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1 第 27 卷 第 1 期 高 校 化 学 工 程 学 报 No.1 Vol 年 2 月 Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities Feb 文 章 编 号 : (2013) 产 纤 维 素 酶 增 效 蛋 白 菌 株 的 筛 选 及 培 养 条 件 优 化 覃 益 民 1,2, 陶 恒 1, 刘 幽 燕 1,2, 李 青 云 (1. 广 西 大 学 化 学 化 工 学 院, 广 西 南 宁 ; 2. 广 西 生 物 炼 制 重 点 实 验 室, 广 西 南 宁 ) 1,2 摘 要 : 为 了 寻 找 高 效 的 产 纤 维 素 酶 增 效 蛋 白 菌 株, 建 立 一 种 筛 选 方 法 从 土 壤 中 筛 选 得 到 一 株 产 纤 维 素 酶 增 效 蛋 白 的 细 菌 POEP1, 其 所 产 增 效 蛋 白 对 纤 维 素 酶 ( 来 源 于 黑 曲 霉 Aspergillus niger) 的 滤 纸 酶 活 有 明 显 的 增 效 作 用, 通 过 对 其 进 行 16SrDNA 分 类 鉴 定, 确 定 该 菌 株 为 栖 稻 假 单 胞 菌 (Pseudomonas oryzihabitans) 为 进 一 步 提 高 POEP1 产 纤 维 素 酶 增 效 蛋 白 的 水 平, 对 其 培 养 条 件 进 行 优 化 采 用 单 因 子 试 验 筛 选 出 最 佳 碳 源 为 麦 麸, 最 佳 氮 源 为 黄 豆 粉 再 通 过 Plackett-Burman 设 计 对 与 发 酵 相 关 的 11 个 因 子 进 行 试 验, 筛 选 出 麦 麸 黄 豆 粉 和 KH 2 PO 4 为 3 个 主 要 显 著 因 子 ; 由 Box-Behnken 实 验 结 合 响 应 面 分 析 确 定 主 要 因 子 的 最 优 水 平 为 : 麦 麸 质 量 浓 度 32.3 g L 1, 黄 豆 粉 质 量 浓 度 24.7 g L 1, KH 2 PO 4 质 量 浓 度 4.36 g L 1 优 化 后 纤 维 素 酶 增 效 蛋 白 的 产 量 提 高 1.7 倍, 增 效 活 力 由 U ml 1 增 至 U ml 1 关 键 词 : 纤 维 素 酶 增 效 蛋 白 ;Plackett-Burman 设 计 ; 响 应 曲 面 ; 发 酵 优 化 中 图 分 类 号 :TQ925.9;Q556.9 文 献 标 识 码 :A DOI: /j.issn Screening of the Cellulase-Enhancing-Protein Producing Strain and Optimization of its Culture Conditions QIN Yi-min 1,2, TAO Heng 1, LIU You-yan 1,2, LI Qing-yun 1,2 (1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University, Nanning , China; 2. Guangxi key laboratory of biorefinery, Nanning , China) Abstract: A self-designed screening model was built for the screening of the high-efficient cellulaseenhancing-protein producing strains. A strain (named POEP1), having the ability of producing cellulase-activity-enhancing-protein, was isolated from the soil, and then according to the 16S rdna gene sequencing analysis, the strain was identified to be Pseudomonas oryzihabitans. Some fermentation conditions were optimized to increase the protein productivity. The most suitable carbon and nitrogen sources were determined to be wheat bran and soybeans meal in the single-factor experiments, respectively. Three key factors such as mass concentrations of wheat bran, soybeans meal and KH 2 PO 4 were selected from eleven factors affecting the protein productivity by Plaekett-Burman design and were further optimized by Box-Behnken design and response surface methodology. The optimal concentrations of these three important factors were obtained as follows 32.3 g L 1 of wheat bran, 24.7 g L 1 of soybeans meal and 4.36 g L 1 of KH 2 PO 4. Under the optimal conditions,the cellulase-enhancing activity of U ml 1 was obtained, which is 1.7 times higher than that before optimization (15.79 U ml 1 ). Key words: cellulase-enhancing-protein; Plackett-Burman design; response surface methodology; fermentation optimization 1 引 言 纤 维 素 是 最 丰 富 的 天 然 可 再 生 生 物 资 源, 利 用 纤 维 素 酶 水 解 纤 维 素 生 产 燃 料 乙 醇 越 来 越 引 起 人 们 的 关 注 [1~3] 然 而 纤 维 素 酶 的 水 解 效 率 低 是 制 约 纤 维 素 生 产 燃 料 乙 醇 的 瓶 颈 收 稿 日 期 : ; 修 订 日 期 : 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( ); 广 西 科 学 基 金 资 助 项 目 ( 桂 科 自 ) 作 者 简 介 : 覃 益 民 (1962-), 男, 广 西 贵 港 人, 广 西 大 学 副 教 授, 博 士 通 讯 联 系 人 : 刘 幽 燕, liuyouyangx@163.com

2 114 高 校 化 学 工 程 学 报 2013 年 2 月 [4] 纤 维 素 酶 增 效 蛋 白 或 辅 助 蛋 白 是 指 由 某 些 植 物 或 微 生 物 细 胞 产 生 的 其 本 身 无 内 源 性 纤 维 素 酶 活 但 能 与 纤 维 素 酶 之 间 发 生 协 同 作 用, 并 能 显 著 提 高 纤 维 素 酶 水 解 纤 维 素 活 性 的 一 些 蛋 白 因 子 的 总 称 其 中 一 类 是 称 为 expansins 的 植 物 扩 张 蛋 白 [5~7], 来 源 于 黄 瓜 燕 麦 西 兰 花 芹 菜 棉 花 等 植 物 研 究 表 明,expansins 蛋 白 能 使 细 胞 壁 及 多 糖 类 物 质 如 滤 纸 结 晶 纤 维 素 和 半 纤 维 素 等 的 结 构 发 生 疏 松 及 破 坏, 从 而 增 加 其 可 及 性 此 外 还 发 现 在 微 晶 纤 维 素 酶 解 时,expansins 与 纤 维 素 酶 具 有 协 同 作 用, 提 高 了 微 晶 纤 维 素 的 水 解 效 率 [7] 另 一 类 是 称 为 expansin-like 的 类 扩 张 蛋 白, 其 序 列 与 扩 张 蛋 白 有 高 度 的 同 源 性, 可 由 真 菌 [8] [9,10] 细 菌 等 微 生 物 产 生 如 一 种 来 源 于 细 菌 的 类 扩 张 蛋 白 BsEXLX1 在 与 滤 纸 作 用 时 表 现 出 既 具 有 纤 维 素 结 合 活 性, 又 具 有 降 低 纤 维 素 机 械 强 度 的 活 性 此 外 在 加 入 低 纤 维 素 酶 量 进 行 滤 纸 水 解 时, BsEXLX1 能 与 纤 维 素 酶 发 生 协 同 增 效 作 用, 所 得 产 物 量 是 未 加 BsEXLX1 时 的 5.7 倍 [9] 最 近 发 现 从 玉 米 秸 秆 中 分 离 到 的 一 种 蛋 白 (Zeah) [11] [12] 和 另 一 种 疏 水 蛋 白 及 从 康 氏 木 霉 胞 外 培 养 物 中 分 离 纯 化 到 的 一 [13] 种 胞 外 蛋 白 均 能 显 著 提 高 纤 维 素 酶 水 解 纤 维 素 的 能 力 因 此, 将 这 些 增 效 蛋 白 作 为 添 加 剂 用 于 纤 维 素 的 酶 水 解 为 提 高 纤 维 素 酶 水 解 效 率 降 低 生 产 成 本 带 来 了 希 望 但 目 前 有 关 增 效 蛋 白 的 研 究 多 针 对 产 增 效 蛋 白 的 植 物, 有 报 道 的 能 产 增 效 蛋 白 的 微 生 物 仅 涉 及 少 数 几 个 菌 株, 有 关 产 增 效 蛋 白 的 菌 株 筛 选 发 酵 条 件 优 化 的 研 究 鲜 见 报 道 本 研 究 通 过 建 立 一 种 产 纤 维 素 酶 增 效 蛋 白 菌 株 的 筛 选 方 法, 从 土 壤 中 分 离 得 到 一 株 产 纤 维 素 酶 增 效 蛋 白 的 细 菌 POEP1, 并 对 其 培 养 基 和 培 养 条 件 进 行 了 系 统 优 化, 为 进 一 步 开 发 产 增 效 蛋 白 的 微 生 物 资 源 和 利 用 其 在 纤 维 素 酶 降 解 纤 维 材 料 中 的 潜 在 应 用 价 值 打 下 基 础 2 材 料 与 方 法 2.1 实 验 材 料 样 品 采 集 : 土 壤 样 品 取 自 广 西 大 学 农 学 院 水 稻 田 甘 蔗 田 玉 米 田 及 南 宁 市 石 门 森 林 公 园 松 树 林 富 集 培 养 基 : 牛 肉 膏 5 g L 1, 蛋 白 胨 3 g L 1, NaCl 5 g L 1,pH 6.0 纯 化 平 板 : 在 富 集 培 养 基 基 础 上 加 入 琼 脂, 使 培 养 基 中 琼 脂 浓 度 达 25 g L 1 产 纤 维 素 酶 增 效 蛋 白 培 养 基 : 甘 蔗 渣 ( 过 80 目 筛 )15.0 g,(nh 4 ) 2 SO g,kh 2 PO g MgSO 4 7H 2 O 1.5 g, 加 自 来 水 至 1000 ml, 调 ph 主 要 试 剂 纤 维 素 酶 ( 来 源 于 黑 曲 酶 Aspergillus niger) 滤 纸 (Whatman No.1, 均 购 自 Sigma 公 司 ),Sephadex G-75 ( 购 自 Pharmacia 公 司 ), 其 它 试 剂 均 为 分 析 纯 试 剂 2.3 方 法 菌 种 分 离 纯 化 取 10 g 土 样 于 90 g 无 菌 生 理 盐 水 中, 加 入 玻 璃 珠 打 散, 取 上 清 液 5 ml 于 45 ml 富 集 培 养 基 中,37 下 160 r min 1 培 养 2~3 d 富 集 培 养 后 梯 度 稀 释, 涂 布 于 纯 化 平 板,37 下 培 养 2 d, 从 中 挑 取 具 有 典 型 细 菌 菌 落 特 征 的 单 菌 落 进 一 步 划 线 分 离 纯 化, 单 菌 落 经 镜 检 确 定 为 单 一 菌 种 后 编 号 于 4 冰 箱 中 保 存 产 纤 维 素 酶 增 效 蛋 白 菌 株 的 筛 选 将 保 存 的 细 菌 分 别 挑 一 环 到 富 集 培 养 基, 在 160 r min 1 37 条 件 下 培 养 2~3 d, 按 2 % 的 量 接 种 到 产 纤 维 素 酶 增 效 蛋 白 培 养 基 中, 于 160 r min 1 37 条 件 下 培 养 3 d,6 层 纱 布 过 滤 收 集 滤 液, 冷 冻 离 心 (4,6000 r min 1,20 min), 上 清 液 经 超 滤 膜 浓 缩 后 用 85% 饱 和 度 的 (NH 4 ) 2 SO 4 盐 析, 离 心 收 集 沉 淀, 用 去 离 子 水 复 溶 后 进 行 Sephadex G-75 层 析 分 离 ( 柱 直 径 18 mm 填 料 高 度 45 cm 上 样 3 ml, 流 速 0.5 ml min 1 ), 收 集 无 纤 维 素 酶 活 的 蛋 白 峰, 供 纤 维 素 酶 增 效 实 验 选 择 有 纤 维 素 酶 增 效 活 力 的 菌 株 为 入 选 菌 株 纤 维 素 酶 活 力 测 定 还 原 糖 测 定 采 用 DNS 法 [14]

3 第 27 卷 第 1 期 覃 益 民 等 : 产 纤 维 素 酶 增 效 蛋 白 菌 株 的 筛 选 及 培 养 条 件 优 化 115 纤 维 素 酶 滤 纸 酶 活 力 (FPA) 测 定 参 考 文 献 [15] 进 行 滤 纸 酶 活 力 单 位 定 义 : 以 1 min 催 化 滤 纸 水 解 形 成 1 μg 还 原 糖 所 需 要 的 酶 量 为 一 个 酶 活 单 位 U 蛋 白 对 纤 维 素 酶 滤 纸 酶 活 增 效 实 验 在 滤 纸 酶 活 力 (FPA) 测 定 方 法 上 略 加 改 动, 向 试 管 中 分 别 加 入 滤 纸 (what man No.1)(50.0±0.5) mg 柠 檬 酸 钠 缓 冲 液 (ph4.8,50 mmol ml 1 ) 2 ml 供 试 蛋 白 样 0.5 ml((86±3) g ml 1 ) 和 纤 维 素 酶 0.5 ml (11.31 FPA ml 1 ), 在 50 中 水 解 反 应 1 h 后 测 定 滤 纸 酶 活 力, 以 单 独 添 加 同 样 量 纤 维 素 酶 水 解 反 应 1 h 后 所 测 滤 纸 酶 活 力 作 对 照 来 判 断 增 效 效 果 ( 增 效 活 力 ), 用 U 表 示 : 增 效 活 力 U FPAcellulase proteins FPAcellulase 式 中 :FPA cellulase+proteins 同 时 添 加 纤 维 素 酶 和 蛋 白 样 时 酶 活 ; FPA cellulase 仅 添 加 纤 维 素 酶 时 酶 活 每 组 做 三 个 平 行 试 验 菌 种 鉴 定 形 态 鉴 定 : 在 纯 化 平 板 上 划 线 培 养 2 天 后 进 行 菌 落 形 态 观 察 16S rdna 鉴 定 : 筛 选 到 的 菌 株 送 上 海 生 工 生 物 工 程 技 术 服 务 有 限 公 司 进 行 16S rdna 鉴 定 3 结 果 与 分 析 3.1 产 纤 维 素 酶 增 效 蛋 白 菌 种 的 筛 选 通 过 平 板 涂 布 及 划 线 法 从 土 壤 中 分 离 纯 化 得 到 22 株 菌 落 形 体 差 异 较 大 的 细 菌 菌 株, 经 对 他 们 的 培 养 液 中 蛋 白 进 行 超 滤 浓 缩 (NH4) 2 SO 4 盐 析 及 Sephadex G-75 凝 胶 过 滤 层 析 初 步 纯 化 及 增 效 实 验, 发 现 其 中 一 株 所 产 蛋 白 对 纤 维 素 酶 的 滤 纸 酶 活 有 明 显 的 增 效 作 用, 将 该 菌 株 命 名 为 POEP1 其 蛋 白 层 析 洗 脱 曲 线 如 图 1, 纤 维 素 酶 活 测 定 结 果 显 示 三 个 蛋 白 峰 均 无 酶 活, 其 中 仅 有 峰 I 对 纤 维 素 酶 有 增 效 作 用 A280 / nm Ⅰ Ⅱ Ⅲ Reducing sugar / μg 4500 cellulase cellulase+protein Time / min 图 1 Sephadex G-75 层 析 洗 脱 曲 线 Fig.1 Sephadex G-75 elution curve Time / h 图 2 还 原 糖 产 量 的 时 间 进 程 曲 线 Fig.2 Time courses for reducing sugar 当 峰 I 的 增 效 蛋 白 (10 ml g 1 纤 维 素 ) 与 纤 维 素 酶 ( 纤 维 素 酶 113 FPA g 1 纤 维 素 ) 一 起 添 加 到 滤 纸 中 进 行 水 解 时, 水 解 h 还 原 糖 的 产 量 分 别 比 单 独 添 加 同 量 纤 维 素 酶 到 滤 纸 中 进 行 水 解 时 提 高 了 104.1% 106.4% 99.8% 109.6%( 见 图 2), 说 明 POEP1 所 产 的 胞 外 蛋 白 在 协 同 纤 维 素 酶 降 解 纤 维 材 料 的 过 程 中 显 示 出 明 显 的 促 进 作 用, 其 确 实 是 一 种 纤 维 素 酶 的 增 效 蛋 白, 与 已 有 文 献 报 道 相 比,POEP1 菌 株 所 产 的 胞 外 蛋 白 对 纤 维 素 酶 水 解 纤 维 原 料 的 还 原 糖 产 量 提 高 率 虽 比 来 源 于 细 菌 Bacillus subtili [9] 和 Hahella chejuensis [10] [11] 的 类 扩 张 蛋 白 及 来 源 玉 米 秸 秆 的 Zea h 蛋 白 小 一 些 ( 分 别 为 240% 260% 和 200%), 但 文 献 报 道 所 用 的 增 效 蛋 白 均 为 纯 化 后 的 蛋 白, 而 本 文 增 效 试 验 所 用 POEP1 胞 外 蛋 白 的 纯 度 浓 度 并 不 高, 增 效 作 用 条 件 及 产 蛋 白 条 件 也 未 进 行 优 化, 故 其 在 纤 维 质 原 料 水 解 中 具 有 很 大 的 潜 在 应 用 价 值 因 此 对 筛 选 到 的 该 菌 株 进 行 鉴 定 及 产 纤 维 素 酶 增 效 蛋 白 条 件 优 化 研 究

4 116 高 校 化 学 工 程 学 报 2013 年 2 月 3.2 菌 种 鉴 定 将 POEP1 菌 株 接 种 于 纯 化 平 板, 培 养 48 h 后 观 察 菌 落 形 态 菌 落 在 平 板 上 呈 黄 色, 表 面 光 滑 不 透 明, 脐 状, 易 挑 起, 无 异 味, 革 兰 氏 染 色 呈 阴 性 16SrDNA 分 类 鉴 定 结 果 表 明, 该 菌 株 属 于 假 单 胞 菌 属 (Pseudomonas), 且 与 栖 稻 假 单 胞 菌 (Pseudomonas oryzihabitans) 同 源 性 高 达 99.3%, 因 此 确 定 该 菌 株 为 栖 稻 假 单 胞 菌 (Pseudomonas oryzihabitans) 目 前 还 无 该 菌 属 产 纤 维 素 酶 增 效 蛋 白 的 相 关 报 道 3.3 最 佳 碳 源 氮 源 的 选 择 分 别 改 变 基 础 培 养 基 中 碳 源 及 氮 源 的 种 类 进 行 培 养, 取 培 养 72 h 的 培 养 液 测 定 其 增 效 活 力 由 表 1 可 知 麦 麸 为 最 适 碳 源 黄 豆 粉 和 酵 母 膏 效 果 差 距 不 大, 从 经 济 角 度 考 虑 选 用 黄 豆 粉 作 氮 源 因 此 选 用 麦 麸 和 黄 豆 粉 作 为 培 养 基 的 碳 源 和 氮 源 表 1 不 同 碳 源 和 氮 源 对 增 效 活 力 的 影 响 Table 1 Effect of carbon source and nitrogen source type on synergetic activity Carbon source Glucose Sucrose Corn flour Bagasse Wheat bran CMC-Na MCC Cellobiose U / U ml Nitrogen source Soybean flour Yeast cream Urea Peptone Ammonium sulfate U / U ml 响 应 面 法 优 化 培 养 条 件 Plackett-Burman 设 计 筛 选 影 响 产 纤 维 素 素 酶 增 效 蛋 白 的 主 效 因 子 依 据 已 确 定 的 碳 源 麦 麸 (A) 与 氮 源 黄 豆 粉 (B), 以 培 养 基 中 各 种 成 分 浓 度 如 MgSO 4 7H 2 O(D) KH 2 PO 4 (E) 及 装 液 量 (C) ph 值 (G) 接 种 量 (F) 培 养 时 间 (I) 培 养 温 度 (H) 摇 床 转 速 (J) 接 种 菌 龄 (K) 等 11 个 因 素 作 为 研 究 对 象, 考 察 各 个 因 子 对 POEP1 菌 株 产 纤 维 素 酶 增 效 蛋 白 的 影 响 实 验 采 用 二 水 平 Plackett-Burman 设 计, 实 验 设 计 及 结 果 见 表 2 Run A / g L 1 B 表 2 Plackett-Burman 实 验 设 计 及 结 果 Table 2 Plackett-Burman design matrix and actual values of synergetic activity C D E F H I / g L 1 / ml / g L 1 / g L 1 G / % / / h J K / r min 1 / h U / U ml ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.15 对 Plackett-Burman 的 实 验 结 果 进 行 多 项 式 的 回 归 分 析 得 到 方 程 如 下 : U = A+3.36B+0.014C+0.96D 0.89E 0.75F+0.12H 0.012J 0.13K 方 程 拟 合 的 相 关 性 为 R 2 = , 表 明 该 多 项 式 较 好 的 反 映 出 各 因 素 与 增 效 活 力 的 真 实 关 系, 可 用 于 显 著 因 素 的 筛 选 F 值 分 析 表 明 对 增 效 蛋 白 活 力 有 较 显 著 影 响 的 因 素 (0.01<P<0.1) 有 6 个, 极 显 著 因 素 (P<0.01) 有 3 个 : 分 别 为 麦 麸 质 量 浓 度 黄 豆 粉 质 量 浓 度 和 KH 2 PO 4 质 量 浓 度 而 ph 值 和 培 养 时 间 两 个 因 素 则 没 有 影 响, 故 在 回 归 方 程 中 没 有 出 现 这 两 项 选 择 极 显 著 因 素 进 行 响 应 曲 面 优 化, 其 他 因 素 均 选 择 低 水 平 值 Box-Behnken 实 验 设 计 与 结 果 由 Plackett-Burman 实 验 设 计 得 出 了 对 增 效 蛋 白 活 力 有 显 著 影 响 的 3 个 因 素 ( 麦 麸 质 量 浓 度 A 黄 豆 粉 质 量 浓 度 B 和 KH 2 PO 4 质 量 浓 度 E) 为 了 确 定 最 优 培 养 条 件, 利 用 响 应 曲 面 法 (Box-Behnken 设 计 ) 对 这 3 个 极 显 著 因 素 进 一 步 优 化 借 助 设 计 软 件 Design-Expert version 7.1.3, 进 行 Box-Behnken 实 验 设 计, 设 计 方 案 及 结 果 如 表 3 所 示

5 第 27 卷 第 1 期 覃 益 民 等 : 产 纤 维 素 酶 增 效 蛋 白 菌 株 的 筛 选 及 培 养 条 件 优 化 117 利 用 Design Expert 软 件 对 表 3 的 数 据 进 行 二 次 拟 合, 获 得 增 效 蛋 白 活 力 U 与 麦 麸 质 量 浓 度 (A) 黄 豆 粉 质 量 浓 度 (B) KH 2 PO 4 质 量 浓 度 (E) 的 二 次 项 回 归 方 程 : 表 3 Box-Behnken 实 验 设 计 及 实 验 结 果 Tabel 3 Box-Behnken design matrix and actual values of synergetic activity Run A / g L 1 B / g L 1 E / g L 1 U / U ml ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.09 U A 2.61B E AB AE -0.40BE A B E 对 二 次 回 归 方 程 进 行 方 差 分 析, 模 型 P 值 为 (P<0.01), 表 明 模 型 极 显 著 且 只 有 0.34% 是 因 为 误 差 导 致 的, 模 型 失 拟 项 = >0.05 R 2 =0.9254>0.9 说 明 模 型 失 拟 度 不 高 线 性 拟 合 较 好, 回 归 方 程 可 以 较 好 的 描 述 各 因 素 水 平 与 增 效 活 力 之 间 的 真 实 关 系, 可 以 利 用 该 模 型 指 导 增 效 蛋 白 培 养 条 件 优 化 方 差 分 析 还 表 明 麦 麸 质 量 浓 度 (A) 对 菌 种 产 增 效 蛋 白 活 性 有 极 显 著 影 响 (P<0.01), 但 黄 豆 粉 质 量 浓 度 (B) 和 KH 2 PO 4 质 量 浓 度 (E) 在 本 实 验 取 值 范 围 内 增 效 蛋 白 活 力 影 响 不 显 著 在 因 素 的 交 互 作 用 中 只 有 麦 麸 质 量 浓 度 (A) 和 KH 2 PO 4 质 量 浓 度 (E) 较 显 著 (P<0.1) 响 应 曲 面 结 果 分 析 根 据 二 次 回 归 方 程 所 作 的 响 应 曲 面 图 及 等 E:Mass concentration A:Mass concentration 高 线 图 也 能 比 较 直 观 地 解 释 各 因 素 和 因 素 之 间 of KH 2 PO 4 / g L 1 of wheat bran / g L 1 对 增 效 蛋 白 活 力 的 影 响 等 高 线 的 疏 密 程 度 反 映 图 3 U = f(a,e) 的 响 应 面 和 等 高 线 分 析 Fig.3 U = f(a,e)of response surface and contour plots 单 个 因 素 对 响 应 值 的 影 响, 等 高 线 越 密 影 响 越 显 著 ; 等 高 线 弯 曲 程 度 可 反 映 因 素 之 间 交 互 作 用 的 强 弱, 弯 曲 度 大 ( 趋 向 圆 形 ) 说 明 因 素 交 互 作 用 明 显 由 于 AE 交 互 项 的 影 响 显 著, 图 3 给 出 了 A E 项 对 模 型 的 交 互 作 用 的 分 析 图 图 3 显 示, 当 黄 豆 粉 固 定 在 中 间 水 平 20.0 g L 1 时,E 在 浓 度 低 时, 随 着 A 的 增 加, 响 应 值 U 增 加 很 快, 后 缓 慢 减 少, 表 现 了 非 线 性 的 关 系 当 E 在 浓 度 高 时, 随 着 A 的 增 加, 响 应 值 U 增 加 变 缓, 后 减 少 加 快, 同 样 表 现 了 非 线 性 的 关 系 当 A 在 浓 度 低 时,E 表 现 的 性 质 相 似 但 当 A 在 浓 度 高 时, 随 着 E 的 增 加, 响 应 值 U 增 加 却 不 大, 后 减 少 加 快 另 从 等 高 线 可 以 看 出, 麦 麸 浓 度 与 KH 2 PO 4 浓 度 的 交 互 作 用 较 显 著, 这 与 方 差 分 析 中 AE 项 (P = ) 小 于 0.1 相 对 应 响 应 面 的 最 高 点 和 等 高 线 的 中 心 点 在 所 取 值 范 围 内, 可 知 在 所 选 的 区 域 有 最 大 的 U 值 利 用 软 件 Design Expert 对 二 次 响 应 面 方 程 的 U 进 行 极 值 分 析, 可 以 得 到 三 个 因 素 理 论 预 测 最 优 点 分 别 为 麦 麸 质 量 浓 度 32.3 g L 1, 黄 豆 粉 质 量 浓 度 24.7 g L 1, KH 2 PO 4 质 量 浓 度 4.26 g L 1, 预 测 最 大 值 为 U ml 1 根 据 模 型 分 析 得 出 的 最 优 水 平 再 分 别 做 三 组 平 行 实 验, 实 测 增 效 蛋 白 活 力 均 值 为 U ml 1, 预 测 值 与 真 实 在 的 相 似 度 达 到 92.5%, 在 90% 的 置 信 区 内, 从 而 表 明 模 型 较 好 的 适 用 增 效 蛋 白 的 培 养 优 化 优 化 后 的 培 养 基 相 对 与 未 优 化 培 养 基 的 增 效 蛋 白 活 力 (15.79 U ml 1 ) 提 高 了 1.7 倍 U /U ml 1 4 结 论 (1) 建 立 起 一 种 产 纤 维 素 酶 增 效 蛋 白 菌 株 的 筛 选 方 法, 从 土 壤 中 筛 选 得 到 一 株 产 纤 维 素 酶 增 效 蛋 白 的 细 菌 菌 株 POEP1, 所 产 蛋 白 对 纤 维 素 酶 滤 纸 酶 活 有 明 显 的 增 效 作 用, 其 在 纤 维 质 原 料 水 解 中 具 有 潜 在 应 用 价 值 通 过 16SrDNA 分 类 鉴 定, 确 定 该 菌 株 为 栖 稻 假 单 胞 菌 (Pseudomonas oryzihabitans) 目 前 还 无

6 118 高 校 化 学 工 程 学 报 2013 年 2 月 该 菌 属 产 纤 维 素 酶 增 效 蛋 白 的 相 关 报 道 (2) 对 POEP1 产 纤 维 素 酶 增 效 蛋 白 培 养 条 件 进 行 了 优 化 通 过 单 因 素 实 验 确 定 最 佳 碳 源 氮 源 分 别 为 麦 麸 和 黄 豆 粉 通 过 Plackett-Burman 实 验 设 计 分 别 对 培 养 基 成 分 及 培 养 条 件 等 11 个 相 关 因 素 进 行 筛 选, 得 出 麦 麸 质 量 浓 度 黄 豆 粉 质 量 浓 度 和 KH 2 PO 4 质 量 浓 度 是 对 增 效 活 力 有 极 显 著 影 响 的 三 个 因 素 通 过 Box-Behnken 实 验 设 计 和 响 应 曲 面 分 析 法 确 定 这 三 个 因 素 的 最 佳 水 平 为 : 麦 麸 浓 度 32.3 g L 1, 黄 豆 粉 浓 度 24.7 g L 1, KH 2 PO 4 浓 度 4.36 g L 1, 其 他 因 素 选 择 低 水 平 值 优 化 后 的 纤 维 素 酶 增 效 蛋 白 对 纤 维 素 酶 滤 纸 酶 活 的 增 效 活 力 为 U ml 1, 较 未 优 化 时 的 增 效 活 力 U ml 1 提 高 了 1.7 倍 参 考 文 献 : [1] Raj K, Sompal S, Om V S. Bioconversion of lignocellulosic biomass: biochemical and molecular perspectives [J]. J Ind Microbiol Biotechnol, 2008, 35(5): [2] Henning Jørgensen, Jan Bach Kristensen, Claus Felby. Enzymatic conversion of lignocellulose into fermentable sugars: challenges and opportunities [J]. Biofuels Bioprod Bioref, 2007, 1(2): [3] Hahn-Hägerdal B, Galbe M, Gorwa-Grauslund M F, et al. Bio-ethanol the fuel of tomorrow from the residues of today[j]. Trends Biotechnol, 2006, 24(12): [4] Vincent, Eijsink G H, Gustav Vaaje-Kolstad, et al. Towards new enzymes for biofuels: lessons from chitinase research [J]. Trends in Biotechnology, 2008, 26(5): [5] Baker J O, King M R, Adney W S, et al. Investigation of the cell-wall loosening protein expansin as a possible additive in the enzymatic saccharification of lignocellulosic biomass [J]. Appl Biochem Biotechnol, 2000, 84(7): [6] Cosgrove D J. Loosening of plant cell walls by expansins [J]. Nature, 2000, 407(6802): [7] Cosgrove D J. Enhancement of accessibility of cellulose by expansins: US, B1 [P] [8] Markku S, Marja P, Satu H, et al. Swollenin, a Trichoderma reesei protein with sequence similarity to the plant expansins, exhibits disruption activity on cellulosic materials [J]. Eur J Biochem, 2002, 269(17): [9] Kim E S, Lee H J, Bang W G, et al. Functional characterization of a bacterial expansin from Bacillus subtilis for enhanced enzymatic hydrolysis of cellulose [J]. Biotechnol Bioeng, 2009, 102(5): [10] Lee H J, Lee S Y, Ko H Y, et al. An expansin-like protein from Hahella chejuensis binds cellulose and enhances cellulase activity [J]. Molecules and Cells, 2010, 29(4): [11] Han Y J, Chen H Z. Synergism between corn stover protein and cellulose [J]. Enzyme Microb Technol, 2007, 41(5): [12] Han Y J, Chen H Z. Synergism between hydrophobic proteins of corn stover and cellulase in lignocellulose hydrolysis [J]. Biochem Eng J, 2010, 48(2): [13] QIN Yi-min ( 覃 益 民 ), GAO Jin ( 高 进 ), LIU You-yan ( 刘 幽 燕 ), et al. Purification of a cellulase activity enhancing protein originated from Trichoderma Koningii ( 一 种 来 源 于 康 氏 木 霉 的 纤 维 素 酶 增 效 蛋 白 的 分 离 纯 化 )[J]. J Chem Ind and Eng(China) ( 化 工 学 报 ), 2011, 62(10): [14] Miller G L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar [J]. Anal Chem, 1959, 31(3): [15] National Renewable Energy Laboratory. Measurement of cellulase activities[eb/ol]. [ ]. http: // docs/gen/fy08/42628.pdf.

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