348 WORLDCHINESEMEDICINE June208,Vol.3,No.6 胶原纤连蛋白和层粘连蛋白在肾小球基底膜和系膜细胞外基质中的沉积明显增加, 导致糖尿病弥漫性肾小球硬化症 ; 在晚期阶段, 肾脏中 Ⅰ 型和 Ⅲ 型胶原明显沉积 [3] 由此可见, 纤维化是 DN 肾脏病理的最主

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1 世界中医药 208 年 6 月第 3 卷第 6 期 347 糖肾方对 db/db 小鼠肾脏纤维化的保护作用刘,2 鹏,3 陈姣伊,3 刘言振赵婷婷张浩军严美花赵海玲 ( 中日友好医院临床医学研究所, 免疫炎性疾病北京市重点实验室, 北京,00029;2 中国医学科学院 / 北京协和医学院研究生院, 北京,00730;3 北京中医药大学, 北京,00029) 李平摘要目的 : 观察糖肾方 (TangShenFang,TSF) 对于自发性 2 型糖尿病肾病 db/db 小鼠肾脏纤维化的保护作用方法 :8 周龄雄性 db/db 小鼠随机分为 2 组, 分别为模型组 (db/db) 和观察组 (db/db+tsf), 每组 9 只 ;8 周龄雄性 db/m 小鼠为正常对照组 (db/m), 顺应性喂养 2 周后, 给予糖肾方干预 2 周, 处死小鼠, 分离小鼠肾脏用于后续检测利用 PAS 和 Mas son 染色观察肾脏病理 ; 利用 WesternBloting Real timepcr 和免疫组化等技术检测肾脏组织纤维化 TGF β/smad3 通路以及 mirna2 和 mirna29b 的表达结果 : 糖肾方可以改善 db/db 小鼠尿微量白蛋白水平, 减轻小鼠肾脏损伤 ;Western Bloting Real timepcr 和免疫组化结果显示, 糖肾方可下调 db/db 小鼠肾脏中纤维化标志分子 TGF β Smad3 Colagen Ⅰ 和 Fibronectin 的表达 ; 下调 db/db 小鼠肾脏 mirna2 的表达, 上调 mirna29b 的表达结论 : 糖肾方可作用于 TGF β/smad3 信号通路抑制肾脏纤维化关键词糖肾方 ; 糖尿病肾病 ; 肾脏纤维化 ;mirna ProtectiveEfectsofTangshenFormulainRenalFibrosisindb/dbMice LiuPeng,2,ChenJiaoyi,3,LiuYanzhen,3,ZhaoTingting,ZhangHaojun,YanMeihua,ZhaoHailing,LiPing (BeijingKeyLabofImmune mediatedinflammatorydiseases,instituteofclinicalmedicalsciences,china JapanFriendship Hospital,Beijing00029,China;2GraduateSchoolofPekingUnionMedicalColege,ChineseAcademyofMedicalScience &PekingUnionMedicalColege,Beijing00730,China;3BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing00029,China) Abstract Objective:ToobservetheefectsofTangshenFormula(TSF)treatmentonrenalfibrosisandexploreitspotential mechanismindb/dbmice.methods:eightweeksolddb/dbanddb/mmicewererandomlydividedintothreesubgroups,(db/m, db/db,db/db+tsf),andalmicewerefedwithanormaldiet.aftertwoweeksadaptation,miceweremaintainedontsftreat mentfor2weeksandwerethensacrificedunderanesthesiaafterovernightfast.animalurineandrenaltisuessampleswerecol lectedforfurtheranalyses.thekidneyswerewashedwithcoldpbssolution;onepartoftherenaltisuewerestoredinliquidnitro gen,andanotherdeposited-80 directlyforsubsequentfrozensections;therestofthekidneywerefixedintotheneutralforma linforpathologicalanalysis.therenalfibrosiswasdetectedbypasandmasonstaining.therenalexpresionoftgf β/smad3 anditstargetgeneswereasesedbywesternbloting,real timepcr,andihc.results:tsfdiminisheduacrofdb/dbmice. HistologicalanalysisusingPASandMasonstainingrevealedtheoccurenceofmesangialmatrixexpansionandextracelularmatrix depositioninthekidneysofdb/dbmice.thetreatmentwithtsfsignificantlyamelioratedthesehistologicalrenalinjuriesindb/db mice.westernblotingandreal timepcranalysisshowedthatexpresionlevelsoftgf β,smad3,colagenⅠ andfibronectin weresignificantlydownregulatedinthedb/dbmicewithtsftreatment.withtsftreatment,theexpresionlevelsofmirna2was downregulated,buttheexpresionlevelsofmirna29bwasupregulated.conclusion:tsfatenuatedrenalfibrosisindb/dbmice, throughsuppresionoftgf β/smad3pathway. KeyWords Tangshenformula;Diabeticnephropathy;Renalfibrosis;miRNA 中图分类号 :R285 5 文献标识码 :A doi:0.3969/j.isn 糖尿病肾病 (DiabeticNephropathy,DN) 是糖尿病 (DiabetesMelitus,DM) 主要的微血管并发症之一, 已成为发达国家和我国发达地区终末期肾病 (EndStageRvenalDisease,ESRD) 的主要原因 [ 2] DN 主要病理改变是由于细胞外基质的过度沉积, 肾小球基底膜的厚度增加, 进而导致系膜增殖和扩张, 最终发展成为肾小球硬化和肾脏纤维化, 丧失正常的功能在 DN 的早期阶段 ( 微量白蛋白尿阶段 ), 基金项目 : 国家自然科学基金国际 ( 地区 ) 合作与交流项目 ( ); 科技部国际合作项目 (20DFA3860); 北京市科委十病十药专项项目 (Z ) 作者简介 : 刘鹏 ( ), 男, 在读博士研究生, 研究方向 : 中医药防治糖尿病肾病,E mail:drliupeng@sina cn 通信作者 : 李平 (956 2 ), 女, 博士, 教授, 研究员, 免疫炎性疾病北京市重点实验室主任, 研究方向 : 中医药防治糖尿病肾病,E mail: lp8675@63 com

2 348 WORLDCHINESEMEDICINE June208,Vol.3,No.6 胶原纤连蛋白和层粘连蛋白在肾小球基底膜和系膜细胞外基质中的沉积明显增加, 导致糖尿病弥漫性肾小球硬化症 ; 在晚期阶段, 肾脏中 Ⅰ 型和 Ⅲ 型胶原明显沉积 [3] 由此可见, 纤维化是 DN 肾脏病理的最主要特征转化生长因子 β(tgf β) 是一种广谱细胞因子, 可被高血糖晚期糖基化终产物 (Ad vancedglycationend products,ages) 促分裂原活化蛋白激酶 (Mitogen activated Protein Kinase, MAPK) 和蛋白激酶 C(ProteinKinaseC,PKC) 等多种途径诱导, 在导致 DN 纤维化过程中发挥着决定性的作用 [4] 多项研究表明 TGF β/smad3 信号通路是引起糖尿病肾病肾脏纤维化的重要通路, 此外 TGF β 还可通过调控一些微小 RNA(MicroRNA, mirna) 进一步引起肾脏损伤 ( 如 :mirna2,mir NA29 等 ) [5 6] 因此,TGF β/smad3 信号通路已成为防治 DN 的重要靶点之一目前的治疗方案尚不能产生显著的疗效, 因此迫切需要新的治疗方法来减缓 DN 的进展 [7] 中医药是祖国瑰宝, 同时国内的糖尿病肾脏疾病 (Diabet ickidneydiseases,dkd) 患者广泛接受中医药的治疗 [8] 中药糖肾方(TangshenFormula,TSF) 颗粒是由七味药组成, 分别为黄芪生地黄山茱萸三七卫矛熟大黄和枳壳, 是李平教授团队在继承名老中医经验基础上, 结合自身临床实践和现代研究成果拟定的中药复方在国家 973 计划和国际科技合作等项目资助下, 课题组前期多中心临床试验证实糖肾方可以减少 DKD 患者尿蛋白排泄率, 改善肾小球滤过率 [9] 本研究主要探讨糖肾方对于肾脏纤维化的影响材料与方法材料动物雄性自发性 2 型糖尿病 db/db 小鼠, 8 周龄, 体重 (35±5)g; 同遗传背景 db/m 小鼠, 体重 (20±2)g, 购自北京大学实验动物中心, 动物生产许可证号 :SCXK( 京 ) 小鼠均饲养于中日友好医院 SPF 级实验动物室屏障环境, 使用许可证号 :SYXK( 京 ) 温度:(23±3), 相对湿度 (55±5)%, 保持 2h 光照 /2h 黑暗交替, 自由饮水和常规饲料喂养本次实验所有操作均严格按照实验动物伦理相关规定进行 2 药物糖肾方配方颗粒, 由江阴天江药业有限公司制剂, 规格 :8g/ 袋, 批号 : 糖肾方组成药物为 : 黄芪卫矛生地枳壳山茱萸大黄三七 7 味中药, 其重量比依次为试剂与仪器小鼠白蛋白 Elisa 试剂盒 ( 美国 BethylLaboratories 公司 );iqtm SYBRGreensu permix( 美国 Bio RAD 公司 ); 蛋白预染 Marker( 中国天根生化科技有限公司 );PVDF 膜 ( 德国 MerckMil lipore 公司 );ColagenⅠ 抗体 ( 美国 SantaCruz 公司 );Fibronectin 抗体 ( 美国 SantaCruz 公司 );Smad3 抗体 ( 美国 CelSignalingTechnology 公司 );P Smad3 抗体 ( 美国 CelSignalingTechnology 公司 );β actin 抗体 ( 美国 SantaCruz 公司 ); 辣根酶标记兔抗小鼠 IgG( 美国 DAKO 公司 );Trizol 试剂 ( 美国 SantaCruz 公司 );QuickstartBradfordDyeReagent( 美国 Bio RAD 公司 );TaqmanmiRNA 试剂盒 ( 美国 Thermo Fisher 公司 );BSA( 美国 Amresco 公司 ) CD 600 全自动生化分析仪 ( 美国雅培公司 );BX43 型光学显微镜 ( 日本 Olympus 公司 ); 多功能酶标仪 ( 美国 ThermoFisher 公司 );PH 仪 ( 美国 ThermoFisher 公司 ); 垂直凝胶电泳系统 ( 美国 Bio RAD 公司 );Nan odrop 高精度核算分光光度计 ( 美国 ThermoFisher 公司 );PCR 仪 ( 美国 Bio RAD 公司 );real timepcr 仪 ( 美国 Bio RAD 公司 ) 2 方法 2 分组与模型制备实验动物购入后, 顺应性喂养 2 周, 称重并进行基础状态观察, 于 0 周龄时根据体重将 db/db 小鼠随机分为 2 组 2 2 给药方法动物分组后从第天开始灌胃给药, 次 /d, 每周称重, 连续给药 2 周糖肾方剂量参考前期临床研究并按照标准动物剂量换算 [0], 根据体重按照体表面积进行换算, 糖肾方的临床给药剂量是 6g/d, 按照人的标准体重为 60kg 计算, 小鼠体重按照 20g 计算, 小鼠给药剂量应为人给药剂量的 9 倍, 则小鼠给药剂量为还是 2 4g/(kg d) [9] 糖肾方颗粒剂按照 0 8g/mL 的浓度进行配制,4 保存, 灌胃前取出恢复至室温, 混匀后备用各组小鼠灌胃给药方案如下表所示见, 表表实验动物给药方案组别给药措施剂量正常对照组 (db/m)(n=9) 蒸馏水 2 4g/(kg d) 模型组 (db/db)(n=9) 蒸馏水 2 4g/(kg d) 糖肾方组 (db/db+tsf)(n=9) 糖肾方 2 4g/(kg d) 2 3 标本采集实验期间从给药 0 周开始, 每 4 周将小鼠转移入代谢笼一次, 小鼠禁食但不禁水, 收集 24h 尿液后测定尿量, 混匀后留取 5mL,0 000rpm4 离心 5min, 留取上清液, 保存于 -80

世界中医药 208 年 6 月第 3 卷第 6 期 349 冰箱用于检测尿白蛋白及尿肌酐水平在给药 2 周实验结束时, 小鼠禁食 2h 后, 眼内眦取血,3000 r/min4 离心 5min, 留取上清液, 保存于 -80 冰箱用于检测各项生化指标之后迅速打开小鼠腹腔, 摘取双侧肾脏, 分别称重一侧肾脏去除髓质后, 一半置于 0% 中性福尔马林溶液中固定, 另一半置于 4%

(PeriodicAcid Schif,PAS) 染色和 Mason 染色, 光镜下观察肾脏组织病理变化, 采用评分法对其进行半定量分析采用 WesternBloting 以及免疫组化法检测肾脏组织中 Smad3 P Smad3 Col lagenⅠ 和 Fibronectin 的表达情况, 采用 Real time PCR 检测肾脏组织中 TGF βsmad3 ColagenⅠ 和

3 世界中医药 208 年 6 月第 3 卷第 6 期 349 冰箱用于检测尿白蛋白及尿肌酐水平在给药 2 周实验结束时, 小鼠禁食 2h 后, 眼内眦取血,3000 r/min4 离心 5min, 留取上清液, 保存于 -80 冰箱用于检测各项生化指标之后迅速打开小鼠腹腔, 摘取双侧肾脏, 分别称重一侧肾脏去除髓质后, 一半置于 0% 中性福尔马林溶液中固定, 另一半置于 4% 多聚甲醛中固定 ; 另一侧分离出肾皮质, 迅速置于干燥冻存管中, 于液氮保存 2 4 检测指标与方法取尿液上清, 检测尿白蛋白浓度和尿肌酐 ; 并计算尿白蛋白肌酐比值 (Urine Albumin to CreatinineRatio,UACR) 肾组织经过 0% 中性福尔马林固定 24h 后, 依次进行脱水透明石蜡包埋后, 使用切片机分别切为 3μm 厚切片, 进行过碘酸雪夫 (PeriodicAcid Schif,PAS) 染色和 Mason 染色, 光镜下观察肾脏组织病理变化, 采用评分法对其进行半定量分析采用 WesternBloting 以及免疫组化法检测肾脏组织中 Smad3 P Smad3 Col lagenⅠ 和 Fibronectin 的表达情况, 采用 Real time PCR 检测肾脏组织中 TGF βsmad3 ColagenⅠ 和 Fibronectin 的 mrna 水平以及 mirna2 和 mirna 29b 的表达情况 3 统计学方法所有计量数据均以均数 ± 标准误 ( x±s) 珋表示, 采用 GraphPadPrism5 0 软件进行统计分析, 采用 One wayanova 分析和 Dunnet t 多组间比较等检验方法, 以 P<0 05 为差异有统计学意义 2 结果 2 糖肾方对 db/db 小鼠 UACR 的影响尿微量白蛋白是评价 DN 病情进展的重要指标, 本研究中以尿肌酐进行校正, 使用 UACR 作为评价病情进展如图 B 所示在 0 周龄实验开始时, 模型组 db/db 小鼠 UACR 显著高于正常组 db/m 小鼠, 而模型组与糖肾方组 db/db 小鼠 UACR 无明显差异 ; 从 8 周龄开始, 在给予糖肾方干预后,db/db 小鼠 UACR 显著降低, 抑制病情进展图中,db/m 表示正常对照组,db/db 表示模型组,db/db+TSF 表示糖肾方观察组 2 2 糖肾方显著改善 db/db 小鼠肾脏病理损伤肾脏组织经过 PAS 染色后, 糖原在光镜下呈紫红色颗粒如图 2A 所示正常组 db/m 小鼠肾小球的结构正常, 系膜区阳性物质未见增多 ; 模型组 db/db 小鼠肾小球官腔的结构异常, 系膜区阳性物质明显增多, 同时伴有系膜基质显著增生以及基底膜增厚 ; 在给予糖肾方干预后, 可明显改善 db/db 小鼠肾小球系膜基质的生及基底膜增厚, 同时对肾小球系膜基质百分比进行半定量分析, 结果具有统计学差异见图 2B 图糖肾方对 db/db 小鼠 UACR 的影响注 :db/db 组与 db/m 组比较, P<0 00;db/db+TSF 组与 db/db 组比较, P<0 0, P<0 00 图 2 肾脏 PAS 染色 ( 400) 和 Maso 染色 ( 400) 注 :db/db 组与 db/m 组比较, P<0 00;db/db+TSF 组与 db/db 组比较, P<0 05 经过 Mason 染色后, 胶原在光镜下呈现蓝色如图 2C 所示正常组 db/m 小鼠肾小球和肾小管的结构正常, 胶原表达未见增多 ; 模型组 db/db 小鼠肾小球系膜区及基底膜胶原出现明显的增生, 同时出现肾小管扩张 ; 给予糖肾方干预后, 可明显减少 db/ db 小鼠肾小球及小管间质的胶原沉积, 使用纤维化面积进行半定量分析, 结果具有统计学差异见图 2D 2 3 糖肾方对 db/db 小鼠肾脏皮质 ColagenⅠ 和 Fibronectin 蛋白及 mrna 水平的影响如图 3 所示, 免疫组化检测发现, 模型组 db/db 小鼠肾脏皮质 ColagenⅠ 和 Fibronectin 白水平显著高于正常组 db/ m 小鼠, 在给予糖肾方干预后,db/db 小鼠肾脏皮质 Ⅰ 型胶原和纤维连接蛋白水平显著下降, 结果具有统计学差异见图 4 所示 WesternBloting 检测发现, 模型组 db/db 小鼠肾脏皮质 ColagenⅠ 和 Fi bronectin 蛋白水平显著高于正常组 db/m 小鼠, 在给予糖肾方干预后,db/db 小鼠肾脏皮质 Ⅰ 型胶原和纤维连接蛋白水平显著下降如图 5 所示 Real timepcr 检测发现, 模型组 db/db 小鼠肾脏皮质 Ⅰ 型胶原和纤维连接蛋白 mrna 水平显著高于正常组 db/m 小鼠, 在给予糖肾方干预后,db/db 小鼠肾脏

350 WORLDCHINESEMEDICINE June208,Vol.3,No.

组比较, P<0 0 图 3 免疫组化检测小鼠肾脏 ColagenⅠ 和 Fibronectin 蛋白表达注 :db/db 组与 db/m 组比较, P<0 00;db/db+TSF 组与 db/db 组比较, P<0 05, P<0 0 图 4

图 7 real timepcr 检测小鼠肾脏 TGF βmrna 表达注 :db/db 组与 db/m 组比较, P<0 0, P<0 05;db/db+ TSF 组与 db/db 组比较, P<0 05 2 5 糖肾方对 db/db

在糖尿病肾脏纤维化过程中发挥着重要作用如图 8 所示,real timepcr 检测发现, 模型组 db/db 小鼠肾脏皮质中 mirna2 水平显著高于正常组 db/m 小鼠,miRNA29b 水平显著低于正常组 db/m 小鼠 ;

db/m 组比较, P<0 0, P<0 00;db/db +TSF 组与 db/db 组比较, P<0 05, P<0 0 2 4 糖肾方对 db/db 小鼠肾脏皮质 TGF β/smad3 信号通路的影响如图 6

所示,real timepcr 检测发现, 模型组 db/db 小鼠肾脏皮质中 TGF β mrna 水平显著高于正常组 db/m 小鼠, 在给予糖肾方干预后,db/db 小鼠肾脏皮质 TGF βmrna 水平显著下降图 8 Real

4 350 WORLDCHINESEMEDICINE June208,Vol.3,No.6 皮质 Ⅰ 型胶原和纤维连接蛋白 mrna 水平显著下降图 6 WesternBloting 检测小鼠肾脏 P Smad3/Smad3 蛋白表达注 :db/db 组与 db/m 组比较, P<0 00;db/db+TSF 组与 db/db 组比较, P<0 0 图 3 免疫组化检测小鼠肾脏 ColagenⅠ 和 Fibronectin 蛋白表达注 :db/db 组与 db/m 组比较, P<0 00;db/db+TSF 组与 db/db 组比较, P<0 05, P<0 0 图 4 WesternBloting 检测小鼠肾脏 ColagenⅠ 和 Fibronectin 蛋白表达注 :db/db 组与 db/m 组比较, P<0 0, P<0 00;db/db +TSF 组与 db/db 组比较, P<0 05, P<0 0 图 7 real timepcr 检测小鼠肾脏 TGF βmrna 表达注 :db/db 组与 db/m 组比较, P<0 0, P<0 05;db/db+ TSF 组与 db/db 组比较, P< 糖肾方对 db/db 小鼠肾脏皮质 mirna2 和 mirna29b 的影响 mirna 是可以调节各项生命活动的小内源非编码 RNA, 抑制目标基因翻译和 / 或诱导 mrna 降解,Smad3 介导的 mirna( 例如 : mirna2,mirna29 等 ) 在糖尿病肾脏纤维化过程中发挥着重要作用如图 8 所示,real timepcr 检测发现, 模型组 db/db 小鼠肾脏皮质中 mirna2 水平显著高于正常组 db/m 小鼠,miRNA29b 水平显著低于正常组 db/m 小鼠 ; 在给予糖肾方干预后, db/db 小鼠肾脏皮质中 mirna2 水平显著下降, mirna29b 水平显著升高图 5 real timepcr 检测小鼠肾脏 ColagenⅠ 和 FibronectinmRNA 表达注 :db/db 组与 db/m 组比较, P<0 0, P<0 00;db/db +TSF 组与 db/db 组比较, P<0 05, P< 糖肾方对 db/db 小鼠肾脏皮质 TGF β/smad3 信号通路的影响如图 6 所示,WesternBloting 检测发现, 模型组 db/db 小鼠肾脏皮质中 Smad3 蛋白磷酸化水平显著高于正常组 db/m 小鼠, 在给予糖肾方干预后,db/db 小鼠肾脏皮质 Smad3 蛋白磷酸化水平显著下降如图 7 所示,real timepcr 检测发现, 模型组 db/db 小鼠肾脏皮质中 TGF β mrna 水平显著高于正常组 db/m 小鼠, 在给予糖肾方干预后,db/db 小鼠肾脏皮质 TGF βmrna 水平显著下降图 8 Real timepcr 检测小鼠肾脏 mirna2 和 mirna29b 表达注 :db/db 组与 db/m 组比较, P<0 05, P<0 00;db/db +TSF 组与 db/db 组比较, P<0 05, P<0 0 3 讨论我国已经成为了全球 DM 患者最多的国家, 而且患病人数还在继续增加, 最新的研究显示我国目前 DM 的患病率已经达到了 0 9%, 同时糖尿病前期的人口预计在 35 7% [] DN 作为 DM 主要的微血管并发症之一, 已成为 ESRD 的主要病因, 严重威

5 世界中医药 208 年 6 月第 3 卷第 6 期 35 胁着人类的健康, 给国家和社会造成了巨大的经济负担 [] 本研究发现糖肾方可显著抑制 TGF β/ Smad3 信号通路的表达, 下调 Ⅰ 型胶原和纤维连接蛋白的表达, 减轻肾脏纤维化 ; 此外研究还发现糖肾方还可通过下调肾脏中 mirna2 的表达以及上调 mirna29b 的表达, 抑制肾脏纤维化的进展, 保护肾脏功能 TGF β/smad3 信号通路是引起糖尿病肾病肾脏纤维化的重要通路, 可引起 ECM 的过度沉积, 导致肾脏纤维化 [6] DN 状态下的许多物质, 例如高血糖水平 AGEs 及血管紧张素 Ⅱ(AngiotensinⅡ,Ang Ⅱ) 都可上调 TGF β 的表达, 并通过依赖及非依赖 TGF β 途径激活 Smad 信号通路 Smad3 可直接结合到胶原蛋白的启动子区域, 来上调胶原蛋白的表达, 促进肾脏的纤维化进展 [2 3] 同时降低成纤维细胞中的基质金属蛋白酶 (Matrixmetaloprotein ase,mmp ) 活性, 减少胶原蛋白的降解 [4] DN UUO 高血压肾损害及药物导致的肾损害动物模型中, 敲除 Smad3 均可抑制肾脏的纤维化 [5 8] TGF β/smad 信号通路导致肾脏纤维化的主要机制有 : ) 可通过诱导胶原和纤维连接蛋白的表达, 直接引起 ECM 的过度沉积 [9] ;2) 可诱导上皮细胞通过上皮间质转分化 (Epithelial mesenchymaltransition, EMT) 转化为肌成纤维细胞, 诱导巨噬细胞通过巨噬细胞肌成纤维细胞转化肌成纤维细胞 (Macrophage myofibroblasttransition,mmt), 以及诱导内皮细胞间质转分化 (Endothelial mesenchymaltransition,end MT) 为肌成纤维细胞 [20 2] ;3) 可诱导肾小球系膜细胞分泌增强, 导致系膜基质增多 ; 还可诱导肾小管上皮细胞和足细胞的凋亡, 影响肾脏正常的功能, 加重肾脏的纤维化 [22] ;4) 降低成纤维细胞中的 MMP 活性, 减少胶原蛋白的降解 [4] 所以,TGF β/ Smad 信号通路的激活可显著促进肾脏纤维化的进展, 可作为治疗 DN 的潜在靶点在一项纳入 604 例 DN 患者的 meta 分析中发现,DN 患者的血清和尿液中的 TGF β 含量显著升高 [23] 一些 TGF β 的抑制剂已经进行了临床前和临床研究, 但由于不良反应以及疗效不显著等原因, 还尚未得到广泛的应用 [24] 在一项有 77 例 DN 患者参与的随机双盲安慰剂对照研究中发现, 一种可以阻断 TGF β 启动子的小分子药物 Pirfenidone, 可延缓 DN 患者的肾小球滤过率 (EstimatedGlomerular FiltrationRate,eGFR) 的下降 [25] 但在有 36 例激素抵抗型原发局灶性节段性肾小球硬化症的随机双盲安慰剂对照研究中发现, 给予人源的 TGF β 单克隆抗体 fresolimumab(gc008) 后并未发现患者的 egfr 有明显改善 [26] mirna 是可以调节各项生命活动的小内源非编码 RNA, 长度为 20~22 个核苷酸, 可与靶基因的 3 端非翻译区结合, 抑制目标基因翻译和 / 或诱导 mrna 降解, 其中一些 mirna( 例如 :mirna 2, mirna29 等 ) 在糖尿病肾脏纤维化过程中发挥着重要作用 [6] mirna2 是被广泛研究的 mirnas 之一, 早在 2008 年的一项研究中发现, 心力衰竭模型中 mirna2 可加重心脏的纤维化 [27] 尽管在正常肾脏中 mirna2 的含量比较低, 但是在多种肾脏疾病模型中, 例如糖尿病肾病和急性肾小球肾炎的动物模型中, 均可发现 mirna2 表达升高, 肾脏发生纤维化改变 [28 29] 已有大量研究表明,TGF β 可上调 mirna2 的表达 ; 在敲除 TGF β 的糖尿病模型中,miRNA2 的表达减少, 肾脏纤维化程度减轻 [30] 因此,miRNA2 可成为改善纤维化相关疾病的重要靶点 ; 在敲除 mirna2 的小鼠模型中也进一步证实, 敲除 mirna2 后, 可抑制肾脏的纤维化 [3] 也有研究证实,miRNA2 的表达是由 Smad3 调控的,Smad3 的激活可以上调 mirna 2 的表达 [29] 此外,miRNA2 还可通过其他途径促进肾脏纤维化, 包括 :)mirna2 可抑制肾脏过氧化物酶体增殖物激活受体 α(peroxisomeproliferator acti vatedreceptorα,pparα) 的表达, 干扰正常的脂质代谢, 引起肾脏脂质沉积, 继而导致肾脏纤维化改变 [3] ;2) 激活肾脏中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mammaliantargetofrapamycin,mtor) 复合物 (mtorc), 促进纤维连接蛋白的表达, 引起肾脏纤维化 [32] 此外, 在 STZ 诱导的糖尿病小鼠中发现, 沉默 mirna2 后, 可改善小鼠的系膜扩张肾间质纤维化及巨噬细胞浸润, 减少蛋白尿以及抑制肾脏的纤维化和炎性反应基因的表达 [33] mir29 是另一个被广泛研究的 mirnas,mir29 家族中包括 mir29a mirna29b 和 mir29c3 个成员, 其所有成员均具有相同的序列并且都可结合到相同的目标基因, 在临床试验和动物实验中均发现 mirna29 具有抗纤维化作用, 还可抑制 TGF β 的转录 [34] 在正常肾脏和肺中 mirna29b 的表达较高, 但当肾脏和肺发生纤维化改变时,miRNA29b 的表达明显降低 [35 36] 在单侧输尿管梗阻(Unilateral ureteralobstruction,uuo) 小鼠模型中, 肾脏出现纤维化改变, 同时 mirna29b 的表达降低 ; 而在敲除

6 352 WORLDCHINESEMEDICINE June208,Vol.3,No.6 Smad3 的 UUO 小鼠模型中, 肾脏纤维化程度明显减轻,miRNA29b 的表达也明显升高, 因此 Smad3 可抑制 mirna29b 的表达 [36] 由于 mirna29b 可直接作用于 I/I/IV 型胶原蛋白纤维连接蛋白和弹性蛋白的 3 端非翻译区, 抑制其表达 ; 在糖尿病肾病小鼠模型中, 将 db/db 小鼠过表达 mirna29b 后, 其蛋白尿明显减少, 胶原蛋白和纤维连接蛋白表达减少, 肾脏纤维化程度明显减轻 [37] 因此,miRNA2 及 mirna29b 的表达与 DN 肾脏纤维化具有密切联系,miRNA2 及 mirna29b 可作为治疗 DN 的潜在靶点在台湾的 DN 患者中发现, 其血清中的 mirna2 含量明显高于正常对照组, 而 mirna29b 含量明显降低 ; 随着疾病的进展, mirna2 的表达逐渐提高,miRNA29b 的表达逐渐降低 ; 所以血清中的 mirna2 及 mirna29b 的含量可作为 DN 的进展期间的生物标志物 [38] 糖肾方作为临床上治疗 DKD 的经验方, 课题组前期研究已经证明其通过抑制 TGF β/smad3 信号通路改善 STZ 加单侧肾切除大鼠肾脏纤维化 [39] 本研究发现, 给予糖肾方干预 2 周后,db/db 小鼠肾脏皮质中 Smad3 的磷酸化程度降低,Ⅰ 型胶原和纤维连接蛋白及 mrna 表达的下调, 肾脏纤维化明显减轻, 表明糖肾方可减轻 DN 的肾脏纤维化保护肾脏功能综上所述, 糖肾方可抑制 db/db 小鼠肾脏 TGF β/smad3 信号通路的表达, 可能通过下调 mirna 2 的表达, 同时上调 mirna29b 的表达, 显著减轻肾脏纤维化进展保护肾脏功能参考文献 []BreyerM D,KretzlerM.Novelavenuesfordrugdiscoveryindiabetic kidneydisease[j].expertopindrugdiscov,208,3():65. [2]BolignanoD,CernaroV,GembiloG,etal.Antioxidantagentsforde layingdiabetickidneydiseaseprogresion:a systematicreview and meta analysis[j].plosone,207,2(6):e [3]SunJ,WangY,CuiW,etal.RoleofEpigeneticHistoneModifications indiabetickidneydiseaseinvolvingrenalfibrosis[j].jdiabetes Res,207,207(3): [4]HilsCE,AlrasheedN,AlrasheedN,etal.C peptidereversestgf beta inducedchangesinrenalproximaltubularcels:implicationsfor treatmentofdiabeticnephropathy[j].americanjournalofphysiology RenalPhysiology,2009,296(3):F64. [5]ChungACK,LanHY.MicroRNAsinrenalfibrosis[J].Frontiersin Physiology,205,(6): [6]MengX,TangPM,LiJ,etal.TGF β/smadsignalinginrenalfibrosis [J].FrontiersinPhysiology,205,6:82. [7]MarathePH,GaoHX,CloseKL.AmericanDiabetesAsociation StandardsofMedicalCareinDiabetes[J].JournalofDiabetes,207, 9(4):320. [8]SunH,LiQ,LiuY,etal.Xiao Yao San,AChineseMedicineFormu la,ameliorateschronicunpredictablemildstresinducedpolycystic OvaryinRat[J].FrontiersinPhysiology,207(8):729. [9]LiP,ChenY,LiuJ,etal.Eficacyandsafetyoftangshenformulaon patientswithtype2diabetickidneydisease:amulticenterdouble blin dedrandomizedplacebo controledtrial[j].plosone,205,0(5): e [0]LiP,ChenY,LiuJ,etal.EficacyandSafetyofTangshenFormula onpatientswithtype2diabetickidneydisease:a Multicenter Double BlindedRandomizedPlacebo ControledTrial[J].PlosOne, 205,0(5):e []WangL,GaoP,ZhangM,etal.PrevalenceandEthnicPaternofDi abetesandprediabetesinchinain203,jama,207,37(24): 255. [2]ChenSJ,YuanW,MoriY,etal.StimulationoftypeIcolagentran scriptioninhumanskinfibroblastsbytgf beta:involvementofsmad 3[J].JournalofInvestigativeDermatology,999,2(): [3]VindevoghelL,LechleiderRJ,KonA,etal.SMAD3/4 Dependent TranscriptionalActivationoftheHumanTypeVIColagenGene (COL7A)PromoterbyTransformingGrowthFactorβ[J].Journalof BiologicalChemistry,998,95(25): [4]YuanW,VargaJ.TransformingGrowthFactor βrepresionofma trixmetaloproteinase indermalfibroblastsinvolvessmad3,jour nalofbiologicalchemistry,200,276(42): [5]LiuZ,HuangXR,LanHY:Smad3mediatesANG I inducedhyper tensivekidneydiseaseinmice[j].americanjournalofphysiology RenalPhysiology,202,302(8):F986. [6]ZhouL,FuP,HuangXR,etal.Mechanism ofchronicaristolochic acidnephropathy:roleofsmad3[j].americanjournalofphysiology RenalPhysiology,200,298(2):F006. [7]SatoM,MuragakiY,SaikaS,etal.TargeteddisruptionofTGF be ta/smad3signalingprotectsagainstrenaltubulointerstitialfibrosis inducedbyunilateralureteralobstruction[j].journalofclinicalin vestigation,2003,2(0):486. [8]FujimotoM,MaezawaYK,JohK,etal.MicelackingSmad3arepro tectedagainststreptozotocin induceddiabeticglomerulopathy,bio chemical& BiophysicalResearchCommunications,2003,305(4): 002. [9]SamarakoonR,OverstreetJM,HigginsSP,etal.TGF β SMAD/ p53/usf2 PAI transcriptionalaxisinureteralobstruction in ducedrenalfibrosis[j].cel& TisueResearch,202,347(): [20]MengXM,ChungACK,LanHY.RoleoftheTGF β/bmp 7/Smad pathwaysinrenaldiseases,clinicalscience,203,24(4):243. [2]WuCF,ChiangWC,LaiCF,etal.Transforminggrowthfactorβ stimulatesprofibroticepithelialsignalingtoactivatepericyte myofi broblasttransitioninobstructivekidneyfibrosis[j].americanjour nalofpathology,203,82():8 3. [22]LópezhernándezFJ,LópeznovoaJM.RoleofTGF βinchronickid neydisease:anintegrationoftubular,glomerularandvascularefects [J].Cel&TisueResearch,202,347():4 54.

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中草药致谢李沛赵继敏郑智敏江亚楠等病理生理学教研室老师在实验中给予的指导和帮助狄建彬顾振纶赵笑东钱培刚蒋小岗郭次仪中草药中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 10 年 8 月 1324 LDL C 非常明显升高 (