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1 2011;31(7) 1159 基础研究 同种异体脂肪源干细胞移植对耐力训练大鼠血清生化指标及运 动能力的影响 杨会营 陶 晖 余美春 杨 春 曲戎梅 曾文钦 段富华 余 磊 戴景兴 原 林 南方医科大学人体解剖教研室暨广东省组织构建与检测重点实验室 广东 广州 摘要 目的 从筋膜学角度观察同种异体移植脂肪源干细胞 DSCs 对耐力训练大鼠体内某些血清生化指标活性及运动 能力的影响 方法 40 只 Wistar 雄性大鼠随机分成安静对照组 空白对照组 游泳训练照组 模型组 安静移植细胞组 实验对照组 和游泳移植细胞组 实验组 模型组和实验组进行力竭游泳训练 力竭游泳训练 1 周后 实验组与实验对 照组经尾静脉输入 DSCs 游泳训练结束后 记录各组大鼠游泳力竭的时间以及检测血清尿素(BUN) 乳酸脱氢酶 (LDH) 血乳酸(BLa) 和血红蛋白( Hb) 含量 结果 模型组与空白对照组比较 Hb 水平显著降低 血清 BLa 水 平均显著升高(P<0.01) 力竭时间显著延长(P<0.01) 与模型组比较 实验组Hb显著提高(P<0.01) 而 BLa水平 均明显降低(P<0.01) 力竭时间有较大提高(P<0.01) 结论 移植 DSCs 可有效延缓了大鼠运动性疲劳的产生 提高了大 鼠的运动能力 关键词 脂肪源干细胞 同种异体移植 力竭游泳 筋膜学 运动能力 中图分类号 R289.5 文献标志码 文章编号 Effect of allogenic adipose-derived stem cell grafting on serum biochemical indicators and sporting ability of endurance trained rats YNG Hui-ying, TO Hui, YU Mei-chun, YNG Chun, QU Rong-mei, ZENG Wen-qin, DUN Fu-hua, YU Lei, DI Jing-xing, YUN Lin School of Basic Medical Sciences, Southern Medical University, Guangzhou , China bstract: Objective To observe the effect of transplantation of allogeneic adipose-derived stem cells (DSCs) on serum biochemical indicators and sporting ability in highly endurance-trained rats from a fasciological perspective. Methods The DSCs were cultured in vitro. Forty male Wistar rats were randomized into 4 equal groups, namely the blank control group, overtraining (model) group, transplantation without training group and overtraining plus transplantation group. The rats in the two overtraining groups were subjected to exhaustive swimming for 1 week, and in the two transplantation groups, cultured allogeneic DSCs (2 106/ml) were injected via the tail vein. The exhaustion time in swimming and the serum levels of BUN, LDH, BLa, and Hb of the rats were recorded after the treatments. Results The rats in the model group showed significantly increased serum BUN, LDH and BLa levels and decreased Hb level with a extended exhaustion time as compared with those in the blank control group (P<0.01). The BUN, LDH and BLa was significantly lower, Hb level higher and the exhaustion time significantly longer in the overtraining plus transplantation group than those in the model group (P<0.01). Conclusions DSCs can effectively prolong the exhaustion time of rats during exhaustive swimming and enhance their sporting ability. Key words: adipose-derived stem cells; transplantation; exhaustive swimming training; fasciaology; sporting ability 运动性疲劳是指机体生理过程不能维持其机能在 赛之后出现机体疲劳 无法达到原有的竞技水平 如何 一特定水平上和/或不能维持预定的运动强度 主要表 延缓运动性疲劳的产生和加速其消除是运动医学领域 现为运动员经过一段时间的大强度训练或激烈的比 研究的热点 现在大多数是研究药物对机体的影响 以 1 传统中药 2-3 和中药复方 4 为多 也有一些合成药物 5-6 收稿日期 研究表明 这些药物均对机体运动疲劳的延缓或消 基金项目 国家重点基础研究计划(973 计划)项目(2007CB512705)和 除 有 一 定 影 响 但 效 果 不 持 久 脂 肪 源 干 细 胞 国家自然科学基金青年面上项目( ) Supported by National 973 Program (2007CB512705) and National Natural Science Foundation of China ( ). adipose-derived stem cells, DSCs 是筋膜结缔组织 中的一种主要干细胞储备 可作为干细胞资源通过分化 作者简介 杨会营 硕士研究生 transend0000@163.com 对功能细胞进行补充 也可刺激机体分泌各种因子 促 通讯作者 戴景兴 副教授 daijingxing@yahoo.com.cn 进机体的损伤修复

2 1160 本实验通过观察一些与运动疲劳相关的血液生化 第 31 卷 泳训练7 d后 实验组与实验对照经尾静脉输入DSCs 指标的变化 探讨DSCs对这些指标的影响 并观察移 2 106个/只 模型组注射生理盐水1 ml 植DSCs后 大鼠运动疲劳的有无延缓 进而为筋膜学 取材处理 4组大鼠均于第25 天开始进行力竭游 说提供实验佐证 泳 记录力竭时间 然后水合氯醛麻醉大鼠 心脏取血 部分备用检测 Hb 其余室温下放置 8 h 后 3000 r/min 1 材料和方法 离心15 min制备血清 检测 BLa LDH 1.1 材料 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件处理 实验 动物与分组 选用 3 月龄 Wistar 雄性大鼠(SPF 级) 数据用均数±标准差表示 多样本均数比较采用单因素 40 只 体质量 280~300 g 由广东省南方医科大学实验 方差分析 P<0.05为有统计学差异 动物中心提供 合格证号SCXK(粤) 试 剂 与 仪 器 DMEM/High Glucose 购 于 Hy- 2 结果 Clone Hanks 液 D-Hanks 液 胰蛋白酶 胶原酶和胎牛 2.1 大鼠脂肪源干细胞的鉴定 血清均购于 Gibco 血清尿素(BUN) 乳酸脱氢酶 光学显微镜下观察 原代DSCs培养24 h后 细胞 (LDH) 血乳酸(BLa) 血红蛋白(Hb)试剂盒均购于南京 呈圆形 多边形或者梭形 细胞长势良好 7 d后可按1 建成生物制品研究所 Sigma 2k15 低温高速离心机 美 3传代 之后每3 d可传代1次 经换液传代至第5代 可 国 Metertech nm 酶标仪 美国 GRNT 见细胞形态均一 呈多角形或者长梭形 图1 SUB14恒温水浴箱(英国Grant) Heraeus HER-150二 氧化碳培养箱 Olympus 光学显微镜 1.2 方法 DSCs的分离与培养 7 选取2月龄雄性Wistar大 鼠 用 10%水合氯醛 3 ml/kg 腹腔注射全身麻醉 无菌 手术切取腹股沟皮下脂肪垫 清除肉眼可见的小血管 PBS 液冲洗 3 次以去除红细胞 剪碎 加入 2 倍体积的 0.1%的Ⅰ型胶原酶 37 下搅拌消化 40 min 200 目筛 网过滤 用等量的含 10%新生牛血清的 DMEM 完全培 养液中和胶原酶 800 r/min 离心 6 min 沉淀用完全培 养液重悬细胞 以1 104个/cm2的密度接种于25 ml培养 瓶 放置于37 5%CO2的培养箱中培养 每3 d换一次 液,至长满 80%瓶底时传代 传至第 5 代的细胞即为本 实验移植所用细胞 图1 移植入体内前第5代DSCs Fig.1 DSCs of the fifth passage maintaining an undifferentiated state in routine culture condition(original magnification: 100) DSCs 的鉴定 光镜下细胞形态观察 利用流式 细胞仪对培养细胞进行免疫表型测定 用成骨 成脂肪 表型鉴定 5 代 DSCs 流式细胞仪表面抗原检测 诱导培养基诱导细胞后 茜素红染色检测钙化基质沉 结果显示 CD29-PC 呈强阳性 阳性率达到 99%以 淀 油红O染色检测脂肪滴 以分化后 染色前为阴性对 上 CD90-FITC 也 呈 阳 性 阳 性 率 可 达 到 95% 而 照 CD11b/c-PC CD45-PE CD106-PE CD49d-FITC 呈 力竭游泳训练模型制备 将动物适应性喂养 7 d 阴性 阴性率均达到90%以上 图2 成骨诱导 加入诱导培养基后 细胞形态开始发生 后 参照相关文献复制模型 实验水深为大鼠总长(身 长+尾长)的 1.5 倍 水温 32~34 模型组和实验组在 变化 随着时间的推移 细胞由梭形逐渐转化为方形 正式实验前2 d开始适应性游泳 每天20 min 然后5% 鳞片形 三角形或多角形等 细胞外基质分泌增加 胞浆 负重游泳至接近力竭 力竭标准 游泳动作明显失调 中及胞质外可见较多细小黑色颗粒 细胞呈现铺路石 不能再坚持或沉入水底超过 3 s 不能回水面 翻正反射 样 大量细胞围绕集落中央呈岛状分布 分泌大量细胞 阴性 若大鼠未游到 30 min 而出现上述情况 及时捞 基质 形成大小不一的颗粒状结节 茜素红染色表现为 起 休息5 min继续游泳 以保证每天30 min运动 每周 红色的致密结节 图3 8 6 d 于第25天开始观察大鼠力竭游泳时间 空白对照 成脂诱导 诱导后的细胞逐渐变为圆形 椭圆形 组不加任何干预 光镜下可见胞浆内零星出现黄色的折光性强的圆形的 DSCs 体内移植 收集传至 5 代的 DSCs 游 小脂滴 逐渐增多融合成大脂肪滴 细胞核被脂滴挤于

3 第7期 杨会营,等.同种异体脂肪源干细胞移植对耐力训练大鼠血清生化指标及运动能力的影响 1161 图2 流式细胞仪表型鉴定结果: CD29-PC和CD90-FITC阳性, CD11b/c-PC CD45-PE CD106-PE和CD49d-FITC阴性 Fig.2 Surface antigens of DSCs detected by flow cytometry. B C 图3 DSCs成骨诱导的茜素红染色 : 空白对照; B: 阴性对照 成骨诱导2周; C: 钙结节茜素红染色 Fig.3 ZR staining of the DSCs following osteogenic induction (Original magnification: 200). 一侧 有少部分大脂滴会破裂 油红O染色显示特异性 支持与储备系统和功能系统 生物通过支持储备系统 的红色脂滴 图4 维持较长的生命周期和维持机体稳定的内环境 筋膜 2.2 移植 DSCs 对大鼠血清 Hb BLa LDH 水平 组织中的未分化干细胞是支持储备系统的细胞基础 功 的影响 能器官损伤或是代谢过度时皆可以通过趋化动员筋膜 模型组与空白对照组比较 Hb水平显著降低 血清 中储备的干细胞增殖 分化而补充修复 BLa水平均显著升高(P<0.01) 与模型组比 Zuk等 10 首次提取DSCs 研究证明其具有跨胚层 较 实验组 Hb 可显著升高 而 BLa 水平均 的多向分化潜能 有关 DSCs 移植治疗运动相关 明显降低(P<0.01) 实验对照组与空白对照组比较 Hb 的报道很多 杨春等 14 研究 移植DSCs可以引起受体 BLa水平变化无统计学差异 P>0.05 实验 血液中生化指标的改变 Lazerges等 15 将DSCs 植入 组与实验对照组比较 BLa水平均明显降低 经腓总神经切断缝合的胫骨前肌 胫骨前肌有明显的形 (P<0.01) 而Hb无统计学意义 表1 态和功能上的改变 肌湿重和肌力与未移植对照组相比 2.3 移植DSCs对大鼠力竭游泳时间影响 有显著增加 Vieira等 16 研究 尾静脉移植人源DSCs 模型组 4501±639 s 与空白对照组 2926±326 s 治疗肌营养不良模型大鼠 在受体体内有肌细胞的分 比较 力竭时间有明显延长(P<0.01) 与模型组比较 实 化 经过治疗后 肌营养不良大鼠的悬吊实验及吊尾实 验组 5658±819 s 力竭时间显著升高(P<0.01) 实验对 验阳性 四肢力量增加 运动能力得到提高 照组 3145±249 s与空白对照组比较 力竭时间变化无 3.1 移植DSCs引起血清学指标的变化 统计学差异 P>0.05 模型组与空白对照组比较 Hb水平显著降低 血清 BLa水平均显著升高(P<0.01) 提示大鼠长 3 讨论 期力竭游泳后 血液代谢下降 而 BLa水平 原林教授提出的筋膜学认为 整个有机体可分为 9 均明显降低(P<0.01) 说明移植 DSCs 对运动疲劳的

4 1162 第 31 卷 C B 图4 大鼠DSCs成脂诱导油红O染色 : 空白对照组; B: 阴性对照 成脂诱导2周; C: 脂肪滴油红O染色 Fig.4 Oil Red-O staining of DSCs following adipogenic induction (Original magnification: 200). 表1 移植DSCs对运动疲劳大鼠血清Hb, BUN, LDH, BLa含量的影响 Tab.1 Effect of DSC grafting on serum levels of Hb, BUN, LDH and BLa in rats with Exercise-induced fatigue (Mean±SD, n=10) 分组 Hb (g/l) BUN (mmol/l) 空白对照组 ± ± ± ± ± ± ± ±1.20 实验对照组 ± ± ± ±0.33 实验组 ± ± ± ±0.82 模型组 LDH (μ/l) BLa (mmol/l) 与空白对照组相比 P<0.01 与空白对照组相比 P>0.05 与实验对照组相比, P<0.01. 减缓或恢复有作用 实验对照组与空白对照组比较 大小呈正相关 是评定运动员机能状态的一个重要指 Hb BLa水平变化无统计学差异 P>0.05 标 本实验结果显示 力竭后各组大鼠 BUN 含量明显 说明细胞移植对无运动疲劳大鼠影响不明显 实验组与 上升 实验组较模型组大鼠 BUN 水平低 且有显著性 实验对照组比较 BLa 水平均明显降低(P< 差异(P<0.01) 提示 DSCs 移植有减少蛋白质氧化供 0.01) 而 Hb 无统计学意义 说明一次力竭对 能的作用 BLa 影响较大 Hb 的降低是一个逐渐消耗的过 血清LDH活性的变化 血清LDH 的酶活性变化 程 移植 DSCs 可以提高机体的清除能力 可以促进 是一种运动应激 能表明身体能量供应方式和结构的比 Hb 的合成 接近机体的正常状态 故两组比较含量接 例变化 过度训练时细胞大量逸出 表明机体乳 近 酸代谢受阻 肾脏 骨骼肌 肝脏及心肌等的无氧代谢能 大鼠Hb含量的变化 Hb含量与运动量大小密切 力下降 供能障碍 活动能力下降 本实验结果显示 训 相关 运动训练量适宜有助于Hb含量的升高 提高运动 练组和训练细胞移植组大鼠血清LDH活性均较安静组 员有氧代谢能力 而过度训练可引起Hb显著降低 从而 均明显升高 实验结果还显示 实验组大鼠血清 LDH 运动能力下降 因此 Hb 可作为反映运动量大小的敏感 活性显著低于模型组 其原因可能移植 DSCs 能够增 指标 Hb 也可以作为评定耐力项目运动员身体机能状 强机体清除超氧阴离子 羟自由基 脂质过氧化自由基 态的重要指标 本实验结果显示 模型组大鼠较空白对 的能力 减少了自由基对细胞膜的损伤 从而防止了细 照组大鼠Hb含量明显下降(P<0.01) 这与文献报道是 胞的LDH外漏 相符合的 与模型组比较 实验组 Hb 可显著升高说明 BLa 含量的变化 BLa 是运动强度的重要指标 移植DSCs可以促进Hb升高 运动时乳酸浓度的变化由运动的强度和持续时间所决 BUN 含量的变化 BUN 是评价运动时机体蛋白 定 并受运动方式 年龄 肌糖原贮备等因素的影响 结 质分解代谢的常用检测指标 BUN在正常生理状态下 果显示模型组和实验组大鼠 Bla 含量较安静组均有上 的生成和排泄处于动态平衡状态 BUN 会在蛋白质代 升 且模型组较空白对照组差异显著(P<0.01) 大强度 谢异常时出现变化 BUN与机体疲劳程度以及负荷量 运动时骨骼肌产生的乳酸增多 细胞内乳酸浓度升高

5 第 7 期 杨 会 营, 等. 同 种 异 体 脂 肪 源 干 细 胞 移 植 对 耐 力 训 练 大 鼠 血 清 生 化 指 标 及 运 动 能 力 的 影 响 1163 剧 烈 运 动 时 肌 细 胞 膜 通 透 性 增 加, 肌 细 胞 中 更 多 的 乳 酸 进 入 到 血 液 中,Bla 释 放 入 血 超 过 其 清 除,Bla 浓 度 升 高 实 验 组 大 鼠 Bla 浓 度 较 模 型 组 显 著 降 低 (P<0.01), 提 示 DSCs 有 助 于 减 少 运 动 大 鼠 体 内 Bla 的 堆 积, 对 延 缓 运 动 性 疲 劳 的 发 生 有 积 极 作 用 3.2 移 植 DSCs 引 起 力 竭 时 间 的 改 变 实 验 研 究 结 果 表 明 : 模 型 组 与 空 白 对 照 组 比 较, 力 竭 时 间 有 明 显 延 长 (P<0.01), 说 明 大 鼠 在 游 泳 训 练 过 程 中 有 学 习 能 力, 游 泳 时 间 增 加 ; 实 验 对 照 组 与 空 白 对 照 组 比 较, 力 竭 时 间 变 化 无 统 计 学 差 异 (P>0.05), 说 明 细 胞 移 植 对 无 运 动 疲 劳 大 鼠 影 响 不 明 显 ; 与 模 型 组 比 较, 实 验 组 力 竭 时 间 显 著 升 高 (P<0.01), 说 明 移 植 DSCs 提 高 了 机 体 的 运 动 能 力, 对 机 体 运 动 疲 劳 的 减 缓 或 恢 复 有 作 用 移 植 DSCs 有 效 抑 制 红 细 胞 和 血 红 蛋 白 的 损 伤, 提 高 了 乳 酸 清 除 的 能 力, 延 缓 了 运 动 性 疲 劳 的 产 生 但 具 体 机 制 尚 需 进 一 步 的 研 究 探 讨 参 考 文 献 : [1] 曲 绵 域, 高 云 秋, 浦 均 宗, 等. 实 用 运 动 医 学 [M]. 北 京 : 北 京 科 学 技 术 出 版 社, 1996: 52. [2] 潘 新 宇, 牛 岭. 巴 戟 天 对 运 动 训 练 大 鼠 骨 骼 肌 自 由 基 代 谢 及 运 动 能 力 的 影 响 [J]. 中 国 临 床 康 复, 2005, 9(48): [3] 熊 正 英, 张 琳, 武 胜 奇. 白 藜 芦 醇 对 大 强 度 耐 力 训 练 大 鼠 部 分 生 化 指 标 的 影 响 [J]. 武 汉 体 育 学 院 学 报, 2008, 42(8): [4] 郑 兵, 苏 全 生, 熊 若 虹, 等. 复 力 康 合 剂 影 响 成 年 雄 性 大 鼠 的 运 动 能 力 [J]. 中 国 临 床 康 复, 2005, 9(20): [5] 岳 冠 华, 闫 健, 李 承 道. 补 充 NO 前 体 左 旋 精 氨 酸 对 一 次 性 力 竭 运 动 大 鼠 心 肌 的 影 响 [J]. 西 安 体 育 学 院 学 报, 2008, 25(1): [6] 郭 宇, 宫 德 正, 吕 国 枫, 等. 丙 酮 酸 钙 对 小 鼠 力 竭 运 动 能 力 的 研 究 [J]. 大 连 医 科 大 学 学 报, 2009, 31(2): [7] 李 东 飞, 杨 春, 李 桢, 等. 大 鼠 大 网 膜 和 皮 下 脂 肪 间 充 质 干 细 胞 免 疫 表 型 的 比 较 [J]. 南 方 医 科 大 学 学 报, 2010, 30(10): [8] 朱 全, 浦 钧 宗. 大 鼠 游 泳 训 练 在 运 动 实 验 中 的 应 用 方 法 [J]. 中 国 运 动 医 学 杂 志, 1996, 15(2): [9] BaiY, Yuan L, Soh K, et al. Possible pplications for fascial anatomy and fasciaology in traditional Chinese medicine[j]. J cupunct Meridian Stud, 2010, 3(2): [10]Zuk P, Zhu M, Mizuno H, et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies[j]. Tissue Eng, 2001, 7(2): [11]Yang LY, Liu XM, Sun B, et al. dipose tissue-derived stromal cells express neuronal phenotypes[j]. Chin Med J (Engl) 2004, 117 (3): [12]Ning H, Lin G, Lue TF, et al. Neuron-like differentiation of adipose tissue-derived stromal cells and vascular smooth muscle cells[j]. Differentiation, 2006; 74(9-10): [13]Rodriquez M, Elabd C, mri EZ, et al. The human adipose tissue is a source of multipotent stem cells[j]. Biochimie, 2005, 87(1): [14] 杨 春, 李 东 飞, 戴 景 兴, 等. 移 植 脂 肪 源 干 细 胞 抗 衰 老 的 实 验 研 究 [J]. 解 剖 学 报, 2010, 41(1): [15]Lazerges C, Daussin P,Coulet B, et al. Transplantation of primary satellite cells improves properties of reinnervated skeletal muscles [J]. Muscle Nerve, 2004, 29(2): [16]Vieira NM, Bueno CR Jr, Brandalise V, et al. SJL dystrophic mice express a significant amount of human muscle proteins following systemic delivery of human adipose-derived stromal cells without immunosuppression[j]. Stem Cells, 2008, 26(9): ( 编 辑 : 吴 锦 雅 )

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