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隼殷
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1 不同浓度丁酸钠诱导未成熟树突状细胞的 # 免疫学功能研究刘璐, 闵军, 伍衡, 王捷, 曾育杰, 褚忠华 ( 中山大学孙逸仙纪念医院, 广州 ) 摘要 : 目的探讨不同浓度丁酸钠诱导对于体外培养的树突状细胞 (dendritic cells, DC) 免疫刺激活性的影响方法通过 rhgm-csf 和 IL-4 体外诱导的人单个核细胞来源的 DC, 按照 0.5mmol L mmol L-1 0.1mmol L-1 3 种浓度丁酸钠体外诱导分化, 并分别以流式细胞仪,FITC-Dxtran 内吞检测 MLR ELISA 法检测 DC 的凋亡率表面标志内吞能力刺激淋巴细胞增殖能力和 IL-10 IL-12 INF-γ 分泌的变化结果不同浓度丁酸钠均可抑制 DC 表面成熟标记的表达, 随着丁酸钠浓度升高, 抑制作用越明显, 其中以 1.0mmol L-1 丁酸钠效果最稳定虽然 0.75mmol L-1 丁酸钠诱导下的 DC 内吞能力最强, 但 1.0mmol L-1 丁酸钠组 DC 的 IL-10 分泌量最大, 抑制淋巴细胞增殖能力最强结论 1.0mmol L-1 丁酸钠是诱导 DC 稳定不成熟状态及免疫学功能的最佳浓度关键词 : 树突状细胞 ; 丁酸钠 ; 免疫耐受 Induced immature human monocyte-derived dendritic cells by different concentration Sodium butyrate and its immunological function LIU Lu, MIN Jun, WU Heng, WANG Jie, ZENG Yujie, CHU Zhonghua (Sun Yat-sen memorial Hospital of Sun Yat-sen University, GuangZhou ) Abstract: [Objective] To investigate the immunity effect of different concentration Sodium butyrate on immature dendritic cells in vitro. [Methods] The human monocyte-derived dendritic cells were induced in the presence of cytokine recombined human GM-CSF and interleukin (IL)-4.The effects of different concentrations Sodium butyrate on the dendritic cells were detected by the FCM, endocytic activity, T cells stimulatory proliferation capacity, and IL-10 IL-12 INF-γ production. [Results] All three different concentrations of sodium butyrate could down-regulate the major histocompatibility complex(mhc) class II and costimulatory molecules of dendritic cells. The DC induced by 0.75mmol L-1 sodium butyrate had the largest endocytic activity. However the DC induced by 1.0mmol/L sodium butyrate had the best capacity to induce a stage of T-cell anergy, inhibit the IL-10 and T helper cell type 1-skewing factor IL-12 INF-γ production. [Conclusions] The 1.0mmol L-1 was the most effective concentration of sodium butyrate for inducing dendritic cells immaturation state. Keywords:Dendritic cell; Sodium butyrate; Immunotolerance ** 0 引言树突状细胞 (dendritic cells,dc) 作为体内功能最强的专职抗原递呈细胞, 其不同成熟的状态具有不同的免疫特性成熟 DC(mature DC,mDC) 通过激活 T 细胞产生免疫应答 [1], 不成熟 DC(immature DC,imDC) 则诱导免疫耐受发生 [2-4] imdc 的这种特性使其在治疗自身免疫性疾病和诱导移植免疫耐受方面具有广阔的应用前景丁酸钠 (sodium butyrate, Na-B) 是一种无毒的四碳短链脂肪酸, 是细胞内组蛋白去乙酰化酶抑制剂, 通过抑制组蛋白去乙酰化酶活性发挥对基因的调控作用目前主要用于肿瘤细胞和干细胞的诱导分化研究 [5,6] 我们在前期已经证实丁酸钠稳定诱导人外周血来源 DC 保持不成熟状态的基础上, 进基金项目 : 教育部新教师基金 ( ); 国家青年科学基金项目 ( ) 作者简介 : 刘璐,(1975-), 男, 医学博士, 主治医师, 研究方向 : 胃肠道肿瘤免疫研究通信联系人 : 褚忠华,(1968-), 男, 副教授, 主要研究方向 : 胃肠道肿瘤的综合治疗. CHU9009@163.com - 1 -

2 一步探讨通过不同浓度丁酸钠诱导下 imdc 的免疫学功能改变, 寻求最佳的诱导浓度 [7] 1 材料 1.1 主要试剂 RPMI-1640 干粉 L-glutamine 青霉素 - 链霉素 (P-S) 双抗 (Gibco 公司 ); 胎牛血清 (FCS, 杭州四季青公司 ); Ficoll 淋巴细胞分离液 ( 相对密度 1.077g/L) (Lymphoprep TM 公司 ); 重组人粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子 (rhgm-csf) 人重组白细胞介素 (IL)-4 (PEPRO TECH 公司 ); 藻红蛋白 (phycoerythrin,pe) 标记小鼠抗人 CD83 HLA-DR B7-H4 B7-DC, 异硫氰酸 (fluoreceinisothiocyanate,fitc) 标记小鼠抗人 CD86 CD80 CD1a 荧光单克隆抗体 AnnexinV-FITC/PI 双染法流式细胞分析试剂盒 (Pharmingen 公司 ); 脂多糖 (LPS) 丁酸钠 (sodium butyrate, Na-B) FITC-dextran(40 000MW)( Sigma 公司 ); 活细胞荧光染料羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯 (carboxyfluoroscein succinimidyl ester,cfse) (Molecular Probes 公司 ); 人 IL-12 (p40)elisa 检测试剂盒 (DiClone 公司 );IL-10 IFN-γ ELISA 检测试剂盒 (Uscn life Science & Technology 公司 ) 1.2 人外周血样品实验所用人外周血样品均取自我校身体健康的大学生志愿捐献者, 共 5 份, 每份 100mL, 均在献血后 2h 内进行外周血单个核细胞和淋巴细胞分离 2 方法 2.1 DC 的培养与诱导用 Ficoll 密度梯度离心法分离 PBMC,PBS 洗涤 2 次, 用 RPMI 1640 完全培养基 ( 含 10 % 灭活胎牛血清,2 mmol L -1 的 L- 谷氨酰胺, U L -1 P- S 双抗 ) 将 PBMC 密度调到 cells L -1, 加入 25cm 2 培养瓶,37 5% CO 2 培养 2h, 洗去非贴壁细胞保存备用贴壁细胞用含 U L -1 rhgm-csf 和 U L -1 人重组 IL-4 的 RPMI 1640 完全培养 -1 基培养, 第 3d 加入新培养基及 rhgm-csf 和 IL-4 第 6d 时收获未成熟 DC, 按 L 浓度接种 24 孔板, 每孔体积 1ml, 继续用 rhgm-csf 和 IL-4 培养, 并分组诱导 DC 成熟 A 组 : 对照组, 仅用 rhgm- CSF 和 IL- 4 培养 ;B 组 : 脂多糖 (LPS) 诱导组, 加入 LPS 1mg L -1 ; C 组 :1mmol L -1 丁酸钠诱导组, 加入丁酸钠 1mmol L -1 ;D 组 :0.75mmol/ L -1 丁酸钠诱导组, 加入丁酸钠 0.75mmol L -1 ;E 组 :0.5mmol L -1 丁酸钠诱导组, 加入丁酸钠 0.5mmol L -1 ; 各组均在诱导 24h 后收获 DC, 流式细胞仪进行细胞表型分析采用 Annexin V/PI 双染色法通过流式细胞仪行细胞调亡的检测同时收集培养上清,-80 保存, 用于检测 IL-10 IFN-γ IL-12 p40 含量 2.2 DC 表面标志的流式细胞仪分析 75 用直接免疫荧光标记法标记 DC,FACS Calibur 流式细胞仪 (B-D 公司 ) 上检测成熟表型 CD80 CD83 CD86 HLA-DR CD1a,CellQuest 软件分析每个样品都用荧光标记同型 IgG 作为相应的阴性对照 2.3 DC 内吞能力的检测以 FITC-Dextran 摄取量的多少来反映 DC 的摄取抗原能力 DC 培养的第 7d 分别收集 - 2 -

3 80 各组 DC, 用 10%FCS 的 1640 培养基调整细胞浓度为 L -1, 分别取 cells 加入 FITC-Dextran (0.5g L -1 ), 混匀后分置 4 和 37,2 h 后取出, 用冰冷的 PBS 洗涤细胞 2 次后, 于流式细胞仪上进行定量分析, 以平均荧光密度表示摄取量每组设 4 对照并减去其荧光密度来排除非主动性摄取 2.4 ELISA 法检测 DC 的 IL-10 IL-12 IFN-γ 分泌 85 采用双抗体夹心法检测 IL-10 IL-12p40 IFN-γ 的含量, 操作步骤按产品说明书进行, 显色后即刻用 Wellscan MK3 酶标仪 (Labsvstems Dragon 公司 ) 检测 450nm 波长的吸光度 A 值, 根据标准曲线确定含量可检测范围 IL-10( ug L -1 ) IL-12p40( ng L -1 ) IFN-γ( ng L -1 ) 2.5 混合淋巴细胞反应 (mixed lymphocyte reaction, MLR) 收集第培养 7d 各组 DC, 加入丝裂霉素 C 混和 ( 终浓度为 25mg L -1 ), 37 避光水浴 30 min 后,PBS 离心洗涤 3 次, 重悬细胞同时收集 2h 非贴壁的同种异体淋巴细胞, 以 PBS 洗涤 2 次后加入 CFSE 2.5uM 染液使细胞浓度为 L -1 置于 37 度水浴 15min, 每 5min 摇动一次用 RPMI 1640 完全培养基中止染色, 离心后重悬细胞将上述刺激细胞和应答 -1 细胞按 1:10 混合, 以 200μL 孔种至 96 孔 U 形底细胞培养板, 并设只有反应细胞的孔为对照于 37 5%CO 2 条件下培养混合培养 96 h 后, 收集细胞并洗涤后, 送流式分析在前散射 (FSC) 和对侧散射 (SSC) 二维散点图中划出淋巴细胞区 R, 分别对每个组别的这群细胞的 FL1 强度进行检测, 获得的数据用 CELL Quest 软件和 ModFit TM 软件分析 3 统计学处理采用 SSPS15.0 统计软件进行各组间方差分析各组数据以均数 ± 标准差 ( x ±s) 表示, 计数资料组间比较采用 t 检验和 ANOVA 4 结果不同浓度丁酸钠诱导下 DC 细胞的凋亡率 DC 凋亡率流式细胞仪检测结果见图 1 结果显示 1mmol L -1 丁酸钠组 DC 凋亡率为 5.91 ±1.31, 较其它各组显著升高 (P<0.05) 而 0.75mmol L -1 和 0.5mmol L -1 丁酸钠诱导下 DC 的凋亡率与对照组比较无显著差异 (P>0.05) - 3 -

4 105 图 1 各组 DC 细胞凋亡率的比较 Fig 1 The apoptosis index comparision of the different DC groups.( x ±s. n=5) * P<0.05 vs other groups. 4.2 不同浓度丁酸钠对于 DC 表面标志的影响 DC 表面标志的流式细胞仪检测结果见表 1 在成熟表型中, 除 HLA-DR 的表达在 0.5mmol L -1 丁酸钠组与 LPS 组间无显著差异外, 各丁酸钠诱导组 DC 成熟表型表达均低于 LPS 组 (P<0.05) 尤其成熟标志 CD83, 各丁酸钠诱导组表达显著低于对照组 (P<0.05) 不同浓度丁酸钠诱导组 DC 在成熟表型 CD1a CD83 HLA-DR 的表达组间无显著差异 0.5mmol L -1 丁酸钠组 DC 在 CD80 表达显著高于其它丁酸钠诱导组 (P<0.05) 各组 DC 间 CD86 均呈高水平表达表 1 各诱导组 DC 细胞表型的比较 Tab 1 The phenotype comparision of the different DC groups. ( x ±s. n=5) * P<0.05 vs LPS CD 80 CD 83 CD 86 HLA-DR CD1a Control 71.43± ± ± ± ±8.90 LPS 92.60± ± ± ± ±12.77 Na-B(1.0) 55.26±5.22** # 5.32±7.55** 82.11± ±9.60 * 37.91±7.03** Na-B(0.75) 58.94±4.01** # 3.22±2.19** 79.98± ±13.15* 29.80±11.32** Na-B(0. 5) 75.41±6.25** 3.67±3.13** 90.11± ± ±9.56 ** ** P<0.01 vs LPS, # P<0.05 vs Na-B(0.05) 不同浓度丁酸钠诱导下 DC 内吞能力的变化 DC 可通过其表面甘露糖受体主动吞噬 Dextran 荧光标记的 Dextran 被 DC 吞噬后, 采用流式细胞仪检测 DC 的平均荧光密度 (MFI) 可反映其内吞能力和摄取抗原的能力未成熟 DC 摄取抗原的能力强, 随着 DC 的成熟, 其摄取抗原的能力逐渐减弱图 2 结果显示, 丁酸钠诱导下 DC 的内吞能力显著高于 LPS 组 (P<0.05) 不同浓度丁酸钠诱导组间内吞能力无显著差异, 但 0.75mmol L -1 丁酸钠组 DC 内吞能力最强 - 4 -

5 图 2 各组 DC 内吞能力比较 Fig 2 The endocytic activity of different groups.( x ±s. n=5)* P <0.05 vs LPS group 不同浓度丁酸钠诱导下 DC 的 IL-12 IL-10 和 IFN-γ 分泌量变化采用双抗体夹心 ELISA 法检测各组 DC 24h 的 IL-12p40 IL-10 和 IFN-γ 分泌量, 以个 DC 在 1L 培养液中的 IL-12p40 IL-10 和 IFN-γ 的浓度表示, 结果见表 2 各丁酸钠诱导组在 IL-12p40 和 IFN-γ 的分泌量均显著低于 LPS 促成熟组 (P<0.05), 各组间无显著差异各丁酸钠诱导组 DC IL-10 的分泌量均显著高于对照及 LPS 组 (P<0.05), 且 3 组间有显著差异 (P<0.05), 其中 1.0mmol L -1 丁酸钠组 IL-10 的分泌量最高表 2 各诱导组 DC 分泌细胞因子的比较 Tab 2 The phenotype comparision of the different DC groups. ( x ±s. n=5) * P<0.05 vs LPS group. IL-12p40 IFN-γ IL-10 Control ±5.03* 97.49±4.43* 0.17±0.05 # LPS ± ± ±0.03 # Na-B(1.0) ±5.29* ±4.55* 3.29±0.21* Na-B(0.75) ±20.12* 81.76±12.45* 2.31±0.12* # Na-B(0. 5) ±15.27* ±1.98* 1.29±0.15* # # P<0.05 vs Na-B(1.0) group 4.5 不同浓度丁酸钠抑制 DC 诱导的 MLR 活细胞荧光染料 CFSE 标记淋巴细胞在分裂时,CFSE 荧光可平均分配至两个子代细胞中, 因此, 在一个连续增殖的细胞中, 单细胞荧光强度具有隔代对半递减的特征, 通过流式细胞仪分析与计算各代细胞占母代细胞的比率, 可反映淋巴细胞的增殖能力检测结果见图 3:LPS 诱导的成熟 DC 刺激淋巴细胞的增殖能力显著高于对照组和各丁酸钠诱导组 (P<0.01) 不同浓度丁酸钠诱导组间无显著差异, 但随着丁酸钠浓度增高, 增殖指数有降低的趋势 - 5 -

6 150 图 3 混合淋巴细胞反应 Fig 3 Mixed leukocyte reaction. ( x ±s. n=5) * P <0.05 vs LPS group 5 讨论树突状细胞 (DC) 起源于骨髓的 CD34 + 造血干细胞, 它可形成各种 DC 前体细胞其中, 外周血来源的 CD14 + 单个核细胞 DC 前体在 GM-CSF 和 IL-4 诱导下, 首先分化为 imdc, 在促成熟因子 (LPS) 的作用下, 进一步分化为 mdc 本实验在前期丁酸钠抑制 DC 成熟的研究基础上, 进一步探讨不同浓度丁酸钠对 DC 分化的影响我们采用 3 种不同浓度丁酸钠体外诱导 DC 分化, 凋亡结果显示丁酸钠在 1mmol/L 时的 DC 细胞凋亡率最高, 说明丁酸钠在 1mmol L -1 时的细胞毒性最强细胞成熟表型的检测结果显示,3 种浓度丁酸钠均可显著抑制 DC 成熟表型的表达, 尤其是成熟标志 CD83 表达显著低于对照组但在 3 种浓度间相比较发现,0.75mmol L -1 和 1mmol L -1 丁酸钠的抑制成熟表型表达作用更稳定, 并且抑制作用与丁酸钠浓度有一定的关系作为 imdc 重要特征之一, 各丁酸钠诱导组 DC 均保持了较强的抗原摄取能力, 其中丁酸钠在 0.75mmol L -1 时的抗原吞噬能力最强结果提示 0.75mmol L -1 可最大化上调 DC 表面甘露糖和 Fc 受体表达来增强抗原摄取能力虽然 3 种浓度丁酸钠均显著抑制 DC 分泌 IL-12 与 IFN-γ, 但组间无明显差别而抑制性因子 IL-10 的分泌结果显示, 各组均上调 IL-10 的分泌, 其中以 1.0mmol L -1 丁酸钠的作用最强 IL-10 的高表达则可抑制 T 细胞的激活和分化 [8] MLR 结果亦显示 1.0mmol L -1 丁酸钠对 imdc 抑制 T 细胞增殖的能力最稳定丁酸钠作为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂, 主要通过改变组蛋白的乙酰化程度来调整染色体结果, 促进多种基因的表达目前丁酸钠主要应用于肿瘤及白血病的研究, 其选择的浓度在 1-10mmol L -1, 但随着浓度的升高, 细胞的凋亡率显著的增加 [9] 而丁酸钠浓度与抑制 DC 分化成熟的效果之间有密切的联系, 浓度过高则可能导致 DC 功能受损, 浓度过低则达不到抑制 DC 成熟的效果 [10-12] 目前研究认为, 丁酸钠体外诱导 DC 可选的合适浓度为 mmol L -1 [13,14], 但无进一步对比研究不同浓度丁酸钠对 DC 分化的影响虽然 1mmol L -1 丁酸钠虽然对 DC 的凋亡率较 0.5 mmol L -1 和 0.75 mmol L -1 丁酸钠为高, 但 - 6 -

7 我们通过 DC 成熟表型内吞能力细胞因子分泌和 MLR 方面对 3 种不同浓度丁酸钠诱导 DC 分化进行分析, 认为 1mmol L -1 丁酸钠是抑制 DC 成熟的最佳浓度, 并可在细胞毒性和最大化抑制 DC 成熟两因素间达到一个稳定的平衡点综上所述, 本研究进一步证明丁酸钠诱导 DC 分化不成熟状态的最佳浓度, 为进一步深入研究 DC 分化过程中的表观遗传学机制提供了依据 [ 参考文献 ] (References) [1] Onai N, Manz MG. The STATs on dendritic cell development. Immunity, 2008, 28(4): [2] Barratt-Boyes SM, Thomson AW. Dendritic cells: tools and targets for transplant tolerance. Am J Transplant, 2005, 5(12): [3] Nouri-Shirazi M, Thomson AW. Dendritic cells as promoters of transplant tolerance. Expert Opin Biol Ther, 2006, 6(4): [4] Hikawa H, Lotze MT, Rosenblum WD. Induction of peripheral tolerance by local delivery of dendritic cell progenitors to cardiac allografts in a murine heterotopic heart transplantation model. Gen Thorac Cardiovasc Surg, 2007, 55(8): [5] 李春蕊, 刘文励, 周剑锋, 等. 丁酸钠和曲古抑菌素 A 促进 K562 细胞分化机制的研究及其对比. 中国药理学通报, 2004, 24(1): [6] Cayo MA, Cayo AK, Jarjour SM, et al. Sodium butyrate activates Notch1 signaling, reduces tumor markers, and induces cell cycle arrest and apoptosis in pheochromocytoma. Am J Transl Res, 2009, 1(2): [7] 刘璐, 闵军, 王捷. 丁酸钠诱导未成熟树突状细胞及其免疫学功能研究. 中国病理生理杂志, 2007, 23(6): [8] Gagliardi MC, Teloni R, Giannoni F, et al. Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin infects DC-SIGNdendritic cell and causes the inhibition of IL-12 and the enhancement of IL-10 production. J Leukoc Biol, 2005, 78(1): [9] KhanTA, Peh KK. A preliminary investigation of chitosan film as dressing for punch biopsy wounds in rats. J Pharm Sci, 2003, 6(1): [10] Delemarre FG, Hoogeveen PG, De Haan - Meulman M, et al. Homotypic cluster formation of dendritic cells, a close correlate of their stage of maturation. J Leukoc Biol, 2001, 69 (3): [11] Saemann MD, Parolini O, Bohmig GA, et al. Bacterial metabolite interference with maturation of human monocyte-derived dendritic cells. J Leukoc Biol, 2002, 71(2): [12] Nencioni A, Beck J, Werth D, et al. Histone deacetylase inhibitors affect dendritic cell differentiation and immunogenicity. Clin Cancer Res, 2007, 13(13): [13] Millard AL, Mertes PM, Ittelet D, et al. Butyrate affects differentiation, maturation and function of human monocyte-derived dendritic cells and macrophages. Clin Exp Immunol, 2002, 130(2): [14] Diakos C, Prieschl EE, Saemann M, et al. Novel mode of interference with nuclear factor of activated T-cells regulation in T-cells by the bacterial metabolite n-butyrate. J Biol Chem, 2002, 277(27):

< F63756D656E D2D796E2DB9A4D7F72D31C6DABFAF2D31D6D0D2BDD2A9CFD6B4FABBAF2D C4EA2DB5DA35C6DA2D30352D30322DBAFEC4CFBBF9B5D82DB8CEB2A12E6D6469>

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