应用文档 TSQ Quantis 三重四极杆质谱仪性能大提升完美应对食品安全领域目标定量新挑战 作者 Katerina Bousova,1 Michal Godula, 1 Claudia Martins,2 Charles Yang, 2 Ed George,2 Neloni Wije

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1 应用文档 三重四极杆质谱仪性能大提升完美应对食品安全领域目标定量新挑战 作者 Katerina Bousova,1 Michal Godula, 1 Claudia Martins,2 Charles Yang, 2 Ed George,2 Neloni Wijeratne 2 1Thermo Fisher Scientific, 欧洲特殊解决方案中心, 德赖艾希, 德国 2Thermo Fisher Scientific, 圣何塞, 加利福尼亚 目的 为快速耐用地定量 250 余种低于最大残留限 (MRL) 的农药开发一种全面的 LC-MS/MS 分析方法, 且该方法的灵敏度 准确度和精密度均符合欧盟指南的严格要求 前言 农药为农作物上使用的化学品, 用于保护农作物免受害虫的破坏 由于农药应用不当可导致严重的健康问题, 因此, 检测食品和粮食制品中的农药残留成为常规食品控制中的重要组成部分 欧盟 (EU) 法规 ( 欧洲法规 396/2005 和委员会指令 2006/125/EC) 是现行最严格的法规, 其规定了植物源和动物源的多种产品中农药的最大残留限 由于一些食品基质要求的定量限 (LOQ) 较低, 因此, 这些法规给分析带来了巨大的挑战 关键词 Pesticide Explorer Collection, 欧洲法规 396/2005, 委员会指令 2006/125/ EC, 欧洲委员会 2002/657/EC,SANCO/12571/2013, 欧洲委员会 788/2012/ EC, 农药, 食品,QuEChERS, Vanquish Flex, MS, TraceFinder 软件

2 本应用文档介绍了综合应用液相色谱仪和三重四极杆质谱仪 (LC-MS/MS) 解决方案以及 Thermo Scientific Pesticide Explorer Collection Standard Quantitation 解决方案开发的多残留分析方法, 以快速耐用地定量 250 余种低于最大残留限的农药 该解决方案包括 Thermo Scientific QuEChERS 样品制备试剂盒 Thermo Scientific Vanquish Flex UHPLC 二元系统 Thermo Scientific 三重四极杆质谱仪 Thermo Scientific TraceFinder 软件 Thermo Scientific Accucore aq C18 极性封端 LC 色谱柱以及方法参数, 为农药分析提供从始至终的工作流程 该分析方法的结果符合最严格的欧盟指南有关灵敏度 准确度和精密度的要求 使用基质匹配校正进行定量 根据相关欧盟指南建立所有方法的性能标准 3 7 分析方法表 1A 1D 列出了所使用的试剂 设备 耗材和玻璃容器以及离子源, 适当情况下还包括 Thermo Fisher Scientific 部件号 除纯化水外, 试剂 设备 仪器 耗材和玻璃容器均来自 Thermo Fisher Scientific 农药标准品购于 ULTRA Scientific ( 美国 ) 实验 概述 LC-MS/MS 分析期间, 样品制备的流程概述见图 1 进样至 LC-MS/MS 系统之前, 根据欧洲 EN QuEChERS 方案对样品进行匀浆和萃取 1,2 即用型 QuEChERS 样品制备试剂盒含萃取管和用于样品制备的相关方案 通过特征离子对的选择反应监测 (SRM), 基于保留时间和至少两个子离子以及离子比率确认识别农药残留物 试剂 部件号 水 UHPLC-MS 级 Fisher Chemical Optima W8-1 甲醇 UHPLC-MS 级 Fisher Chemical Optima A458-1 甲酸铵 >99% A 乙腈 UHPLC-MS 级 A956-1 甲酸 >99% 称取 10 g 样品, 置于 50 ml 萃取管中 2 加入 10 ml 乙腈 (20 ml 水 + 10 ml 乙腈进行润湿 ) 3 振摇 10 min, 并在 5000 rpm 下离心 5 min 4 将上清液转移至 LC 样品瓶中, 并将其置于自动进样器中 匀浆称取样品萃取 (QuEChERS) LC-MS/MS 分析 表 1B. 设备 / 仪器 设备 / 仪器 Fisher 精密天平 Sartorius 分析天平 Barnstead EASYpure II 超纯水机 ULTRA-TURRAX S 25 N - 25 G 分散工具 Thermo Fisher Scientific 部件号或来源 ULTRA-TURRAX T 25 数显型分散机 涡旋振荡器 涡旋通用盖 Accu-Jet 移液器 卧式振动筛 卧式振动筛筛板 图 1. 工作流程概述 离心机,Thermo Scientific TM Heraeus TM Multifuge TM X3 三重四极杆质谱仪 TSQ Vanquish Flex UHPLC 二元系统

3 表 1C. 耗材 耗材 Thermo Fisher Scientific 部件号或来源 LC 样品瓶 LC 样品盖 移液器,Thermo Scientific Finnpipette µl 移液器,Finnpipette µl 移液器,Finnpipette µl 移液器,Finnpipette µl 移液器,Finnpipette ,000 µl 移液器支架 移液器吸头 µl, 500/ 盒 移液器吸头 1-5 ml, 75/ 盒 移液器吸头 µl, 200/ 盒 移液器吸头 20,000-10,000 µl, 40/ 盒 移液器, 巴斯德钠钙玻璃,150 mm FB50251 移液器抽吸装置 刮刀,18/10 钢 刮刀, 尼龙 样品架 (2 ml) 离心管架 QuEChERS 萃取管,50 ml, 250 包 Accucore aq 色谱柱 mm, 2.6 µm 表 1D. 玻璃器皿 玻璃器皿 Thermo Fisher Scientific 部件号或来源 容量瓶,10 ml FB50143 容量瓶,25 ml FB ml 螺旋盖样品瓶 ml 螺旋盖样品瓶盖 ml 瓶 ml 瓶 烧杯,100 ml FB 烧杯,200 ml FB 样品的制备 验证实验使用的空白基质样品 ( 韭菜 (LK)) 购自本地零售商店, 采用 ULTRA-TURRAX 均质器进行匀化, 并在制备强化样品之前进行萃取 将基质萃取物用作基质空白样品并用于制备基质匹配校正标准 用于样品制备的即用型 QuEChERS 萃取试剂盒含 4 g MgSO4 1 g NaCl 1 g 二水柠檬酸三钠和 0.5 g 柠檬酸钠, 用于缓冲萃取目标化合物 未使用任意净化步骤 采用以下步骤进行基质均质化 : 1 将相对大量的韭菜基质 (~500 g) 置于大小适合的烧杯中并标记 2 将 25 G 分散工具附于 ULTRA-TURRAX 均质器上 ( 注 : 对于一些不稳定的化合物, 为了得到更好的回收率, 建议进行低温均质化 8) 3 以中等转速 ( 转速为 2-3 级 ) 进行均质化以得到平滑的匀浆 采用以下步骤进行样品萃取 : 1 称取 10 g 样品并置于 50 ml QuEChERS 萃取管中 2 将 10 ml 乙腈加入至 LK 样品中 3 将样品置于水平振荡器上振摇 10 min, 并以 5000 rpm 的转速离心 5 min 4 收集上清液并将 1 ml 上清液转移至 LC 样品瓶中进行仪器分析 LC-MS/MS 分析 采用 Vanquish Flex 二元系统偶联 三重四极杆质谱仪进行 LC-MS/MS 分析 使用 TraceFinder 软件进行仪器控制 分析 数据查看和报告 LC 条件和梯度见表 2 和 3 优化 LC 梯度, 将分析时间缩短至 15, 同时维持较好的色谱分离 表 2.LC 条件 进样量 1 µl 柱温 25 流速 300 µl/min 分析柱 Accucore aq 色谱柱 mm, 2.6 µm 运行时间 15 托盘温度 5 喷针清洁溶剂 10% 甲醇水溶液 样品定量环 25 µl A:98% 的水含 2% 的甲醇 5 mm 甲酸铵和 0.1% 流动相 甲酸 B:98% 的甲醇含 2% 的水 5 mm 甲酸铵和 0.1% 甲酸 表 3.LC 梯度 时间 (min) 流速 (ml/min) %A %B

4 对强度 三重四极杆质谱仪以定时 -SRM 模式运行 采用 Tune3.0 软件中的新化合物优化工具自动优化 SRM 条件 质谱仪设置见表 4 表 4. 已优化的离子源和 MS 设置 电离模式 扫描类型 极性 加热电喷雾电离 (HESI) timed-srm 正 / 负离子切换 正离子模式下的喷雾电压 3700 V 负离子模式下的喷雾电压 2500 V 鞘气压力 30 任意单位 (Arb) 辅助气压力 6 Arb 吹扫气压力 1 Arb 离子传输管温度 325 С 雾化器温度 350 С 碰撞诱导解离气体压力 2 mtorr 循环时间 0.5 s Q1 分辨率 (FWHM) 0.7 结果与讨论 图 2 显示了含 250 余种农药的 100 µg/kg 基质加标样品的 LC- MS/MS 色谱图 ( 进样量为 1 µl ) 采用定时 -SRM 模式进行分析时, 除色谱运行时间短 (15 ) 外, 还可对农药化合物进行良好分离和检测 在定时 -SRM 模式下, 在已知化合物保留时间周围较窄的保留时间窗口中, 对特定目标化合物进行数据采集 定时 -SRM 显著降低了在一定保留时间窗口中平行监测到的 SRM 离子对数量 为了获得可重现且精密的预期定量限, 必须在较短驻留时间内具有良好的仪器性能 图 3 突出显示了在短驻留时间内分析低浓度水平的韭菜时 质谱仪的仪器性能 Q3 分辨率 (FWHM) 0.7 相图 μg/kg 韭菜萃取物中 250 余种农药的 LC-MS/MS 色谱图

5 相对丰度子对的数量离对丰度B A 每个循环离子对的数量 离子对 嘧菌酯,1 ppb 韭菜萃取物, 进样编号 10, 2.5 ms 驻留时间相时间 C 嘧菌酯,1 ppb 韭菜萃取物, 进样编号 410, 2.5 ms 驻留时间 时间 图 3. 速度和重现性示例 图 A 显示了单位时间内的离子对数 嘧菌酯在 8.69 min 处洗脱, 并与其他 130 个离子对同时采集 图 B 和 C 显示了嘧菌酯的重现性, 对比第 10 次进样和第 410 次进样 即使在低驻留时间 (2.5 ms) 时, 峰面积也保持一致 图 C 还证实了色谱图复杂区域的峰上含有足够数量的数据点 5 LC-MS/MS 工作流程 : 卓越的重现性, 优异的耐用性 不管样品多么复杂, 均希望该分析方法灵敏 可重现且准确 研究表明, 采用 MS 定量分析韭菜中农药的灵敏度优于前面一代三重四极杆质谱仪

6 图 4 总结了 MS 和 MS 分析五种农药的对比结果, 涉及电离模式和一个较宽的质量数范围 A)MCPA 峰面积 :79079 峰高 :18896 B) 乙肟威 峰面积 : 峰高 : ~ 10 ~ 3 峰面积 :8196 峰高 :1809 峰面积 : 峰高 : C)2,4-D 峰面积 :61239 峰高 : D) 氯化矮壮素 峰面积 : 峰高 : ~ 7 ~ 10 峰面积 :5805 峰高 : E) 阿巴美丁 峰面积 : 峰高 : 峰面积 :51090 峰高 :11570 ~ 4x 峰面积 :10818 峰高 : 图 4. 采用 MS( 蓝色线条 ) 和 MS( 红色线条 ) 监测五种农药的典型色谱图对比 仪器性能的差异以峰面积和峰高的形式呈现 A)MCPA 负离子电离模式 ( , )B) 乙肟威 正离子电离模式 (163 88, )C)2,4 D 负离子电离模式 ( , ) D) 氯化矮壮素 正离子电离模式 (122 63, )E) 阿巴美丁 正离子电离模式 ( , , )

7 监测韭菜中的莠去津七天,, 未进行仪器维护 (QC (QC 为 10 为 µg/kg) 10 µg/kg) 峰面积计数 % SD 4.5% R -20% 基质进样的次数 图 5. 韭菜中的莠去津 QC 监测, 进样次数超过 400 次,RSD 为 4.5% 红线表示 10 μg/kg 浓度下莠去津的响应值 ±20% 黄线显示将系统置于待机模式下 12 h 的精确时刻 ( 未进行仪器维护 ) 图 5 显示了 400 余次基质空白进样和 10 ppb QC 韭菜样品进样时莠去津的总体响应 将系统置于待机模式下 24 h(2 12h), 以证实仪器在待机模式下启动时性能可靠 数据表明, 至少进样 400 次时, 响应值在预期值 ±20% 范围内 每次进样之间未进行仪器维护 结论 欧盟法规规定了食品中农药的最大残留限, 但由于必须达到复杂基质中低定量限的要求, 因此, 该法规给分析带来了挑战 本应用文档介绍了一种多残留 LC-MS/MS 分析方法, 该方法采用基于 三重四极杆质谱仪的 Pesticide Explorer Collection Standard Quantitation 解决方案, 在小于等于最大残留限水平上快速耐用地定量韭菜中的 250 余种农药 该 LC-MS/MS 系统的选择性和灵敏度可用于分析仅 1 µl 的样品, 而不需要进行分散 SPE 样品净化或样品稀释, 同时增加了耐用性和通量 参考文献 extraction-products-quechers.html Anastassiades etal.fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and dispersive solid-phase extraction for the determination of pesticide residues inproduce. J.Chromatogr.A , Official Journal of the European Communities, COMMISSION DECISION of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/ EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation ofresults.[online] legal-content/ EN/TXT/PDF/?uri=CELEX:32002D0657&from=EN (accessed April 20, 2017). Official Journal of the European Union, COMMISSION DIRECTIVE 2006/125/ EC of 5 December 2006 on processed cereal-based foods and baby foods for infants and youngchildren.[online] PDF/?uri=CELEX:32006L0125&fr om=en (accessed April 20, 2017). European Commission Directorate-General for Health and Food Safety, Safety of the Food Chain, Pesticides and biocides, Guidance document on analytical quality control and method validation procedures for pesticides residues analysis in food andfeed.sanco/11945/2015. [Online] pesticides_mrl_guidelines_wrkdoc_11945.pdf (accessed April 20, 2017). Official Journal of the European Union, COMMISSION IMPLEMENTING REGULATION (EU) No 788/2012 of 31 August 2012 concerning a coordinated multiannual control programme of the Union for 2013, 2014 and 2015 to ensure compliance with maximum residue levels of pesticides and to assess the consumer exposure to pesticide residues in and on food of plant and animalorigin.[online] eu/legal-content/en/txt/pdf/?uri=celex:32012r0788&from=en (accessed April 20, 2017). EuropeanCommission.Plants.EU Pesticidesdatabase.[Online] ec.europa.eu/ food/plant/pesticides/eu-pesticides-database/public/?ev ent=homepage&language=en (accessed April 20, 2017). Fussell etal.food Additives & Contam.2007, 24,

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