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1 微 生 物 学 通 报 Microbiology China 研 究 报 告 May 20, 2013, 40(5): by Institute of Microbiology, CAS 一 株 产 右 旋 糖 苷 酶 海 洋 细 菌 的 筛 选 鉴 定 李 卫 娟 1,2 焦 豫 良 2 吕 明 生 2 房 耀 维 2 李 华 钟 1* 李 秋 潼 (1. 江 南 大 学 工 业 生 物 技 术 教 育 部 重 点 实 验 室 江 苏 无 锡 ) (2. 淮 海 工 学 院 海 洋 学 院 江 苏 连 云 港 ) (3. 常 州 大 学 石 油 化 工 学 院 江 苏 常 州 ) 3 王 淑 军 2* 摘 要 : 目 的 筛 选 鉴 定 产 右 旋 糖 苷 酶 的 海 洋 细 菌, 并 对 其 所 产 右 旋 糖 苷 酶 的 酶 学 性 质 及 在 变 异 链 球 菌 牙 菌 斑 生 物 膜 中 的 应 用 进 行 初 步 研 究 方 法 利 用 平 板 透 明 圈 法 从 海 洋 环 境 中 筛 选 产 右 旋 糖 苷 酶 的 细 菌, 根 据 菌 株 形 态 特 征 生 理 特 征 及 16S rdna 序 列 确 定 其 分 类 学 地 位, 采 用 体 外 生 物 膜 模 型 研 究 该 酶 对 变 异 链 球 菌 牙 菌 斑 生 物 膜 形 成 的 抑 制 作 用 结 果 从 海 泥 中 筛 选 出 一 株 产 右 旋 糖 苷 酶 的 细 菌 KQ11, 初 步 鉴 定 为 节 杆 菌 (Arthrobacter sp.) 该 菌 株 的 最 适 生 长 温 度 为 30 C, 最 适 生 长 ph 7.5, 最 适 生 长 NaCl 浓 度 为 0.4% 右 旋 糖 苷 酶 的 最 适 作 用 温 度 为 45 C, 最 适 作 用 ph 为 5.5 该 酶 能 有 效 地 抑 制 变 异 链 球 菌 牙 菌 斑 生 物 膜 的 形 成 结 论 菌 株 KQ11 右 旋 糖 苷 酶 能 够 抑 制 变 异 链 球 菌 牙 菌 斑 生 物 膜 的 形 成, 可 望 用 于 漱 口 液 等 口 腔 护 理 产 品 中 关 键 词 : Arthrobacter sp., 右 旋 糖 苷 酶, 筛 选, 鉴 定 基 金 项 目 : 国 家 863 计 划 项 目 (No. 2011AA ); 连 云 港 市 自 然 科 学 基 金 项 目 (No. CG1003); 江 苏 高 校 优 势 学 科 建 设 工 程 资 助 项 目 * 通 讯 作 者 : 李 华 钟 : Tel: ; : hzhli@jiangnan.edu.cn 王 淑 军 : Tel: ; : shujunwang86@163.com 收 稿 日 期 : ; 接 受 日 期 :

2 李 卫 娟 等 : 一 株 产 右 旋 糖 苷 酶 海 洋 细 菌 的 筛 选 鉴 定 757 Screening, identification and characterization of a dextranase-producing marine strain LI Wei-Juan 1,2 JIAO Yu-Liang 2 LÜ Ming-Sheng 2 FANG Yao-Wei 2 LI Hua-Zhong 1* LI Qiu-Tong 3 WANG Shu-Jun 2* (1. Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu , China) (2. School of Marine Science and Technology, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang, Jiangsu , China) (3. School of Petrochemical Engineering, Changzhou University, Changzhou, Jiangsu , China) Abstract: [Objective] This study is aimed to isolate and identify a strain which can produce dextranase, characterize the enzyme properties and study its application in Streptococcus mutans dental biofilm. [Methods] The strains derived from marine environment were screened by observing transparent circle on agar plates. The strains were identified by morphology, physiological characteristics, and phylogenetic analysis based on 16S rdna sequences. The inhibitory effect of the dextranase on Streptococcus mutans dental biofilm was assessed with biofilm models in vitro. [Results] A dextranase-producing strain KQ11 was isolated from sea mud and preliminarily identified as Arthrobacter sp.. The optimal growth conditions of the strain were 30 C, ph 7.5, and NaCl concentration of 0.4%. The optimal catalytic conditions of the enzyme were 45 C, ph 5.5. The dextranase effectively prevented the dental biofilm formation by Streptococcus mutans. [Conclusion] The dextranase from the strain KQ11 can effectively degrade Streptococcus mutans dental biofilm, and thus it can be added to the oral care products such as mouthwash. Keywords: Arthrobacter sp., Dextranase, Screen, Identification 牙 菌 斑 是 发 生 于 牙 齿 表 面 及 内 部 的 一 种 慢 性 口 腔 细 菌 疾 病, 常 以 发 病 率 高 分 布 范 围 广 严 重 威 胁 着 人 类 的 口 腔 健 康 变 异 链 球 菌 是 目 前 公 认 的 主 要 致 龋 细 菌, 它 合 成 的 胞 外 多 糖 是 牙 菌 斑 形 成 的 重 要 因 素 [1] 目 前, 控 制 致 龋 细 菌 生 物 膜 形 成 的 策 略 有 多 种, 其 中 以 酶 解 为 代 表 的 脱 粘 附 方 法, 以 其 无 毒 性 无 耐 药 性 等 优 势, 逐 渐 成 为 研 究 的 热 点 [2] 自 1968 年 Fitzgerald 等 首 次 证 实 了 右 旋 糖 苷 酶 的 防 龋 潜 力 后, 各 国 科 学 家 纷 纷 进 行 了 右 旋 糖 苷 酶 的 防 龋 实 验 [3] 目 前 国 内 对 微 生 物 产 右 旋 糖 苷 酶 的 防 龋 研 究 主 要 为 中 国 科 学 院 微 生 物 研 究 所 的 孙 晋 武 等, 且 研 究 对 象 主 要 为 陆 源 右 旋 糖 苷 酶, 对 于 海 洋 右 旋 糖 苷 酶 的 研 究 则 相 对 甚 少 [45] 右 旋 糖 苷 酶 (EC ) 是 一 种 可 以 水 解 右 旋 糖 酐 链 内 及 链 端 α-1,6 糖 苷 键 的 糖 苷 水 解 酶, 因 而 常 被 应 用 于 制 糖 工 业 血 浆 代 用 品 的 生 产 及 牙 菌 斑 的 预 防 及 治 疗 等 方 面 [5] 目 前 研 究 发 现 的 产 右 旋 糖 苷 酶 的 真 菌 包 括 青 霉 属 拟 青 霉 属 曲 霉 属 镰 孢 属 穗 霉 属 轮 枝 孢 属 长 蠕 孢 属

3 758 微 生 物 学 通 报 Microbiol. China 2013, Vol.40, No.5 毛 壳 属 及 斯 氏 油 脂 酵 母, 细 菌 包 括 乳 杆 菌 属 链 球 菌 属 纤 维 弧 菌 属 噬 细 胞 菌 属 短 杆 菌 属 假 单 胞 菌 属 棒 杆 菌 属 节 杆 菌 属 黄 杆 菌 属, 这 些 产 生 菌 主 要 为 陆 源 微 生 物 [6] 迄 今 为 止, 已 报 道 的 产 右 旋 糖 苷 酶 的 节 杆 菌 主 要 分 离 于 土 壤, 例 如 1991 年 日 本 大 阪 大 学 Okushima 等 分 离 的 Arthrobacter sp. CB-8 及 2010 年 Jin 等 分 离 的 产 右 旋 糖 苷 酶 的 氧 化 节 杆 菌 [78] 与 陆 源 酶 相 比, 海 洋 酶 的 耐 盐 耐 碱 耐 低 温 等 特 性 更 利 于 工 业 化 应 用, 因 此 本 研 究 从 海 洋 环 境 出 发, 旨 在 筛 选 得 到 一 株 高 产 右 旋 糖 苷 酶 的 菌 株, 对 其 进 行 生 理 生 化 及 分 子 生 物 学 鉴 定, 研 究 其 生 长 特 性 及 右 旋 糖 苷 酶 在 牙 菌 斑 预 防 中 的 作 用, 从 而 为 实 现 其 应 用 奠 定 理 论 基 础 1 材 料 与 方 法 1.1 菌 株 来 源 变 异 链 球 菌 (Streptococcus mutans ATCC 25175): 购 于 中 国 普 通 微 生 物 菌 种 保 藏 管 理 中 心 1.2 样 品 采 集 从 连 云 港 海 域 采 集 各 类 样 品, 包 括 海 泥 海 水 海 鱼 虾 蟹 和 浒 苔 1.3 培 养 基 基 础 培 养 基 : 为 2216E 培 养 基 [5] 初 筛 培 养 基 (g/l): 蛋 白 胨 5.0, 酵 母 粉 1.0, 蓝 色 葡 聚 糖 2.0, 右 旋 糖 酐 , 琼 脂 20.0, 陈 海 水 配 制, ph 8.0 复 筛 培 养 基 : 在 基 础 培 养 基 的 基 础 上 添 加 1.0% 右 旋 糖 酐 产 酶 培 养 基 (g/l): 麸 皮 ( 粉 碎 过 35 目 ) 10.0, 硝 酸 钠 2.5, 氯 化 钠 4.0, 硫 酸 镁 0.4, 右 旋 糖 酐 , 自 来 水 配 制, ph 6.5 BHI 培 养 基 (g/l): 脑 心 浸 出 液 20.0, NaCl 5.0, Na 2 HPO 4 2.5, 葡 萄 糖 2.0, ph 主 要 试 剂 蓝 色 葡 聚 糖, GE Healthcare PCR 试 剂 及 UNIQ-10 柱 式 胶 回 收 试 剂 盒, 上 海 生 工 生 物 程 有 限 公 司 ; pmd 19-T 连 接 试 剂 盒, 大 连 宝 生 物 公 司 ; 基 因 组 提 取 试 剂 盒, 杭 州 爱 思 进 生 物 技 术 有 限 公 司 ; 其 他 试 剂 为 国 产 分 析 纯 1.5 菌 株 的 筛 选 样 品 处 理 及 富 集 : (1) 海 泥 : 称 取 1 g 海 泥 用 10 ml 无 菌 海 水 悬 浮 ; (2) 海 鱼 虾 蟹 海 参 : 取 出 内 脏, 剪 刀 剪 碎 后 于 10 ml 无 菌 海 水 中 研 磨 成 浆 ; (3) 浒 苔 : 取 0.5 g 新 鲜 的 浒 苔, 用 剪 刀 将 其 剪 碎 ; (4) 海 水 : 取 20 ml 海 水 经 0.22 μm 滤 膜 过 滤 后, 取 出 滤 膜 待 用 处 理 后, 用 无 菌 镊 子 将 剪 碎 的 浒 苔 组 织 和 过 滤 海 水 的 滤 膜 分 别 接 种 至 基 础 培 养 基 中, 泥 浆 和 内 脏 研 磨 液 则 分 别 按 照 2% 的 接 种 量 接 种 至 基 础 培 养 基 中, 接 种 后 置 于 摇 床 中, 25 C 180 r/min 培 养 12 d 初 筛 及 复 筛 : 经 基 础 培 养 基 富 集 后, 取 富 集 培 养 液 梯 度 稀 释 后, 涂 布 于 初 筛 平 板 上, 25 C 培 养 23 d, 观 察 各 菌 株 产 生 透 明 圈 的 情 况 [9] 将 产 生 透 明 圈 的 单 菌 落 接 种 至 复 筛 培 养 基 中, 25 C 180 r/min 培 养 24 h, r/min 离 心 10 min 取 上 清 液 测 定 酶 活 力 大 小, 筛 选 出 透 明 圈 大 和 酶 活 力 高 的 菌 株 1.6 菌 株 的 鉴 定 细 胞 形 态 及 生 理 生 化 特 征 : 观 察 菌 株 的 个 体 显 微 形 态 和 菌 落 形 态, 并 按 照 伯 杰 细 菌 鉴 定 手 册 [10], 进 行 各 种 生 理 生 化 反 应 鉴 定 S rrna 基 因 序 列 扩 增 及 分 析 : 利 用 细 菌 基 因 组 提 取 试 剂 盒 提 取 菌 株 基 因 组 进 行 PCR, 引 物 选 用 原 核 微 生 物 16S rdna 通 用 引 物, 上 游 引 物 : 5 -AGAGTTTGATCCTGGCTAG-3, 下 游 引 物 : 5 -GGTTACCTTGTTACGACTT-3, 胶 回 收 PCR 产 物, 与 pmd 19-T 载 体 连 接, 转 化 至 DH5α 感 受 态 细 胞, 蓝 白 斑 筛 选 出 阳 性 克 隆, 菌 落 PCR

4 李 卫 娟 等 : 一 株 产 右 旋 糖 苷 酶 海 洋 细 菌 的 筛 选 鉴 定 759 验 证, 送 至 上 海 生 工 生 物 公 司 测 序 将 所 测 得 的 16S rrna 基 因 序 列 与 GenBank 数 据 库 中 的 已 有 序 列 进 行 BLAST 分 析, 从 GenBank 中 选 择 近 缘 菌 株 的 16S rrna 基 因 序 列, 采 用 Bioedit 软 件 程 序 进 行 序 列 分 析 并 用 Neighbor-Joining 法 构 建 系 统 发 育 树, 以 确 定 该 菌 株 的 分 类 地 位 1.7 菌 株 KQ11 的 生 长 特 性 种 子 液 制 备 : 将 菌 株 KQ11 斜 面 种 子 接 种 到 基 础 培 养 基 中, 装 液 量 20%, 25 C 180 r/min 培 养 16 h 温 度 对 菌 体 生 长 的 影 响 : 种 子 液 2% 接 种 于 基 础 培 养 基 中, ph 7.5, 转 速 180 r/min, 装 液 量 20%, 在 不 同 温 度 (0 C40 C) 下 培 养 24 h, 于 OD 600 下 测 定 细 胞 浓 度 ph 对 菌 株 生 长 的 影 响 : ph 范 围 , 最 适 温 度 培 养, 其 余 条 件 同 1.7.2, 为 了 防 止 培 养 过 程 中 ph 的 变 化, 加 入 终 浓 度 为 10 mmol/l 的 缓 冲 液 : ph (MES 缓 冲 液 ), ph (PIPES 缓 冲 液 ), ph (HEPES 缓 冲 液 ), ph 直 接 用 NaOH 调 NaCl 浓 度 对 菌 株 生 长 的 影 响 : 培 养 基 用 蒸 镏 水 配 制, NaCl 范 围 010%, 最 适 温 度 和 ph 下 培 养, 其 余 条 件 同 菌 株 右 旋 糖 苷 酶 粗 酶 性 质 研 究 右 旋 糖 苷 酶 的 制 备 : 种 子 液 按 4% 接 种 量 接 种 至 产 酶 培 养 基, 30 C 180 r/min 培 养 24 h, r/min 离 心 10 min, 收 集 上 清, 经 分 子 量 为 的 中 空 纤 维 膜 超 滤 浓 缩, 冻 干 后 备 用 酶 的 最 适 作 用 ph 和 最 适 作 用 温 度 : 最 适 作 用 ph: 将 酶 液 与 不 同 ph 的 3% 的 右 旋 糖 酐 在 45 C 下 测 定 酶 活 力, 不 同 ph 值 的 缓 冲 液 为 : 50 mmol/l 乙 酸 钠 缓 冲 液 (ph ) 50 mmol/l 磷 酸 钠 缓 冲 液 (ph ) 和 50 mmol/l Tris-HCl 缓 冲 液 (ph ) 酶 的 最 适 作 用 温 度 : 将 酶 分 别 在 0 C 20 C60 C 温 度 下, 用 ph 5.5 的 乙 酸 钠 缓 冲 液 (50 mmol/l) 配 制 的 3% 右 旋 糖 酐 溶 液 作 为 底 物 进 行 酶 活 测 定 酶 活 力 测 定 : 将 10 μl 酶 液 与 190 μl 3% 的 右 旋 糖 酐 (50 mmol/l, ph 5.5 乙 酸 钠 缓 冲 液 配 制 ) 45 C 水 浴 15 min 后, DNS 法 测 定 还 原 糖 含 量 酶 活 力 单 位 定 义 (U/mL): 上 述 反 应 条 件 下, 每 分 钟 催 化 释 放 1 μmol 麦 芽 糖 所 需 的 酶 量 为 一 个 活 力 单 位 [11] 1.9 右 旋 糖 苷 酶 对 变 异 链 球 菌 牙 菌 斑 生 物 膜 形 成 的 影 响 将 变 异 链 球 菌 活 化 后 接 种 至 BHI 培 养 基 中, 37 C 厌 氧 培 养 18 h, 将 菌 浓 度 OD 550 调 整 至 1.0 然 后 与 含 1% 蔗 糖 的 BHI 培 养 基 按 照 1:9 (V/V) 的 比 例 加 至 含 无 菌 盖 玻 片 的 无 菌 平 皿 内, 再 分 别 加 入 右 旋 糖 苷 酶, 使 之 终 浓 度 分 别 为 U/mL 37 C 厌 氧 培 养 24 h 后, 取 出 盖 玻 片, 用 无 菌 磷 酸 钠 缓 冲 液 (0.2 mol/l, ph 7.2) 轻 柔 洗 涤, 制 备 扫 描 电 镜 样 品 [12] 2 结 果 与 分 析 2.1 菌 株 的 筛 选 在 初 筛 培 养 基 中 加 入 蓝 色 葡 聚 糖, 从 而 快 速 有 效 地 筛 选 产 右 旋 糖 苷 酶 菌 株 对 采 集 的 样 品 富 集 稀 释 涂 布 后 挑 选 产 生 透 明 圈 的 单 菌 落 接 种 至 产 酶 培 养 基 中 摇 瓶 复 筛, 结 果 发 现 编 号 为 KQ11 的 菌 株 所 产 右 旋 糖 苷 酶 活 性 最 高, 在 初 筛 平 板 上 产 生 的 透 明 圈 最 大, 如 图 1A 所 示 该 菌 株 图 1 菌 株 KQ11 在 初 筛 平 板 上 形 成 的 透 明 圈 (A) 和 菌 落 形 态 (B) Fig. 1 The clear zone around the colony of strain KQ11 on the plate (A) and colony morphology (B)

5 760 微 生 物 学 通 报 Microbiol. China 2013, Vol.40, No.5 在 初 筛 培 养 基 上 形 成 白 色 不 透 明 菌 落, 边 缘 整 齐 表 面 光 滑 湿 润, 其 菌 落 形 态 如 图 1B 所 示 2.2 菌 株 的 鉴 定 细 胞 形 态 : 菌 株 KQ11 为 革 兰 氏 阳 性 菌, 无 鞭 毛, 无 芽 孢, 呈 规 则 及 不 规 则 杆 状, 部 分 以 V 状 排 列, 随 着 培 养 时 间 的 延 长, 杆 状 断 裂 成 椭 球 状, 生 长 呈 杆 球 周 期 变 化 ( 图 2), 这 与 伯 杰 氏 手 册 中 对 节 杆 菌 的 描 述 是 一 致 的 菌 株 的 生 理 生 化 特 征 : 该 菌 株 触 酶 反 应 呈 阳 性, 氧 化 酶 甲 基 红 V-P 吲 哚 实 验 呈 阴 性, 在 5% 脱 脂 牛 奶 中 65 C 水 浴 30 min 后 无 存 活 通 过 分 析, 该 菌 株 的 生 理 生 化 特 征 与 节 杆 菌 属 的 生 理 生 化 特 征 基 本 一 致 [10], 具 体 见 表 S rdna 鉴 定 : 以 菌 株 KQ11 的 基 因 组 为 模 板, 利 用 16S rdna 通 用 引 物 进 行 聚 合 酶 链 式 扩 增 反 应, 胶 回 收 之 后 TA 克 隆 并 测 序, 得 到 一 条 bp 的 序 列 序 列 比 对 后, 发 现 菌 株 KQ11 与 Arthrobacter sp. AD29 的 相 似 性 为 99%, 系 统 进 化 树 如 图 3 所 示 结 合 菌 株 的 生 理 生 化 特 征 和 分 子 鉴 定 结 果, 该 菌 株 为 节 杆 菌 (Arthrobacter sp. KQ11) 目 前 文 献 报 道 表 明 节 杆 菌 属 可 以 产 生 多 种 活 性 物 质, 如 右 旋 糖 苷 水 解 酶 海 藻 糖 合 成 酶 半 乳 糖 苷 酶 乙 内 酰 脲 酶 等 [1317], 因 而 在 医 药 生 产 及 环 境 治 理 修 复 中 具 有 重 要 的 作 用 2.3 菌 株 KQ11 的 生 长 特 性 温 度 对 菌 株 生 长 的 影 响 : 菌 株 KQ11 在 0 C 下 能 生 长, 最 适 生 长 温 度 为 30 C, 随 着 温 度 的 升 高, 其 生 长 较 差 ( 图 4) 目 前 已 报 道 的 节 杆 菌 的 最 适 生 长 温 度 多 在 20 C35 C 范 围 内 分 离 自 海 洋 的 节 杆 菌 由 于 其 生 长 环 境 使 其 具 有 一 定 的 嗜 冷 性, 因 而 能 在 低 温 环 境 下 生 长 [18] ph 对 菌 株 KQ11 生 长 情 况 的 影 响 : 将 基 础 培 养 基 的 初 始 ph 分 别 调 至 不 同 ph, 按 2% 接 种 量 接 种, 30 C 摇 床 培 养 24 h 后 测 定 菌 浓 度 如 图 5 所 示, 菌 株 KQ11 在 ph 内 生 长 相 对 较 好, 其 最 适 生 长 ph 为 7.5, 当 ph 低 于 6.5 时 不 利 于 菌 株 的 生 长 对 于 节 杆 菌 属 来 讲, 陆 源 节 杆 菌 与 海 洋 节 杆 菌 对 酸 性 环 境 都 具 有 敏 感 性, 对 碱 性 环 境 则 具 有 一 定 的 耐 受 性, 其 生 长 ph 多 在 5.0 以 上 例 如 Srinivas 等 报 道 的 海 洋 节 杆 菌 Marine-33 的 生 长 ph 范 围 是 [19] 李 娜 等 报 道 的 分 离 自 烟 样 图 2 菌 株 KQ11 电 镜 照 片 形 态 (8 000 ) Fig. 2 The SEM photograph of strain KQ11 (8 000 ) 注 : A: 培 养 12 h 的 棒 杆 状 菌 体 ; B: 培 养 48 h 的 椭 球 状 菌 体. Note: A: Club-shaped cells harvested at 12 h; B: Shot rods and coccoids cells harvested at 48 h.

6 李 卫 娟 等 : 一 株 产 右 旋 糖 苷 酶 海 洋 细 菌 的 筛 选 鉴 定 761 Table 1 实 验 项 目 Item 甲 基 红 实 验 M.R. test V-P 实 验 V-P test 吲 哚 实 验 Indole test 触 酶 反 应 Catalase test 氧 化 酶 Oxidase 淀 粉 水 解 实 验 Starch hydrolysis test 油 脂 水 解 实 验 Oil hydrolysis reaction 明 胶 液 化 实 验 Gelation liquefaction test 马 尿 酸 盐 利 用 Hippurate utilization test 赖 氨 酸 脱 羧 酶 Lysine decarboxylase 65 C 5% 脱 脂 牛 奶 水 浴 30 min 存 活 实 验 Survival test in 5% skim milk at 65 C for 30 min 注 : : 阳 性 ; : 阴 性. Note: : Positive; : Negative. 表 1 菌 株 KQ11 部 分 生 理 生 化 特 征 Partly biochemical and physiological characteristics of strain KQ11 结 果 Result 实 验 项 目 Item 硫 化 氢 H 2 S 尿 素 酶 Urease 硝 酸 盐 肉 汤 Nitrate broth 纤 维 二 糖 Cellobiose 3% NaCl 葡 萄 糖 Glucose with 3% NaCl 木 糖 Xylose 3% NaCl 蔗 糖 Sucrose with 3% NaCl 3% NaCl 乳 糖 Lactose with 3% NaCl 3% NaCl 阿 拉 伯 糖 Arabinose with 3% NaCl 鸟 氨 酸 脱 羧 酶 Ornithine decarboxylase 0 C 生 长 实 验 Growth test at 0 C 结 果 Result 图 3 菌 株 KQ11 系 统 进 化 树 Fig. 3 The phylogenetic tree of strain KQ11 注 : 种 属 名 后 括 号 内 的 序 号 为 GenBank 数 据 库 的 登 录 号 ; 线 段 表 示 1% 序 列 差 异 的 分 支 长 度 ; 分 支 节 点 上 的 数 字 表 示 每 100 次 分 析 所 支 持 的 次 数. Note: The numbers in the parentheses are the accession numbers of the sequence in GenBank. The bar indicates the 1% nucleotide divergence. The numbers at the branch nodes represent the confidence level among 100 analysis.

7 762 微 生 物 学 通 报 Microbiol. China 2013, Vol.40, No.5 图 4 温 度 对 菌 株 KQ11 生 长 的 影 响 Fig. 4 The effect of temperature on the growth of strain KQ11 图 5 ph 对 菌 株 KQ11 生 长 的 影 响 Fig. 5 The effect of ph on the growth of strain KQ11 及 土 样 中 的 节 杆 菌 最 适 生 长 ph 在 6.5 左 右, 在 碱 性 环 境 下 比 酸 性 环 境 下 生 长 的 要 好 [20] 氯 化 钠 浓 度 对 菌 株 KQ11 生 长 的 影 响 : 为 了 研 究 氯 化 钠 对 菌 株 生 长 的 影 响, 在 基 础 培 养 基 中 添 加 氯 化 钠 至 不 同 终 浓 度, 并 用 蒸 馏 水 代 替 海 水, 结 果 如 图 6 所 示 菌 株 的 最 适 生 长 氯 化 钠 浓 度 为 0.4%, 当 氯 化 钠 的 浓 度 高 于 4% 后, 菌 株 的 生 长 能 力 明 显 下 降, 但 仍 有 部 分 生 长 与 常 见 的 海 洋 细 菌 不 同, 该 菌 株 在 氯 化 钠 浓 度 为 0 时 仍 能 生 长 有 研 究 表 明, 在 实 验 室 培 养 条 件 下, 大 多 数 海 洋 细 菌 能 够 对 不 良 环 境 产 生 抗 性, 逐 渐 被 驯 化, 因 图 6 NaCl 浓 度 对 菌 株 KQ11 生 长 的 影 响 Fig. 6 The effect of NaCl concentration on the growth of strain KQ11 而 长 久 保 存 的 菌 株 在 淡 水 中 生 长 的 与 海 水 中 一 样 好 [21] Zobell 等 曾 报 道, 他 们 所 分 离 的 12 株 海 洋 细 菌 在 保 存 5 个 月 后 能 在 淡 水 培 养 基 中 生 长 [22] 2.4 菌 株 右 旋 糖 苷 酶 粗 酶 性 质 研 究 该 右 旋 糖 苷 酶 的 最 适 作 用 ph 为 5.5, ph 6.0 时 酶 活 为 最 高 酶 活 的 80% 以 上 ( 图 7) 商 品 化 右 旋 糖 苷 酶 Dextranase 50 L 的 最 适 作 用 ph 为 4.5, ph 6.0 时 酶 仅 为 最 高 酶 活 的 50% 左 右 [23] 由 于 人 体 正 常 的 口 腔 环 境 ph 在 6.0 左 右, 因 而 本 研 究 所 用 右 旋 糖 苷 酶 更 适 合 于 口 腔 应 用 菌 株 KQ11 所 产 右 旋 糖 苷 酶 在 低 温 下 (0 C) 仍 具 有 一 定 的 酶 活 力, 最 适 作 用 温 度 为 45 C, 随 着 温 度 的 升 高, 酶 活 迅 速 下 降 37 C 时 酶 活 为 最 高 酶 活 的 87% 左 右 ( 图 8) 目 前 已 报 道 野 生 菌 的 右 旋 糖 苷 酶 的 最 适 作 用 温 度 一 般 在 50 C 左 右, 例 如 商 品 化 的 Dextranase 50 L, 其 最 适 作 用 温 度 为 55 C, 37 C 酶 活 仅 为 最 大 酶 活 的 40% [23], 与 菌 株 KQ11 所 产 右 旋 糖 苷 酶 相 比 比 例 要 低 2.5 右 旋 糖 苷 酶 对 变 异 链 球 菌 牙 菌 斑 生 物 膜 形 成 的 影 响 牙 菌 斑 生 物 膜 是 由 微 生 物 自 身 所 产 生 的 胞 外 基 质 与 菌 体 本 身 相 互 包 裹 所 形 成 的 微 生 物 群 落 牙 菌 斑 是 一 种 典 型 的 生 物 膜, 变 异 链 球 菌 为 牙 菌 斑

8 李 卫 娟 等 : 一 株 产 右 旋 糖 苷 酶 海 洋 细 菌 的 筛 选 鉴 定 763 生 物 膜 的 优 势 菌, 与 龋 病 的 发 生 有 密 切 关 系 由 于 以 右 旋 糖 酐 为 主 的 水 溶 性 葡 聚 糖 对 于 牙 菌 斑 细 菌 的 粘 附 至 关 重 要, 因 而 右 旋 糖 苷 酶 的 加 入 可 以 抑 制 变 异 链 球 菌 在 牙 面 的 粘 附 KQ11 产 生 的 右 旋 糖 苷 酶 能 够 有 效 抑 制 变 异 链 球 菌 牙 菌 斑 生 物 膜 的 形 成, 不 加 右 旋 糖 苷 酶 的 变 异 链 球 菌 牙 菌 斑 生 物 膜, 其 结 构 较 为 致 密, 并 有 一 定 的 厚 度, 多 糖 与 菌 体 相 互 包 裹, 内 部 充 斥 着 大 量 通 道 ( 图 9A) 右 图 7 Fig. 7 ph 对 酶 活 性 的 影 响 The effect of ph on the activity of dextranase 图 8 温 度 对 酶 活 性 的 影 响 Fig. 8 The effect of temperature on the activity of dextranase 图 9 KQ11 右 旋 糖 苷 酶 对 S. mutans 牙 菌 斑 生 物 膜 的 作 用 (3 000 ) Fig. 9 Effect of the dextranase from KQ11 on the dental biofilm formed by S. mutans (3 000 ) 注 : A: 对 照 组 ( 即 添 加 右 旋 糖 苷 酶 ); B: 添 加 1 U/mL 的 右 旋 糖 苷 酶 ; C: 添 加 3 U/mL 的 右 旋 糖 苷 酶 ; D: 添 加 5 U/mL 的 右 旋 糖 苷 酶. Note: A: Control group (in the absence of dextranase); B: The presence of dextranase at the concentration of 1 U/mL; C: The presence of dextranase at the concentration of 3 U/mL; D: The presence of dextranase at the concentration of 5 U/mL.

9 764 微 生 物 学 通 报 Microbiol. China 2013, Vol.40, No.5 旋 糖 苷 酶 加 入 后 使 变 异 链 球 菌 牙 菌 斑 生 物 膜 的 结 构 有 所 改 变, 随 着 右 旋 糖 苷 酶 浓 度 的 增 大, 生 物 膜 的 厚 度 逐 渐 变 薄, 网 状 结 构 减 少, 结 构 逐 渐 变 得 疏 松, 细 菌 粘 附 量 也 逐 渐 下 降 ( 图 9B 9C 9D) 当 右 旋 糖 苷 酶 的 浓 度 达 到 5 U/mL 时 细 菌 粘 附 量 大 大 下 降, 原 来 致 密 的 网 状 结 构 被 打 开, 呈 短 链 及 长 链 状 存 在 3 结 论 海 洋 微 生 物 是 人 类 获 得 新 型 酶 的 重 要 源 泉, 这 些 新 型 酶 常 常 具 有 巨 大 的 生 物 技 术 应 用 价 值 目 前 关 于 海 洋 微 生 物 来 源 的 右 旋 糖 苷 酶 的 报 道 甚 少, 本 研 究 通 过 对 海 洋 来 源 的 样 品 进 行 筛 选 得 到 一 株 产 右 旋 糖 苷 酶 的 海 洋 细 菌, 初 步 鉴 定 为 节 杆 菌 (Arthrobacter sp.) 该 菌 株 的 最 适 生 长 条 件 为 30 C, ph 7.5, NaCl 0.4% 该 菌 株 所 产 右 旋 糖 苷 酶 粗 酶 液 的 最 适 作 用 温 度 为 45 C, 最 适 作 用 ph 为 5.5 本 研 究 对 菌 株 KQ11 所 产 右 旋 糖 苷 酶 在 牙 菌 斑 生 物 膜 预 防 中 的 应 用 进 行 了 研 究, 结 果 发 现 菌 株 KQ11 所 产 右 旋 糖 苷 酶 可 以 有 效 地 预 防 变 异 链 球 菌 牙 菌 斑 生 物 膜 的 形 成, 减 少 细 菌 在 基 质 表 面 的 粘 附 目 前 国 内 尚 未 出 现 添 加 右 旋 糖 苷 酶 的 口 腔 护 理 产 品, 因 而 为 其 发 展 提 供 了 一 种 商 业 契 机 参 考 文 献 [1] Pleszczyńska M, Wiater A, Szczodrak J. Mutanase from Paenibacillus sp. MP-1 produced inductively by fungal α-1,3-glucan and its potential for the degradation of mutan and Streptococcus mutans biofilm[j]. Biotechnology Letters, 2010, 32(11): [2] Xavier JB, Picioreanu C, Rani SA, et al. Biofilm-control strategies based on enzymic disruption of the extracellular polymeric substance matrix a modelling study[j]. Microbiology, 2005, 151(12): [3] Fitzgerald RJ, Spinell DM, Stoudt TH. Enzymatic removal of artificial plaques[j]. Archives of Oral Biology, 1968, 13(1): [4] 孙 晋 武. 右 旋 糖 酐 酶 及 其 应 用 [J]. 生 物 工 程 进 展, 1986(4): [5] 吕 明 生, 王 淑 军, 房 耀 维, 等. 一 株 产 低 温 右 旋 糖 苷 酶 海 洋 细 菌 的 筛 选 和 鉴 定 [J]. 海 洋 科 学, 2011, 35(5): [6] Khalikova E, Susi P, Korpela T. Microbial dextran-hydrolyzing enzymes: fundamentals and applications[j]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2005, 69(2): [7] Okushima M, Sugino D, Kouno Y, et al. Molecular cloning and nucleotide sequencing of the Arthrobacter dextranase gene and its expression in Escherichia coli and Streptococcus sanguis[j]. Japanese Journal of Genetics, 1991, 66(2): [8] Jin HL, Seong HN, Hyen JP, et al. Biochemical characterization of dextranase from Arthrobacter oxydans and its cloning and expression in Escherichia coli[j]. Food Science and Biotechnology, 2012, 19(3): [9] Wynter CVA, Galea CF, Cox LM, et al. Thermostable dextranases: screening, detection and preliminary characterization[j]. Journal of Applied Bacteriology, 1995, 79(2): [10] 布 坎 南 RE, 吉 本 斯 NE. 伯 杰 细 菌 鉴 定 手 册 [M]. 第 8 版. 北 京 : 科 学 出 版 社, 1984: [11] Eggleston G, Monge A. Optimization of sugarcane factory application of commercial dextranases[j]. Process Biochemistry, 2005, 40(5): [12] 蒋 丹. 外 源 性 右 旋 糖 苷 酶 和 氟 化 钠 协 同 消 解 变 形 链 球 菌 单 菌 种 生 物 膜 的 研 究 [D]. 成 都 : 四 川 大 学 硕 士 学 位 论 文, [13] Hatada Y, Hidaka Y, Nogi Y, et al. Hyper-production of an isomalto-dextranase of an Arthrobacter sp. by a protease-deficient Bacillus subtilis: sequencing, properties, and crystallization of the recombinant enzyme[j]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2004, 65(5):

10 李 卫 娟 等 : 一 株 产 右 旋 糖 苷 酶 海 洋 细 菌 的 筛 选 鉴 定 [14] Oguma T, Kurokawa T, Tobe K, et al. Cloning and sequence analysis of the gene for glucodextranase from Arthrobacter globiformis T-3044 and expression in Escherichia coli cells[j]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 1999, 63(12): [15] Chen XM, Jiang Y, Li YT, et al. Regulation of expression of trehalose-6-phosphate synthase during cold shock in Arthrobacter strain A3[J]. Extremophiles, 2011, 15(4): [16] Nakagawa T, Fujimoto Y, Ikehata R, et al. Purification and molecular characterization of cold-active beta-galactosidase from Arthrobacter psychrolactophilus strain F2[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2006, 72(4): [17] Ragnitz K, Syldatk C, Pietzsch M. Optimization of the immobilization parameters and operational stability of immobilized hydantoinase and L-N-carbamoylase from Arthrobacter aurescens for the production of optically pure L-amino acids[j]. Enzyme and Microbial Technology, 2001, 28(7/8): [18] Norkrans B, Stehn BO. Sediment bacteria in the deep Norwegian Sea[J]. Marine Biology, 1978, 47(3): [19] Srinivas TNR, Nageswara Rao SSS, Vishnu Vardhan Reddy P, et al. Bacterial diversity and bioprospecting for cold-active lipases, amylases and proteases, from culturable bacteria of kongsfjorden and Ny-ålesund, Svalbard, Arctic[J]. Current Microbiology, 2009, 59(5): [20] 李 娜, 雷 丽 萍, 夏 振 远, 等. 节 杆 菌 K15 发 酵 条 件 的 研 究 [J]. 云 南 农 业 大 学 学 报, 2010, 25(6): , 826. [21] Zobell CE. 海 洋 细 菌 学 [M]. 薛 廷 耀, 译. 北 京 : 科 学 出 版 社, 1962: [22] Zobell CE. Studies on the bacterial flora of marine bottom sediments[j]. Journal of Sediment Research, 1938, 8(1): [23] Marotta M, Martino A, De Rosa A, et al. Degradation of dental plaque glucans and prevention of glucan formation using commercial enzymes[j]. Process Biochemistry, 2002, 38(1): 专 论 与 综 述 论 文 的 撰 写 要 点 稿 件 书 写 规 范 专 论 与 综 述 是 本 刊 重 要 栏 目 之 一, 主 要 反 映 国 内 外 微 生 物 学 及 相 关 领 域 学 科 研 究 最 新 成 果 和 进 展, 其 内 容 要 求 新 颖 丰 富, 观 点 明 确, 论 述 恰 当, 应 包 含 作 者 自 己 的 工 作 内 容 和 见 解 因 此, 作 者 在 动 笔 之 前 必 须 明 确 选 题, 一 般 原 则 上 应 选 择 在 理 论 和 实 践 中 具 有 重 要 意 义 的 学 科 专 题 进 行 论 述 围 绕 专 题 所 涉 及 的 各 个 方 面, 在 综 合 分 析 和 评 价 已 有 资 料 基 础 上 提 出 其 演 变 规 律 和 趋 势, 即 掌 握 其 内 在 的 精 髓, 深 入 到 专 题 研 究 的 本 质, 论 述 其 发 展 前 景 作 者 通 过 回 顾 观 察 和 展 望, 提 出 合 乎 逻 辑 并 具 有 启 迪 性 的 看 法 和 建 议 另 外, 作 者 也 可 以 采 用 以 汇 集 文 献 资 料 为 主 的 写 作 方 法, 辅 以 注 释, 客 观 而 有 少 量 评 述, 使 读 者 对 该 专 题 的 过 去 现 在 和 将 来 有 一 个 全 面 足 够 的 认 识 需 要 特 别 说 明 的 是 :(1) 我 刊 要 求 作 者 投 稿 时 在 正 文 前 写 上 主 要 作 者 的 简 介, 并 指 出 自 己 的 工 作 ( 已 发 表 的 文 章 ) 在 综 述 中 的 体 现, 同 时 请 在 稿 件 中 用 不 同 颜 色 标 出 来 (2) 在 专 论 与 综 述 中 引 用 的 文 献 应 该 主 要 是 近 5 年 国 内 外 正 式 发 表 的 研 究 论 文, 引 用 文 献 数 量 不 限