LC-MS/MS TuroFlow 方法分析食物中孔雀石绿、隐形孔雀石绿、环丙沙星和四环素的分析检测

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1 Turbo Flow 联 合 LC-MS/MS 方 法 进 行 食 物 样 品 中 孔 雀 石 绿 无 色 孔 雀 石 绿 环 丙 沙 星 和 四 环 素 残 留 的 分 析 检 测 简 介 : 为 了 保 证 食 物 供 应 链 的 安 全 性 和 有 效 管 理 全 球 健 康 风 险, 对 食 品 和 农 产 品 中 化 学 物 质 残 留 水 平 进 行 精 确 的 检 测 是 非 常 必 要 的 而 化 学 物 质 的 残 留 分 析 要 求 检 测 技 术 具 有 足 够 高 的 灵 敏 度, 能 够 在 污 染 物 的 最 大 检 出 限 (MRL) 或 最 大 检 出 限 (MRL) 水 平 以 下 从 给 定 样 品 中 检 出 被 污 染 物 并 对 其 进 行 定 量 另 外, 因 为 食 品 安 全 相 关 规 定 日 益 严 格, 所 要 检 测 的 样 品 数 量 也 在 不 断 增 大, 于 是 对 该 检 测 技 术 提 出 了 另 一 关 键 性 的 要 求 样 品 处 理 的 高 通 量 随 着 水 产 业 持 续 快 速 的 发 展, 人 们 对 水 产 养 殖 过 程 中 未 批 准 药 物 和 不 安 全 化 学 物 质 的 使 用 也 越 来 越 关 注 孔 雀 石 绿 (MG), 是 一 种 三 苯 甲 烷 类 人 工 合 成 有 机 化 合 物, 既 是 染 料, 也 是 高 效 杀 菌 剂, 而 且 价 格 低 廉 因 此 它 在 水 产 养 殖 过 程 中 被 广 泛 使 用, 特 别 是 在 亚 洲 地 区 ( 孔 雀 石 绿 无 色 孔 雀 石 绿 的 化 学 结 构 式 请 见 图 1) 图 1 孔 雀 石 绿 无 色 孔 雀 石 绿 的 化 学 结 构 式 孔 雀 石 绿 (MG) 在 代 谢 过 程 中 降 解 成 无 色 孔 雀 石 绿 (LMG), 研 究 发 现 : 无 色 孔 雀 石 绿 在 含 脂 肪 的 鱼 的 器 官 中 会 发 生 累 积 现 象, 因 为 人 们 在 已 经 检 测 不 到 孔 雀 石 绿 的 样 品 中 仍 然 会 发 现 无 色 孔 雀 石 绿 的 残 留 而 研 究 证 明, 无 论 是 孔 雀 石 绿 还 是 无 色 孔 雀 石 绿, 都 有 致 癌 活 性 因 此, 在 许 多 国 家, 包 括 美 国 加 拿 大 和 欧 盟, 孔 雀 石 绿 已 经 被 禁 止 作 为 兽 用 药 在 水 产 养 殖 业 使 用 因 为 一 些 化 学 物 质 被 禁 止 在 动 物 肉 类 加 工 制 作 的 食 品 中 使 用, 欧 盟 法 规 规 定 了 这 些 物 质 的 最 低 允 许 限 量 (MRPL) 鱼 肉 中 有 关 孔 雀 石 绿 和 无 色 孔 雀 石 绿 的 残 留 总 量 的 最 低 允 许 限 量 为 2μg/kg(ppb) 环 丙 沙 星 是 一 种 广 谱 性 抗 菌 素 ( 化 学 结 构 式 请 见 图 2), 属 于 氟 喹 诺 酮 家 族 的 成 员 之 一 氟 喹 诺 酮 类 是 近 年 来 人 工 合 成 的 一 系 列 新 型 杀 菌 性 抗 菌 药 物, 因 其 抗 菌 谱 广 抗 菌 活 性 强 等 特 点 而 广 泛 应 用 于 畜 禽 饲 养 业 和 水 产 养 殖 业 的 多 种 感 染 性 疾 病 的 防 治 当 中 氟 喹 诺 酮 类 药 物

2 的 残 留 会 诱 导 人 类 致 病 菌 产 生 耐 药 性 因 此, 随 着 氟 喹 诺 酮 类 药 物 在 动 物 源 性 食 品 中 的 广 泛 应 用, 其 残 留 问 题 越 来 越 引 起 社 会 各 界 的 广 泛 关 注 和 有 关 部 门 的 高 度 重 视 FDA 禁 止 动 物 食 品 中 氟 喹 啉 特 别 标 签 的 使 用 欧 盟 法 规 规 定 氟 喹 诺 酮 类 药 物 恩 诺 沙 星 及 其 代 谢 产 物 环 丙 沙 星 的 总 量 在 所 有 生 产 食 品 的 动 物 肌 肉 和 猪 肝 脏 中 的 最 大 残 留 限 (MRLs) 分 别 为 100μg/kg (ppb) 和 200μg/kg(ppb) 图 2 环 丙 沙 星 的 化 学 结 构 式 四 环 素 是 一 种 聚 酮 类 抗 生 素, 它 对 一 些 革 兰 氏 阴 性 菌 和 革 兰 氏 阳 性 菌 具 有 高 效 作 用 ( 化 学 结 构 式 请 见 图 3) 和 其 他 兽 用 抗 生 素 一 样, 四 环 素 用 于 食 用 动 物 后, 在 动 物 体 内 和 畜 禽 产 品 中 会 有 残 留 现 象, 残 留 的 四 环 素 同 样 会 使 得 人 们 对 这 些 药 物 的 耐 药 性 提 高 欧 盟 兽 药 残 留 也 对 此 作 了 相 关 规 定, 四 环 素 在 所 有 生 产 食 品 的 动 物 肌 肉 和 猪 肝 脏 中 最 大 残 留 限 (MRLs) 分 别 为 100μg/kg(ppb) 和 300μg/kg(ppb) 图 3 四 环 素 的 化 学 结 构 式 Thermo Scientific 针 对 以 上 残 留 检 测 需 求 提 出 了 相 应 的 解 决 方 案 --Aria TLX 系 统, 该 系 统 是 将 Turbo Flow 技 术 与 TSQ Quantum Access 质 谱 技 术 进 行 完 美 结 合 它 为 LC-MS/MS 质 谱 配 置 了 在 线 样 品 提 取 功 能, 与 传 统 的 脱 机 提 取 方 法 相 比, 该 方 法 进 行 食 品 中 化 学 物 质 残 留 分 析 更 快 捷, 更 可 靠 Turbo Flow 技 术 通 过 扩 散 溶 解 尺 寸 排 阻 柱 层 析 技 术 将 蛋 白 等

3 一 些 大 分 子 物 质 滤 掉, 将 小 分 子 保 留 工 作 人 员 可 以 直 接 注 射 检 测 样 品 进 入 LC-MS 系 统 进 行 分 析, 大 大 的 简 化 了 样 品 制 备 过 程, 并 提 高 了 检 测 通 量 研 究 目 标 : 为 了 验 证 该 技 术 与 液 液 提 取 或 液 固 提 取 等 传 统 技 术 相 比 具 备 的 以 下 优 势 : 样 品 分 析 所 需 的 总 时 间 减 少 了, 离 子 抑 制 和 复 杂 本 底 的 影 响 也 最 小 化 实 验 条 件 : 1. 样 品 制 备 乙 腈 提 取 法 : 虾 ( 有 头 ) 罗 非 鱼 和 猪 肝 脏 分 别 各 称 取 3~4g, 与 30ml 乙 腈 充 分 混 匀, 室 温 放 置 10min, 上 层 液 体 被 移 入 到 0.22µm 的 微 孔 离 心 管 中,10000rpm 离 心 10min, 转 移 上 清 到 50mL 玻 璃 闪 烁 瓶 中, 即 为 制 备 的 样 品 该 样 品 制 备 过 程 总 共 需 要 25min 标 准 溶 液 配 制 :1mg/L 的 孔 雀 石 绿 无 色 孔 雀 石 绿 环 丙 沙 星 四 环 素 混 合 溶 液 为 储 存 溶 液, 用 甲 醇 将 之 稀 释 到 0.1mg/mL(1000µg/ml) 标 准 溶 液 是 通 过 梯 度 稀 释 的 方 法 将 储 存 溶 液 稀 释 到 合 适 浓 度 并 加 入 到 三 个 已 制 备 样 品 中, 其 浓 度 范 围 为 10μg/kg~5ng/kg 以 上 总 的 样 品 制 备 过 程 大 致 需 要 30-40min 2.Turbo Flow 方 法 Aria TLX-1 系 统 (Thermo Fisher Scientific, Franklin, MA): 一 次 允 许 通 过 6 个 制 备 柱 和 6 个 分 析 柱, 多 个 层 析 柱 的 使 用 使 该 检 测 过 程 更 方 便 更 容 易 由 于 所 有 的 被 分 析 物 都 溶 解 在 一 种 储 存 溶 液 中, 所 选 择 的 制 备 柱 要 求 能 够 使 每 一 种 被 分 析 物 都 达 到 高 的 回 收 率 如 此, 运 行 所 需 时 间 就 被 最 小 化 所 选 择 的 分 析 柱 也 具 有 高 的 分 离 性 能 Turbo Flow 方 法 条 件 如 下 : 制 备 柱 : Turbo Flow XL C18 柱 (Thermo Fisher Scientific, Franklin, MA) 分 析 柱 : 50 3mm,5µm Hypersil GOLD TM 色 谱 柱 (Thermo Fisher Scientific, Bellefonte, PA) 流 动 相 A: 水 ( 含 0.1% 甲 酸 ) 流 动 相 B: 乙 腈 ( 含 0.1% 甲 酸 ) 流 动 相 D: 20% 丙 酮 /40% 甲 醇 /40% 乙 腈 自 动 进 样 器 : 10µL 样 品 提 取 液 : 50:50(A/B)

4 Aria TLX Turbo Flow 方 法 的 具 体 运 行 情 况 见 图 4, 该 分 析 方 法 所 需 的 运 行 时 间 少 于 6min 图 4 Aria TLX Turbo Flow 方 法 3.MS 条 件 : TSQ Quantum Access 三 重 四 极 杆 质 谱 仪 (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA).MS 条 件 如 下 : 离 子 源 极 性 : 扫 射 电 压 : 阳 离 子 模 式 3500V 气 化 温 度 : 472 C 外 壳 气 压 (N2): 辅 助 气 压 (N2): 40 arb 50 arb 离 子 迁 移 电 子 管 温 度 : 270 C 锥 孔 压 力 : 碰 撞 气 体 (Ar): 5V 1.5mTorr Q1/Q3 峰 分 辨 度 : 0.7 u ( 单 位 分 辨 质 量 ) 扫 描 模 式 : 选 择 反 应 监 测

5 图 5 MS 方 法 及 SRM 监 测 到 的 离 子 对 结 果 讨 论 : 随 着 国 际 食 品 贸 易 的 日 益 频 繁, 对 食 物 供 应 过 程 进 行 仔 细 监 测 的 要 求 也 越 来 越 迫 切, 以 确 保 药 物 残 留 水 平 和 其 他 化 学 污 染 物 残 留 水 平 在 相 关 规 定 以 下 在 该 研 究 中, 多 种 食 物 基 质 中 的 环 丙 沙 星 四 环 素 孔 雀 石 绿 无 色 孔 雀 石 绿 都 有 被 检 测 出 来 LC-MS/MS 在 进 行 化 学 物 质 的 残 留 分 析 之 前, 最 为 突 出 的 需 求 就 是 进 行 大 量 样 品 制 备, 而 此 制 备 过 程 是 费 时 费 钱 的 带 有 Turbo Flow 技 术 的 Aria TLX 系 统 可 以 完 全 取 消 此 冗 长 的 样 品 制 备 步 骤 该 研 究 中 每 个 样 品 只 需 要 进 行 一 次 离 心 去 除 其 中 漂 浮 的 颗 粒 即 可 立 即 注 入 层 析 柱, 样 品 制 备 过 程 中 大 多 数 费 时 的 步 骤 都 被 取 消, 它 不 仅 提 高 了 样 品 处 理 的 通 量, 还 减 小 了 由 于 操 作 步 骤 中 的 错 误 和 可 变 因 素 而 带 来 的 误 差 Aria TLX 系 统 的 分 析 软 件 在 一 个 单 独 的 系 统 中 HPLC 和 Turbo Flow 方 法 都 可 运 行, 您 所 需 要 的 操 作 仅 仅 只 是 注 射 样 品, 其 余 的 事 情 都 由 分 析 软 件 完 成 为 了 评 价 一 个 标 准 的 HPLC 和 Turbo Flow 方 法 在 性 能 上 的 差 异, 本 研 究 中 提 取 的 每 一 个 样 品 都 分 别 用 两 种 方 法 都 进 行 了 分

6 析 两 者 的 不 同 在 于 : 标 准 的 HPLC 方 法 中, 样 品 仅 通 过 分 析 柱 Turbo Flow 方 法 中, 样 品 既 通 过 Turbo Flow 制 备 柱 又 通 过 分 析 柱 图 6 给 出 了 两 种 方 法 进 行 500 ng/kg( 万 亿 分 之 一 ) 四 环 素 污 染 的 鱼 样 品 的 检 测 结 果 从 图 上 可 以 看 出 :Turbo Flow 法 检 测 谱 图 中 已 经 没 有 了 在 标 准 的 HPLC 检 测 谱 图 中 出 现 的 干 扰 峰 而 且 Turbo Flow 技 术 中 涡 流 的 特 点 也 成 功 的 去 除 了 干 扰 基 质 在 此 过 程 中 产 生 的 离 子 抑 制 图 6 两 种 方 法 进 行 500 ng/kg( 万 亿 分 之 一 ) 四 环 素 污 染 的 鱼 样 品 的 检 测 结 果 相 同 的 情 况 在 其 他 食 品 药 物 分 析 中 也 被 观 察 到 图 7 是 两 种 方 法 分 别 对 500 ng/kg(ppt) 和 50 ng/kg(ppt) 无 色 孔 雀 石 绿 污 染 的 虾 进 行 的 检 测 结 果 从 图 上 的 结 果 可 以 看 出 :Turbo Flow 检 测 结 果 中 信 噪 比 有 了 很 大 的 改 善, 离 子 抑 制 也 有 相 当 大 的 减 少 效 果 最 为 明 显 的 是 进 行 猪 肝 脏 中 500 ng/kg (ppt) 四 环 素 的 分 析 结 果 ( 请 见 图 8)

7 图 7 两 种 方 法 分 别 对 500 ng/kg(ppt) 和 50 ng/kg(ppt) 无 色 孔 雀 石 绿 污 染 虾 的 检 测 结 果 图 8 猪 肝 脏 中 500 ng/kg (ppt) 四 环 素 的 检 测 图 9 两 种 方 法 所 得 的 标 准 曲 线 通 过 峰 面 积 法 对 猪 肝 脏 中 环 丙 沙 星 检 测 的 谱 图 的 进 行 定 量, 并 分 别 汇 出 两 种 方 法 所 得 出 结 果 的 标 准 曲 线 ( 见 图 9) 同 时 根 据 以 上 结 果 分 别 计 算 出 两 种 方 法 的 定 量 限 (LOD) 相 对 标 准 偏 差 (RSD%) R 2 等 参 数, 详 情 请 见 表 1 从 表 1 中 可 以 看 出 Turbo Flow 法 检 测 的 结 果 有 优 异 的 R 2 值, 在 给 定 的 浓 度 检 测 范 围 内,R 2 值 都 大 于 0.99 TLX 系 统 检 测 结 果 相 比 标 准 的 HPLC 结 果 各 个 方 面 有 明 显 改 善 通 过 对 表 1 中 鱼 虾 和 猪 肝 脏 提 取 物 中 环 丙 沙 星 孔 雀 石 绿 无 色 孔 雀 石 绿 和 四 环 素 的

8 检 测 结 果 的 比 较 分 析 可 以 看 出, LC-MS/MS 配 置 的 Turbo Flow 在 线 提 取 法 进 行 分 析 所 得 的 定 量 限 (LOQs) 明 显 优 于 标 准 HPLC 方 法 所 获 得 的 定 量 限 (LOQs) 检 测 限 的 提 高 缘 于 在 Aria TLX 系 统 中 内 源 性 器 官 的 污 染 消 除 了, 离 子 抑 制 的 影 响 便 减 少 了 表 1 鱼 虾 和 猪 肝 脏 提 取 物 中 环 丙 沙 星 孔 雀 石 绿 无 色 孔 雀 石 绿 和 四 环 素 的 检 测 结 果 汇 总 鱼 标 准 HPLC Turbo Flow 方 法 LOD %RSD LOD(µ %RS (µg/kg) N=3 g/kg) D N=3 R 2 LOD(µ %RSD LOD(µ %RSD g/kg) N=3 g/kg) N=3 环 丙 沙 星 孔 雀 石 绿 无 色 孔 雀 石 绿 虾 环 丙 沙 星 孔 雀 石 绿 无 色 孔 雀 石 绿 猪 肝 脏 环 丙 沙 星 四 环 素 R 2 结 论 : Turbo Flow 技 术 与 TSQ Quantum Access 质 谱 技 术 联 用 的 Aria TLX-1 系 统, 灵 敏 度 高 分 析 时 间 短 可 靠 性 强, 可 以 应 用 该 平 台 对 基 质 复 杂 的 食 物 样 品 进 行 兽 药 残 留 的 检 测 Turbo Flow 技 术 可 以 允 许 样 品 直 接 注 射 入 检 测 系 统, 进 行 微 量 样 品 制 备 得 到 了 实 现 相 比 传 统 脱 线 进 行 样 品 制 备 的 分 析 方 法 来 说, 分 析 所 需 要 的 总 时 间 大 大 缩 减 了 另 外, 与 标 准 的 HPLC 方 法 相 比,Aria TLX-1 系 统 减 弱 了 离 子 抑 制 和 本 底 的 影 响 参 考 文 献 : 1. Plakas, S. M.; Doerge, D. R.; Turnipseed, S. B. Disposition and Metabolism of Malachite Green and Other Therapeutic Dyes in Fish. In Xenobiotics in Fish; Smith, D. J., Gingerich, W. H., Beconi-Barker, M. G., Eds.; Plenum Press: New York City, 1999; p European Commission, Commission Decision 2002/657/EC of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results, as amended by Decision 2003/181/EC(4), (Official Journal of the European Communities L 221, , p. 8-36).

9 3. U.S. Food and Drug Administration. Federal Register: May 22, 1997 (Volume 62, Number 99). 4. European Parliament and Council, Regulation (EC) 1181/2002 of 1 July 2002, amending Annex I of Council Regulation (EEC) No 2377/90 laying down a Community procedure for the establishment of maximum residue limits of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin food (Official Journal of the European Communities L 172, ). 5. European Parliament and Council, Regulation (EC) 508/1999 of 4 March 1999, amending Annex I of Council Regulation (EEC) No 2377/90 laying down a Community procedure for the establishment of maximum residue limits of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin food (Official Journal of the European Communities L 60, ).

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