ml 范围内均呈良好的线性关系 2. 方法学考察结果精密度试验结果表明, 相对标准偏差 RSD=.97%, 说明本法在此条件下精密度良好 ; 稳定性试验

啡酸与奎尼酸的缩酚酸 [7], 常以羟基桂皮酸酯的形式广泛存在植物中, 是莽草酸途径的产物从 Kim [8] 等报道的罗布麻叶水提物及其成分对 Cu 2+ 诱导的低密度脂蛋白氧化的抑制作用表明, 罗布麻叶中的绿原酸抗氧化作用最强绿

3 邓倩等 : 响应曲面法优化罗布麻愈伤组织中绿原酸的提取工艺 9 结果测得, 绿原酸峰面积的 RSD=.% (n=6), 说明供试品溶液在 2 h 内稳定 ; 重复性试验结果,RSD=.5% (n=5), 说明重现性良好 ; 加样回收率试验结果, 绿原酸的平均回收率为 96.%,RSD=.44%, 说明该法适宜于罗布麻愈伤组织中绿原酸含量的测定 2.4 绿原酸标准品和供试品的 HPLC 检测图从图中可知绿原酸标准品的保留时间为 min, 从供试液色谱图 2 中可知, 图中出现有 2 个峰, 保留时间分别为.24 min 和 5. min, 从保留时间为 5. min 的峰可判定供试液中含有绿原酸电压值 /mv 保留时间 /min 图绿原酸标准品色谱图电压值 /mv 保留时间 /min 图 2 样品中绿原酸的色谱图 2.5 响应曲面法确定的罗布麻愈伤组织中绿原酸最佳.44 mg/g; 超声提取的最佳料液比为 :4, 绿原酸含提取工艺量为.466 mg/g 2.5. 单因素试验设计试验分成个组号, 详细情况响应面因素水平设计及结果分析利用见表 Minitab5 软件, 根据 Box-Behnken 的中心组合设计原 [24] 单因子试验结果 ( 图 ~5) 显示, 超声提取的最佳时理, 以提取时间 (A), 超声功率 (B), 料液比 (C) 个因间为 min, 提取的绿原酸含量最高为.46 mg/g 子为自变量, 以绿原酸的得率为响应值, 设计三因素三超声提取的最佳功率为 8 W, 绿原酸含量为水平共 5 个试验点的响应面分析试验 ( 表 2)

262 min, 从供试液色谱图 2 中可知, 图中出现有 2 个峰, 保留时间分别为.24 min 和 5. min, 从保留时间为 5.

4 中国农学通报表单因素试验设计试验提取条件组号提取时间 /min 提取功率 /W 料液比 (W/L) 提取试剂,2,,4,5,6 8 :4 8% 甲醇 2 4,8,2,6,2 :4 8% 甲醇 8 :2,:,:4,:5,:6 8% 甲醇注 : 试验 2 依次进行绿原酸含量绿原酸含量超声时间图超声时间对绿原酸含量的影响图 5 料液比对绿原酸含量的影响物料比表 2 响应面分析因子及水平表水平提取时间 (A)/min 超声功率 (B)/W 料液比 (C) 绿原酸含量超声功率图 4 超声功率对绿原酸含量的影响根据表结果, 采用 Minitab5 软件进行模拟回归分析, 得到绿原酸提取率对超声时间 (A) 超声功率 (B) 液料比 (C) 的二次多项式回归方程 : 从表可看出, 提取时间 4 min, 提取功率 4 W, 料液比 :4 的提取条件下提取得到的绿原酸含量最高达到.49 mg/g - 对该回归模型进行方差分析, 结果见表 4 由表 4 可知, 失拟项 P=.276>.5, 说明在 P=.5 水平上预测值与实测值的差异不显著, 模型拟合情况良好从表 5 看出, 超声时间和超声功率的交互作用对绿原酸得率有显著的影响 (P<.5), 其余项影响不显著对绿原酸含量影响程度由大到小依次为 : 超声时间 > 料液比 > 超声功率讨论 2 4 本研究首次利用响应曲面法 (RSM) 对罗布麻愈伤 [7] 组织中绿原酸的提取工艺进行了优化,Wang 等研究表明, 运用响应曲面法提取杜仲悬浮细胞中的绿原酸得率为 2.5 mg/g, 与原植物中绿原酸得率相近本室 [9] 已多年从事罗布麻组织和细胞培养, 刘小锐等用改良的索氏提取法提取罗布麻愈伤组织中的绿原酸, 得 [2] 率为.6249 mg/g, 高小艳等采用超声波辅助提取法从罗布麻悬浮细胞中提取绿原酸, 得率为 : :4 :5

间对绿原酸含量的影响图 5 料液比对绿原酸含量的影响物料比表 2 响应面分析因子及水平表水平提取时间 (A)/min 超声功率 (B)/W 料液比 (C) 绿原酸含量超声功率图 4 超声功率对绿原酸含量的影响根据表结果, 采用 Minitab5 软件

5 邓倩等 : 响应曲面法优化罗布麻愈伤组织中绿原酸的提取工艺运行序号来源回归表试验设计及绿原酸含量绿原酸含量 /(mg/g) A B C 预测值实测值表 4 回归模型的方差分析表平方和自由度 (DF) (SS) 9.42 均方 (MS) F 值 P 值的最佳得率为.49 mg/g, 远高于前期从培养物中绿原酸的得率, 也远高于原植物叶中绿原酸的得率 (.22 mg/g) 说明在提取工艺的优化上, 用响应曲面法比常规的正交设计法更优越传统的正交设计法同时考虑多种因素水平, 寻求最佳因素水平组合, 但不能在给定的整个区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式响应面分析法是通过中心组合试验设计对几种因素及其交互作用的一种回归分析法, 具有试验次数少周期短求得的回归方程精度高等优点随着计算机技术的发展, 这种方法已成为精度高应用广并具有实用生产指导作用的技术 4 结论在单因子试验的基础上, 用 Box-Benhnken 的中心组合试验设计试验, 用响应面法优化以及 Minitab5 软件分析, 以罗布麻愈伤组织中的绿原酸含量为响应值, 以提取时间超声功率和料液比为考察因素, 建立了二次多项式数学模型, 并对该模型进行了显著性检验, 确定了绿原酸最佳提取工艺为 : 超声波辅助提取时间 4 min 提取功率 4 W 料液比 :4, 在此条件下绿原酸得率为.49 mg/g 该模型对进一步从罗布麻培养物中规模化提取绿原酸的实际生产具有重要的指导作用线性平方交互作用残差误差失拟纯误差合计项常量 A B C A 2 B 2 C 2 AB AC BC 表 5 二次模型回归方程系数显著性检验系数系数标准误 T P mg/g, 笔者运用响应曲面法优化了超声波辅助提取绿原酸的工艺, 从罗布麻愈伤组织中得到绿原酸参考文献 [] 张卫明, 肖正春, 顾龚平, 等. 罗布麻资源利用与罗布麻植物分类问题 [J]. 中国野生植物资源,26,25(2):5-9. [2] 杨志芳, 王维娜, 杨冲, 等. 正交设计优选罗布麻叶中总黄酮提取工艺 [J]. 中草药,26,7(8): [] 王宁, 陈斌. 柴达木盆地资源植物罗布麻的开发利用 [J]. 青海科技, 25(6):5-6. [4] 徐红. 新疆罗布麻品种特点及开发 [J]. 新纺织,25(8):5-9. [5] 罗玉. 利用毛状根的培养生产植物次生代谢物 [J]. 云南农业科技, 2(2):4-42. [6] 李品, 岳彩鹏, 王新建, 等. 植物细胞培养生产次生代谢物的影响因素 [J]. 河南林业科技,27,27():2-2. [7] 吴卫华, 康桢, 欧阳冬生, 等. 绿原酸的药理学研究进展 [J]. 天然产物研究与开发,26(8): [8] Kim D W, Yokozawa T, Hattori M, et al. Inhibitory effects of an aqueous extract of Apocyum venetum leaves and its constituents on Cu induced oxidative modification of low density lipoprotein[j]. Phytother Res,2,4(7):5-54. [9] 胡克杰, 孙考祥, 王埽璐, 等. 氯原酸体外抗病毒作用研究 [J]. 哈尔滨医科大学学报,2,5(6):4-4. [] Chiang L C, Chiang W, Chang M Y, et al. Antiviral activity of plantago major extracts and related compounds in vitro[j]. Antiviral Res,22(55):5-62. [] Shimizu M, Yoshimi N, Yamada Y, et al. Suppressive effects of

49 mg/g, 远高于前期从培养物中绿原酸的得率, 也远高于原植物叶中绿原酸的得率 (.

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: 307, [], [2],,,, [3] (Response Surface Methodology, RSA),,, [4,5] Design-Expert 6.0,,,, [6] VPJ33 ph 3,, ph, OD, Design-Expert 6.0 Box-Behnken, VPJ3

: 307, [], [2],,,, [3] (Response Surface Methodology, RSA),,, [4,5] Design-Expert 6.0,,,, [6] VPJ33 ph 3,, ph, OD, Design-Expert 6.0 Box-Behnken, VPJ3 微生物学通报 FEB 20, 2008, 35(2) 306~30 Microbiology 2008 by Institute of Microbiology, CAS tongbao@im.ac.cn 生物实验室响应面分析法优化副溶血性弧菌生长条件刘代新宁喜斌 * 张继伦 2 (. 200090) (2. 20202) 摘要