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1 微 生 物 学 通 报 Microbiology China 研 究 报 告 Jan. 20, 2015, 42(1): by Institute of Microbiology, CAS DOI: /j.microbiol.china 生 长 速 度 快 且 油 脂 产 率 高 的 湛 江 等 鞭 金 藻 诱 变 株 的 筛 选 * 艾 江 宁 姚 长 洪 孟 迎 迎 褚 亚 东 曹 旭 鹏 薛 松 ( 中 国 科 学 院 大 连 化 学 物 理 研 究 所 海 洋 生 物 工 程 组 辽 宁 大 连 ) 摘 要 : 目 的 筛 选 生 长 速 度 快 的 高 产 油 湛 江 等 鞭 金 藻 诱 变 株 方 法 利 用 常 压 室 温 等 离 子 体 射 流 诱 变 技 术 对 湛 江 等 鞭 金 藻 进 行 诱 变, 通 过 96 孔 板 摇 瓶 和 反 应 器 培 养 对 诱 变 株 进 行 筛 选 结 果 传 至 第 13 代,600 ml 反 应 器 培 养 7 d, 诱 变 株 IM 最 大 比 生 长 速 率 细 胞 密 度 和 油 脂 产 率 可 分 别 达 0.72 d cells/ml mg/(l d), 分 别 比 野 生 株 提 高 12.5% 20.8% 和 17.9% 结 论 获 得 了 一 株 生 长 速 度 快 且 油 脂 产 率 高 的 诱 变 株 IM110020, 且 经 过 多 次 传 代 性 质 稳 定 关 键 词 : 常 压 室 温 等 离 子 体, 湛 江 等 鞭 金 藻, 生 长 速 率, 油 脂 产 率 Screening of fast growth and high oil productivity mutants of Isochrysis zhangjiangensis AI Jiang-Ning YAO Chang-Hong MENG Ying-Ying CHU Ya-Dong CAO Xu-Peng XUE Song * (Marine Bioengineering Group, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian, Liaoning , China) Abstract: [Objective] Mutants of Isochrysis zhangjiangensis were screened for fast growth and high oil productivity. [Methods] Atmospheric and room temperature plasma jet mutation technique was used to mutate I. zhangjiangensis, and mutants were screened by different cultivation volume such as 96-well plates, flasks and bioreactors culture. [Results] After thirteen times passaged, mutant IM was cultivated for 7 days in 600 ml bioreactor for evaluation. The maximum specific growth rate, cell density and lipid productivity could reach up to 0.72 d 1, cells/ml and mg/(l d), respectively, which were 12.5%, 20.8% and 17.9% better than those of the wild strain correspondingly. [Conclusion] We obtained a mutant IM with fast growth and high oil productivity, and the properties were stable after thirteen passages. Keywords: Atmospheric and room temperature plasma, Isochrysis zhangjiangensis, Growth rate, Oil productivity 基 金 项 目 : 国 家 863 计 划 项 目 (No. 2012AA052101); 辽 宁 省 自 然 科 学 基 金 项 目 (No ); 中 化 集 团 科 技 项 目 ; 中 国 科 学 院 知 识 创 新 工 程 领 域 前 沿 项 目 (No. S201122) * 通 讯 作 者 :Tel: ; :xuesong@dicp.ac.cn 收 稿 日 期 : ; 接 受 日 期 : ; 优 先 数 字 出 版 日 期 (

2 艾 江 宁 等 : 生 长 速 度 快 且 油 脂 产 率 高 的 湛 江 等 鞭 金 藻 诱 变 株 的 筛 选 143 在 当 今 石 油 资 源 供 应 紧 张 和 环 境 恶 化 的 时 代, 可 再 生 性 的 生 物 质 能 越 来 越 受 关 注 预 计 10 年 后, 全 球 总 能 耗 将 有 20% 来 自 生 物 质 [1-2] 利 用 微 藻 生 产 生 物 柴 油 是 解 决 能 源 短 缺 的 途 径 之 一 微 藻 是 光 合 自 养 的 单 细 胞 微 生 物, 是 在 自 然 界 中 分 布 最 广 种 类 和 数 量 最 大 的 生 物 资 源 [3] 利 用 微 藻 生 产 油 脂 有 以 下 优 点 : 生 长 周 期 短, 不 占 用 耕 地, 生 物 产 量 高, 单 位 面 积 油 产 量 是 油 料 植 物 油 产 量 的 数 十 倍 [4] 正 常 生 长 条 件 下 的 微 藻 油 脂 含 量 仅 为 5% 35% [5], 大 多 数 微 藻 是 在 氮 缺 失 培 养 条 件 下 积 累 油 脂, 与 此 同 时 也 抑 制 了 藻 细 胞 的 生 长, 对 于 以 获 得 高 产 油 脂 为 目 的 的 微 藻 培 养 来 说, 提 高 生 物 量 和 提 高 细 胞 内 油 脂 含 量 是 同 等 重 要 的 现 有 的 培 养 方 式 是 以 两 步 法 实 现 的, 即 先 以 最 适 宜 细 胞 生 长 条 件 培 养, 然 后 在 氮 缺 失 的 培 养 条 件 下 诱 导 油 脂 积 累 [6-7] 为 提 高 微 藻 产 油 能 力, 对 微 藻 的 改 造 至 少 可 从 以 下 三 方 面 进 行 : 一 是 加 快 微 藻 的 生 长 速 度 ; 二 是 提 高 微 藻 的 光 合 效 率 ; 三 是 增 加 微 藻 含 油 量 [8] 因 此, 筛 选 油 脂 产 率 高 的 藻 株, 即 在 油 脂 含 量 不 变, 筛 选 生 长 更 快 的 藻 株, 是 整 体 提 高 油 脂 产 率 的 又 一 手 段 常 压 室 温 等 离 子 体 (ARTP) 是 近 几 年 发 展 起 来 的 一 种 新 的 等 离 子 体 源, 能 够 在 常 压 温 度 在 C 之 间 产 生 具 有 高 活 性 粒 子 ( 如 处 于 激 发 态 的 氦 原 子 氧 原 子 氮 原 子 OH 自 由 基 等 ) 浓 度 的 等 离 子 体 射 流 [9-10] 科 学 研 究 表 明, 等 离 子 体 中 适 当 剂 量 的 活 性 粒 子 作 用 于 微 生 物, 能 够 使 微 生 物 细 胞 壁 / 膜 的 结 构 及 通 透 性 和 DNA 损 伤 修 复 能 力 改 变, 导 致 微 生 物 产 生 致 畸 突 变, 进 而 使 微 生 物 基 因 序 列 及 其 代 谢 网 络 显 著 变 化, 最 终 导 致 微 生 物 产 生 致 畸 突 变 [11] 理 论 上, 通 过 控 制 产 生 的 等 离 子 体 射 流 强 度, 能 够 切 开 任 何 一 个 DNA 碱 基, 从 而 产 生 多 样 性 大 的 突 变 库, 一 次 操 作 可 以 形 成 4 10 万 个 突 变 体, 结 合 高 通 量 筛 选 可 以 方 便 的 定 向 获 得 目 标 突 变 株, 这 是 生 物 诱 变 化 学 诱 变 和 物 理 诱 变 所 无 法 比 拟 的, 而 且 生 物 诱 变 及 化 学 诱 变 过 程 有 有 毒 有 害 物 质 参 与, 对 环 境 有 污 染 ; 紫 外 诱 变 射 线 太 空 诱 变 离 子 束 注 入 等 物 理 诱 变 作 用 时 间 较 长, 所 需 样 品 的 剂 量 比 较 大 [12-13] 钝 顶 螺 旋 藻 在 亚 硝 基 胍 处 理 下 比 对 照 株 耐 受 3 倍, 但 是 生 长 并 没 有 增 加 [14] Lanfaloni 等 用 UV 及 N- 甲 基 -N - 硝 基 -N- 亚 硝 基 胍 处 理 的 钝 顶 螺 旋 藻 没 有 得 到 理 想 的 诱 变 株 [15] Fang 等 用 ARTP 处 理 钝 顶 螺 旋 藻, 使 其 碳 水 化 合 物 的 生 产 能 力 提 高 78% [16] ARTP 具 有 射 流 温 度 低 产 生 的 等 离 子 体 均 匀 无 需 真 空 装 置 操 作 简 易 成 本 低 与 生 物 大 分 子 和 细 胞 作 用 明 显 等 优 点, 已 成 为 快 速 突 变 微 生 物 基 因 组 的 有 效 方 法 [16] 金 藻 已 被 公 认 为 是 产 油 微 藻, 未 调 控 自 养 培 养 时 油 脂 含 量 平 均 为 27.1%, 而 含 油 绿 藻 平 均 总 脂 含 量 为 25.5%, 含 油 硅 藻 平 均 总 脂 含 量 仅 为 22.7% [17] 本 研 究 利 用 新 型 ARTP 育 种 方 法 诱 变 湛 江 等 鞭 金 藻, 通 过 固 体 平 板 96 孔 板 快 速 筛 选 及 摇 瓶 初 筛, 建 立 诱 变 株 筛 选 方 法, 并 通 过 柱 状 鼓 泡 式 反 应 器 培 养 研 究 诱 变 株 生 长 特 性 旨 在 获 得 油 脂 含 量 不 变 生 长 速 度 快 的 藻 株, 为 利 用 光 合 生 物 反 应 器 进 行 大 规 模 培 养 提 供 重 要 的 种 质 资 源 1 材 料 与 方 法 1.1 藻 种 及 诱 变 方 法 实 验 藻 种 : 野 生 型 湛 江 等 鞭 金 藻 (Isochrysis zhangjiangensis), 保 藏 于 中 国 科 学 院 淡 水 藻 种 库, 保 藏 编 号 为 FACHB-1750 诱 变 方 法 : 利 用 清 华 大 学 化 学 工 程 与 工 程 物 理 系 联 合 研 制 的 常 压 室 温 等 离 子 体 育 种 机 (ARTP) 进 行 湛 江 等 鞭 金 藻 的 诱 变 [11,16] 在 电 源 输 出 功 率 为 100 W 工 作 气 流 量 为 10 SLM 等 离 子 体 发 射 源 与 样 品 之 间 距 离 为 2 mm 的 条 件 下, 诱 变 主 要 的 可 变 操 作 参 数 是 处 理 时 间 为 了 寻 找 最 佳 诱 变 条 件, 首 先 需 要 得 到 致 死 率 曲 线 因 此 处 理 时 间 从 10 s 开 始, 以 5 s 为 间 隔, 依 次 增 加 至 30 s 然 后 将 处 理 的 藻 细 胞 稀 释 涂 平 板, 计 算 致 死 率 1.2 培 养 基 将 过 滤 后 的 天 然 海 水 于 Pa 灭 菌 15 min, [18] 冷 却 至 室 温 后 添 加 营 养 盐, 配 制 f/2 培 养 基 为 基 础 培 养 基

3 144 微 生 物 学 通 报 Microbiol. China 2015, Vol.42, No 培 养 及 筛 选 方 法 固 体 平 板 : 经 ARTP 诱 变 后 的 全 部 藻 液, 用 800 μl 培 养 基 洗 至 1.5 ml EP 管 中, 避 光 3 h 以 避 免 光 修 复, 稀 释 一 定 浓 度 涂 于 平 板 培 养, 于 光 照 强 度 20 μmol/(m 2 s), 温 度 为 25±1 C 的 光 照 培 养 箱 中 培 养 待 长 出 藻 落 较 大 或 者 颜 色 较 浅 的 单 藻 落 96 孔 板 : 每 孔 加 入 200 μl f/2 培 养 基, 挑 入 从 固 体 平 板 已 选 出 的 单 藻 落, 于 光 照 强 度 20 μmol/(m 2 s) 温 度 为 25±1 C 的 光 照 培 养 箱 中 培 养 每 天 取 样 进 行 细 胞 密 度 测 定, 最 大 比 生 长 速 率 大 于 野 生 株 5% 的 藻 株, 即 为 生 长 速 度 快 的 诱 变 株 100 ml 摇 瓶 : 将 96 孔 板 选 出 的 生 长 速 度 快 的 诱 变 株 转 移 至 100 ml 摇 瓶 中 培 养, 以 相 同 的 初 始 密 度 接 种, 每 瓶 加 入 30 ml f/2 培 养 基, 隔 天 取 样 进 行 细 胞 密 度 测 定, 并 计 算 最 大 比 生 长 速 率, 其 值 高 于 野 生 株 5% 即 为 生 长 速 度 快 的 诱 变 株 600 ml 反 应 器 培 养 :600 ml 柱 状 鼓 泡 式 反 应 器 [18], 培 养 体 积 为 500 ml, 日 光 灯 作 光 源, 单 侧 平 均 光 强 为 200 μmol/(m 2 s), 光 暗 周 期 比 为 14 h: 10 h 通 入 2% CO 2, 通 气 速 率 为 0.4 L/min, 接 种 初 始 密 度 约 为 cells/ml, 培 养 温 度 为 25±1 C 每 天 加 入 75 mg/l 的 NaNO 3,NaH 2 PO 4 和 培 养 基 的 其 他 成 分 每 3 d 添 加 一 次 每 天 取 样 测 定 细 胞 密 度, 培 养 结 束 时 收 获 藻 细 胞, 进 行 油 脂 含 量 测 定 1.4 分 析 方 法 致 死 率 : 将 ARTP 诱 变 后 涂 于 平 板 上 长 出 的 藻 落 计 数, 致 死 率 计 算 公 式 为 : 致 死 率 (%)=(1 处 理 组 存 活 细 胞 数 / 野 生 株 组 细 胞 数 ) 细 胞 密 度 测 定 :96 孔 板 及 100 ml 摇 瓶 培 养 的 细 胞 密 度 是 通 过 酶 标 仪 测 定 藻 液 在 655 nm 处 的 吸 光 度 值 (OD 655 ), 并 在 光 学 显 微 镜 (Olympus BH-2 显 微 镜 ) 下 用 血 球 计 数 板 计 数 微 藻 个 数, 建 立 微 藻 细 胞 数 与 吸 光 度 的 标 准 曲 线, 在 一 定 范 围 内, 可 用 OD 655 代 替 细 胞 数 进 行 细 胞 生 长 的 表 征 湛 江 等 鞭 金 藻 标 准 曲 线 方 程 如 下 : y=663.03x ,R²= 式 中 x 为 藻 的 吸 光 度 值 OD 655,y 为 藻 细 胞 密 度 ( 10 4 cells/ml) 600 ml 反 应 器 培 养 的 细 胞 密 度 是 直 接 用 血 球 计 数 板 计 数 微 藻 个 数 比 生 长 速 率 : 公 式 为 :μ=(lnnt 2 lnnt 1 )/(t 2 t 1 ) 其 中 μ 为 比 生 长 速 率,Nt 2 为 t 2 天 时 藻 液 的 细 胞 密 度,Nt 1 为 t 1 天 时 藻 液 的 细 胞 密 度 细 胞 干 重 : 取 5 ml 藻 液 过 滤 于 预 先 干 燥 称 重 的 Whatman GF/C 纤 维 膜, 再 用 0.5 mol/l 碳 酸 氢 铵 洗 涤 两 遍, 烘 干 至 恒 重 油 脂 含 量 测 定 : 油 脂 含 量 (%)=( 油 脂 质 量 / 干 藻 粉 质 量 ) 100 ( 油 脂 提 取 : 氯 仿 甲 醇 水 法 ) [19-20] 2 结 果 与 讨 论 2.1 致 死 率 曲 线 等 离 子 体 对 湛 江 等 鞭 金 藻 细 胞 具 有 较 强 的 杀 伤 力, 经 ARTP 处 理 20 s, 致 死 率 可 达 90.8%; 处 理 25 s, 致 死 率 达 99%; 处 理 30 s, 致 死 率 达 100%, 如 图 1 所 示 突 变 本 身 具 有 随 机 性, 其 致 死 率 与 突 变 结 果 之 间 没 有 确 定 的 联 系 本 实 验 选 择 致 死 率 99% 的 条 件 进 行 诱 导, 即 每 次 诱 变 选 择 诱 变 时 间 为 25 s 2.2 湛 江 等 鞭 金 藻 诱 变 株 的 快 速 筛 选 将 经 ARTP 处 理 25 s 的 金 藻 按 个 藻 细 胞 涂 于 琼 脂 平 板 培 养 基 上, 每 个 平 板 能 长 出 100 个 左 右 的 单 藻 落, 待 长 出 7 d 后, 将 藻 落 转 入 至 96 孔 板 中, 每 孔 加 入 f/2 培 养 基 200 μl 培 养 每 天 将 96 孔 板 放 入 酶 标 仪 中 读 取 各 孔 的 OD 值, 计 算 最 大 比 生 长 速 率 图 1 湛 江 等 鞭 金 藻 的 致 死 率 曲 线 Figure 1 The lethal rate curve of I. zhangjiangensis

4 艾 江 宁 等 : 生 长 速 度 快 且 油 脂 产 率 高 的 湛 江 等 鞭 金 藻 诱 变 株 的 筛 选 145 图 2 为 诱 变 株 相 对 于 野 生 株 的 相 对 增 殖 速 度 以 野 生 株 增 殖 速 度 为 标 准, 有 11 株 生 长 速 率 超 过 野 生 株 的 5% 以 上, 其 中 有 6 株 诱 变 株 IM IM IM IM IM 和 IM 的 增 殖 速 度 达 到 野 生 株 的 1.2 倍 以 上 将 生 长 速 度 快 的 11 株 诱 变 株 其 转 入 100 ml 摇 瓶 进 行 培 养 筛 选 图 2 野 生 株 和 28 株 诱 变 株 的 相 对 增 殖 速 率 Figure 2 Wild strain and 28 mutant strains of relative growth rate 注 : 实 线 为 野 生 株 的 相 对 增 殖 速 率, 虚 线 为 增 殖 速 度 达 到 野 生 株 1.2 倍 的 位 置. Note: The solid line is the relative proliferation rate of wild strain, the dotted line is 1.2 times as much as the wild strain. 2.3 湛 江 等 鞭 金 藻 诱 变 株 的 初 筛 为 了 小 规 模 的 评 估 诱 变 株 的 特 性, 在 100 ml 摇 瓶 中 培 养 并 测 定 生 物 量, 最 大 比 生 长 速 率 见 表 1 最 大 比 生 长 速 率 用 来 评 价 藻 细 胞 的 生 长 能 力, 客 观 反 映 藻 株 在 一 个 生 长 周 期 内 的 实 际 生 长 潜 能 通 过 比 较 最 大 比 生 长 速 率, 诱 变 株 IM 和 IM 的 最 大 比 生 长 速 率 分 别 高 于 野 生 株 20.5% 和 8.0%, 其 他 诱 变 株 均 低 于 野 生 株 2.4 湛 江 等 鞭 金 藻 诱 变 株 的 反 应 器 培 养 特 性 将 诱 变 株 IM 和 IM 扩 大 至 3 L 摇 瓶 作 为 藻 种, 进 一 步 评 估 诱 变 株 的 生 长 及 产 油 特 性 诱 变 株 IM 传 至 第 5 代 时 细 胞 死 亡 诱 变 株 IM 连 续 传 代 至 第 13 代, 在 第 7 代 和 第 13 代 分 别 接 入 600 ml 管 式 反 应 器 进 行 培 养 评 估, 以 考 察 传 代 多 次 后 的 生 长 特 性 图 3 可 以 看 出 诱 变 株 IM 依 然 比 野 生 株 生 长 速 度 快 结 果 显 示 诱 变 株 生 物 量 较 野 生 株 高 所 得 细 胞 终 密 度 干 重 油 脂 含 量 油 脂 产 率 以 及 最 大 比 生 长 速 率 见 表 2 Table 1 表 1 I. zhangjiangensis 野 生 株 与 诱 变 株 100 ml 摇 瓶 培 养 的 最 大 比 生 长 速 率 The maximum specific growth rate of wild type and mutants of I. zhangjiangensis in 100 ml flask I. zhanjiangensis IM IM IM IM IM IM IM μ max Figure 3 图 ml 反 应 器 培 养 野 生 株 和 诱 变 株 第 7 代 (A) 与 第 13 代 (B) 的 生 长 曲 线 Growth curves of wild strain and the mutant in the 7 th (A) and 13 th (B) generation cultured in 600 ml bioreactor

5 146 微 生 物 学 通 报 Microbiol. China 2015, Vol.42, No.1 传 代 次 数 Generation F7 F13 Table 2 表 ml 反 应 器 培 养 野 生 株 和 诱 变 株 (F7 代 ) 的 各 成 分 含 量 The content of each component of wild strain and the mutant (F7) cultured in 600 ml bioreactor 藻 种 Strain 细 胞 密 度 Cell density ( 10 4 cells/ml) 最 大 比 生 长 速 率 Maximum specific growth rate (μ max ) (d 1 ) 干 重 Dry weight (g/l) 油 脂 含 量 Lipid content (%, W/W) 油 脂 产 率 Lipid productivity (mg/(l d)) I. zhangjiangensis ± ± ± ±9.0 IM ± ± ± ±11.4 I. zhangjiangensis ± ± ± ±8.4 IM ± ± ± ±13.4 诱 变 株 IM 经 7 次 传 代 后 反 应 器 培 养 至 第 7 天, 与 野 生 株 相 比, 最 大 比 生 长 速 率 细 胞 密 度 和 干 重 分 别 比 野 生 株 高 出 14.1% 30.0% 和 28.0%, 是 一 株 生 长 快 速 的 诱 变 株, 油 脂 产 率 诱 变 株 高 于 野 生 株 21.5%, 可 达 mg/(l d) 经 第 13 次 传 代 后, 最 大 比 生 长 速 率 细 胞 密 度 和 干 重 分 别 比 野 生 株 高 出 12.5% 20.8% 和 7.5% 大 多 数 藻 株 在 自 养 条 件 下 油 脂 产 率 仅 为 6 30 mg/(l d) [21-22] 王 [23] 立 柱 等 从 云 南 滇 池 的 水 样 中 分 离 筛 选 得 到 一 株 自 养 产 油 小 球 藻 (Chlorella vulgaris), 其 油 脂 产 率 为 28.6 mg/(l d) 本 实 验 用 的 野 生 金 藻 在 自 养 条 件 下 油 脂 产 率 均 高 于 文 献 报 道 的 藻 株, 在 此 基 础 上 筛 选 油 脂 产 率 更 高 的 诱 变 株, 更 具 优 势, 为 本 实 验 室 增 加 了 藻 种 资 源 本 研 究 采 用 最 新 的 常 压 室 温 等 离 子 体 进 行 藻 株 的 选 育 工 作, 该 技 术 由 于 操 作 简 单 安 全 性 高 诱 变 效 果 明 显 突 变 多 样 性 大 而 颇 受 研 究 者 欢 迎, 已 在 发 酵 领 域 逐 步 得 到 应 用 [24-26] ARTP 对 微 生 物 作 用 的 主 要 因 子 为 高 浓 度 的 中 性 活 性 粒 子, 而 对 于 ARTP 诱 变 育 种, 其 直 接 处 理 对 象 为 细 胞 由 于 细 胞 壁 和 细 胞 膜 的 存 在,ARTP 产 生 的 活 性 粒 子 并 不 能 够 直 接 作 用 于 细 胞 内 的 生 物 大 分 子, 而 是 对 整 细 胞 造 成 损 伤, 而 在 细 胞 发 生 损 伤 的 同 时, 细 胞 内 又 同 时 存 在 DNA 修 复 等 多 种 修 复 机 制 因 此, 关 于 ARTP 与 整 细 胞 的 作 用 机 制 研 究 至 关 重 要 本 研 究 测 定 了 PSⅡ 最 大 光 能 转 化 效 率, 野 生 株 平 均 为 0.686, 诱 变 株 平 均 为 0.714, 说 明 通 过 ARTP 诱 变 可 能 强 化 了 诱 变 株 的 光 合 系 统, 间 接 证 明 了 藻 细 胞 在 受 到 ARTP 诱 变 后 产 生 了 胁 迫 反 应, 因 此 其 生 长 速 度 快, 油 脂 产 率 提 高 3 结 论 本 研 究 通 过 ARTP 诱 变 育 种 方 法 成 功 诱 变 湛 江 等 鞭 金 藻, 经 过 96 孔 板 和 100 ml 摇 瓶 初 筛, 并 经 过 600 ml 柱 状 鼓 泡 式 反 应 器 评 估, 获 得 了 一 株 与 野 生 株 相 比 同 等 含 油 量 但 生 长 速 度 快 的 诱 变 株 IM 该 诱 变 株 在 富 氮 培 养 下 培 养 至 第 7 天, 细 胞 密 度 为 野 生 株 的 1.2 倍 经 过 多 次 传 代, 在 第 7 代 和 第 13 代, 具 有 相 同 的 生 长 特 性 通 过 这 种 诱 变 方 法 以 及 筛 选 方 式, 获 得 一 株 高 油 脂 产 率 的 诱 变 金 藻 藻 株, 且 经 过 多 次 传 代 性 质 稳 定 该 诱 变 株 可 以 作 为 30 L 和 100 L 光 生 物 反 应 器 的 放 大 培 养 的 藻 株, 为 下 一 步 研 究 找 到 了 优 良 种 质 资 源 致 谢 : 清 华 大 学 邢 新 会 教 授 课 题 组 为 本 实 验 提 供 常 压 室 温 等 离 子 体 育 种 机, 在 此 表 示 感 谢 参 考 文 献 [1] Fan XL, Guo RB, Wei DZ. Key basic research in biorefinery of energy microalgae[j]. China Basic Science, 2009(5): (in 范 晓 蕾, 郭 荣 波, 魏 东 芝. 能 源 微 藻 与 生 物 炼 制 [J]. 中 国 基 础 科 学, 2009(5): [2] Carla SJ, Stephen PM. Algae biofuels: versatility for the future of bioenergy[j]. Current Opinion in Biotechnology, 2012, 23(3): [3] Li T, Li AF, Sang M et al. Screening oleaginous microalgae and evaluation of the oil-producing charateristic[j]. China Biotechnology, 2011, 31(4): (in 李 涛, 李 爱 芬, 桑 敏, 等. 富 油 能 源 微 藻 的 筛 选 及 产 油 性 能 评 价 [J]. 中 国 生 物 工 程 杂 志, 2011, 31(4): [4] Singh J, Gu S. Commercialization potential of microalgae for biofuels production[j]. Renewable and Sustainable Energy

6 艾 江 宁 等 : 生 长 速 度 快 且 油 脂 产 率 高 的 湛 江 等 鞭 金 藻 诱 变 株 的 筛 选 147 Reviews, 2010, 14(9): [5] Jiang XM, Zheng YZ. Total lipid and fatty acid composition of 14 species of mircoalgae[j]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2003, 27(3): (in 蒋 霞 敏, 郑 亦 周. 14 种 微 藻 总 脂 含 量 和 脂 肪 酸 组 成 研 究 [J]. 水 生 生 物 学 报, 2003, 27(3): [6] Huang GH, Chen F, Wei D. Improvement of lipid content of Chlorella pyrenoidosa by two-step cultivation[j]. Journal of South China University of Technology, 2008, 36(12): (in 黄 冠 华, 陈 峰, 魏 东. 两 步 培 养 法 提 高 蛋 白 核 小 球 藻 的 油 脂 含 量 [J]. 华 南 理 工 大 学 学 报, 2008, 36(12): [7] Potvin G, Debska D, Lan C, et al. Effect of operating conditions on the photobioreactor cultivation of Chlorella vulgaris[j]. Journal of Biobased Materials and Bioenergy, 2011, 5(3): [8] Zheng HL, Zhang Q, Ma XC et al. Research progress on biodiesel producing microalgae cultivation[j]. 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