免疫组织化学的概念：

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浒泽窦
7 years ago
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1 免疫组织化学的概念 : 免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理, 通过化学反应使标记抗体的显色剂 ( 荧光素酶金属离子同位素 ) 显色来确定组织细胞内抗原 ( 多肽和蛋白质 ), 对其进行定位定性及定量的研究, 称为免疫组织化学免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些? 实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类, 前者包括石蜡切片 ( 病理大片和组织芯片 ) 和冰冻切片, 后者包括组织印片细胞爬片和细胞涂片其中石蜡切片是制作组织标本最常用最基本的方法, 对于组织形态保存好, 且能作连续切片, 有利于各种染色对照观察 ; 还能长期存档, 供回顾性研究 ; 石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响, 但可进行抗原修复, 是免疫组化中首选的组织标本制作方法石蜡切片为什么要做抗原修复? 有哪些方法? 石蜡切片标本均用甲醛固定, 使得细胞内抗原形成醛键羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇, 同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽所以要求在进行 IHC 染色时, 需要先进行抗原修复或暴露, 即将固定时分子之间所形成的交联破坏, 而恢复抗原的原有空间形态常用的抗原修复方法有微波修复法, 高压加热法, 酶消化法, 水煮加热法等, 常用的修复液是 ph6.0 的 0.01 mol/l 的柠檬酸盐缓冲液免疫组化常用的染色方法有哪些? 根据标记物的不同分为免疫荧光法, 免疫酶标法, 亲和组织化学法, 后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法这种方法敏感性更高, 有利于微量抗原 ( 抗体 ) 在细胞或亚细胞水平的定位, 其中生物素抗生物素染色法最常用抗体的保存 : 抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成, 常用的有聚丙烯, 聚碳酸酯和硼硅酸玻璃如储存的抗体中蛋白浓度很低 (10-100mg/L), 就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附, 隔离蛋白常用 0.1%-1.0% 的牛血清白蛋白绝大多数已稀释的抗体应存在 4-8 条件下, 以免冻融对抗体蛋白产生有害效应抗体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于 -20 条件下, 并避免反复冻融冷冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻, 应绝对避免用高温快速解冻被细菌污染的抗体常会出现假阳性结果, 应将污染的抗体溶液及其他试剂弃之为防止细菌污染, 可于抗体溶液中加入 0.01% 叠氮钠抗体经真空冷冻干燥后置 -20 以下可保存 3-5 年保存稀释后的单抗应加入 0.1% 叠氮钠浓度大多数稀释抗体可进行冷冻保存, 少数抗体可能会丢失抗原活性大多数单抗, 只要蛋白浓度适当, 可在 4 下保存数月多聚赖氨酸溶液 (Poly-L-Lysine Solution) Cat.No.: SGP8920 Size: 10ml 1

2 Conc.: 0.1% w/v, in water Storage: Thimerosal, 0.01%, added as preservative 多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织切片与玻片黏合剂, 该多聚阳离子分子与组织切片上的阴离子相互作用会产生较强的黏合力适用组织学, 免疫组织化学, 冰冻切片, 细胞涂片, 原位杂交等使用的玻片的防脱片处理, 以防实验操作过程中组织掉片也可用于细胞培养, 增加细胞贴壁能力 [ 使用说明 ] 免疫学操作步骤 ( 可直接在玻片上涂布 ) 1. 灭菌的 ddh2o 1:10 稀释该多聚赖氨酸溶液 2. 用之前将稀释的多聚赖氨酸溶液放在室内, 使其温度到室温将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液 5 分钟注意增加时间不会提高包被效果 4. 在 60 烘箱 1 小时干燥, 或室温过夜干燥待用 [ 注意 ] 1. 每 100mL 已稀释的多聚赖氨酸溶液要包被的玻片张, 超过 90 张片子将影响其黏合力 2. 用之前的玻片必须保持清洁必要时用含 1% HCl 的 70% 乙醇溶液来清洗 4. 释过的多聚赖氨酸溶液要放在 2-8, 至少在 3 个月内是稳定的 5. 用过的稀释液要过滤, 若出现浑浊或长菌要丢弃 [ 订货信息 ] 100 / 10ml 免疫组化操作规程 ( 一 ) 仪器设备 1)18cm 不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉 ; 2) 水浴锅 ( 二 ) 试剂 1)PBS 缓冲液 (ph7.2~7.4): NaCl 137mmol/L,KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L 2)0.01mol/L 柠檬酸盐缓冲液 (CB,pH6.0,1000ml): 柠檬酸三钠 3g, 柠檬酸 0.4g 3)0.5mol/L EDTA 缓冲液 (ph8.0): 700ml 水中溶解 186.1gEDTA 2H2O, 用 10 mmol/l NaOH 调至 ph8.0, 加水至 1000ml 4)1mol/L 的 TBS 缓冲液 (ph8.0): 在 800ml 水中溶解 121gTris 碱, 用 1N 的 HCl 调至 ph8.0, 加水至 1000ml 2

3 5) 酶消化液 : a 0.1% 胰蛋白酶液 : 用 0.1%CaCl2(pH7.8) 配制 b 0.4% 胃蛋白酶液 : 用 0.1N 的 HCl 配制 6)3% 甲醇 -H2O2 溶液 : 用 30%H2O2 和 80% 甲醇溶液配制 7) 封裱剂 : a 甘油和 0.5mmol/L 碳酸盐缓冲液 (ph9.0~9.5) 等量混合 ; b 油和 TBS( 或 PBS) 配制 8)TBS/PBS ph9.0~9.5, 适用于荧光显微镜标本 ;ph7.0~7.4 适合于光学显微镜标本 ( 三 ) 操作流程 1 脱蜡和水化脱蜡前, 应将组织芯片在室温中放置 60 分钟或 60 恒温箱中烘烤 20 分钟 1) 组织芯片置于二甲苯中浸泡 10 分钟, 更换二甲苯后再浸泡 10 分钟 ; 2) 无水乙醇中浸泡 5 分钟 ; 3)95% 乙醇中浸泡 5 分钟 ; 4)70% 乙醇中浸泡 5 分钟 ; 2 抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片 1) 抗原热修复 (1) 高压热修复在沸水中加入 EDTA(pH8.0) 或 0.01M 枸橼酸钠缓冲溶液 (ph6.0) 盖上不锈钢高压锅的盖子, 但不进行锁定将玻片置于金属染色架上, 缓慢加压, 使玻片在缓冲液中浸泡 5 分钟, 然后将盖子锁定, 小阀门将会升起来 10 分钟后, 去除热源, 置入凉水中, 当小阀门沉下去后打开盖子本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复 (2) 煮沸热修复电炉或者水浴锅加热 0.01M 枸橼酸钠缓冲溶液 (ph6.0) 至 95 左右, 放入组织芯片加热 10~15 分钟 (3) 微波热修复在微波炉里加热 0.01M 枸橼酸钠缓冲溶液 (ph6.0) 至沸腾后将组织芯片放入, 断电, 间隔 5~10 分钟, 反复 1-2 次适用的抗原有 :AR,Bax,Bcl-2,C-fos,X-jun, C-kit,C-myc,E-cadherin,Chromogranin A,Cyclin,ER,Heat shock protein,hpv,ki-67, MDMZ,p53,p34,p16,p15,P-glycoprotein,PKC,PR,PCNA,ras,Rb,Topoismerase Ⅱ 等是以高温, 高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消化以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段甲醛和蛋白水解交联过程中氨基酸侧链上的某些基团 ( 抗原决定簇 ) 如咪唑吲哚等基团受到影响, 通过 120 高温或强碱处理后, 可使交联打开 2) 酶消化方法常用 0.1% 胰蛋白酶和 0.4% 胃蛋白酶液胰蛋白酶使用前预热至 37, 切片也预热至 37, 消化时间约为 5~30 分钟 ; 胃蛋白酶消化 37 时间为 30 分钟适用于被固定遮避的抗原, 其中有 :Collagen,Complement,Cytokeratin,C-erB-2,GFAP,LCA,LN 等 3

4 3 免疫组织化学染色 SP 法 1) 脱蜡水化 ; 2)PBS 洗 2~3 次各 5 分钟 ; 3)3%H2O2(80% 甲醇 ) 滴加在 TMA 上, 室温静置 10 分钟 ; 4)PBS 洗 2~3 次各 5 分钟 ; 5) 抗原修复 ; 6)PBS 洗 2~3 次各 5 分钟 ; 7) 滴加正常山羊血清封闭液, 室温 20 分钟甩去多余液体 8) 滴加 Ⅰ 抗 50μl, 室温静置 1 小时或者 4 过夜或者 37 1 小时 9)4 过夜后需在 37 复温 45 分钟 10)PBS 洗 3 次各 5 分钟 ; 11) 滴加 Ⅱ 抗 40~50μl, 室温静置, 或 37 1 小时 ; 12)II 抗中可加入 0.05% 的 tween-20 13)PBS 洗 3 次各 5 分钟 ; 14)DAB 显色 5~10 分钟, 在显微镜下掌握染色程度 ; 15)PBS 或自来水冲洗 10 分钟 ; 16) 苏木精复染 2 分钟, 盐酸酒精分化 ; 17) 自来水冲洗 10~15 分钟 ; 18) 脱水透明封片镜检 SABC 法 1) 脱蜡水化 2)PBS 洗两次各 5 分钟 3) 用蒸馏水或 PBS 配置新鲜的 3%H2O2, 室温封闭 5~10 分钟, 蒸馏水洗 3 次 4) 抗原修复 5)PBS 洗 5 分钟 6) 滴加正常山羊血清封闭液, 室温 20 分钟甩去多余液体 7) 滴加 Ⅰ 抗, 室温 1 小时或者 4 过夜或者 37 1 小时 (4 过夜后在 37 复温 45 分钟 ) 8)PBS 洗三次每次 2 分钟 9) 滴加生物素化二抗,20 ~37 20 分钟 10)PBC 洗 3 次每次 2 分钟 11) 滴加试剂 SABC,20 ~37 20 分钟 12)PBS 洗 4 次每次 5 分钟 13)DAB 显色 :DAB 显色试剂盒或者自配显色剂显色 ( 镜下掌握显色程度 ) 4

5 14) 蒸馏水洗苏木素复染 2 分钟盐酸酒精分化 15) 脱水透明封片镜检免疫组化实验过程中的要点和技巧 1. 固定 : 最好用 4% 的多聚甲醛固定液对于冰冻切片, 甲醛固定有时比冰冻丙酮好 ; 但对于不同的组织和抗原, 可选用不同的固定液有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液, 请于购置前注意说明书 Bouin S 固定液 : 饱和苦味酸 750ml, 甲醛 250ml, 冰醋酸 50ml, 其对组织的穿透力较强, 固定较好, 结构完整, 但因偏酸, 对抗原有一定损害, 且组织收缩明显, 不适于组织标本的长期保存 PLP 液 : 即高碘酸钠 - 赖氨酸 - 多聚甲醛, 适于固定石蜡切片适于富含糖类组织, 对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好 2. 组织脱水, 透明 : 时间不能太长, 否则在切片时容易碎片, 切不完整 3. 切片时展片 : 有些组织在切片后难以在水中展开, 这时可适当地在水中加入几滴乙醇 4. 烤片 :60 30 分钟或 37 过夜, 温度太高或时间太长, 抗原容易丢失 5. 蜡块及切片的保存 : 最好在 4 保存 6. 脱片问题 : Poly-L-Lysine( 多聚赖氨酸 ) 为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂,6ml 的多聚赖氨酸溶液可按 1:10 稀释成 60ml 的工作液, 适合于需要酶消化微波高温高压的防脱片处理如不行, 可用双重处理 (APES 和 Poly-L-Lysine) 的切片在以上两种条件都行不通的情况下, 可用如下方法 : 切片在脱蜡前, 放在 APES 1: 50 丙酮溶液中浸泡 3 分钟, 晾干, 即可进行下一步 7. 灭活内源性酶 :HRP 系统 :3% 双氧水灭活 ;AP 系统 :3%HAc 灭活 8. 暴露抗原 : 对于石蜡切片的免疫组化实验时, 必须采用高温加热抗原修复, 这将有助于暴露抗原决定簇, 从而增加免疫组化染色的强度 ( 不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书 ) 对于不同的组织, 不同的抗原, 不同的抗体, 所采用的方法应不一样, 可进行热修复胰酶消化既不修复也不消化胶原还可以用胃蛋白酶消化等 9. 封闭 : 在山羊血清封闭, 非特异性染色仍然较强时, 可延长封闭时间或用浓缩血清封闭 10. 抗体稀释 : 应遵循现用现配的原则, 对于 PBS 稀释的抗体一定要当天使用 11. 背景高 : 在抗体浓度反应时间反应温度等合适的条件下, 如果背景依旧高, 可采用含 1 Tween20 的 PBS 洗, 特别是在显色之前要多洗 12. 返蓝 : 在苏木素复染后, 可用碱性缓冲液 ( 如 PBS) 或 Na2HPO4 的饱和溶液返蓝 13. 显色 : 一定要在显微镜下观察, 注意控制背景 5

6 DAB 法显示过氧化物酶原理过氧化物酶分解 H2O2 的过程中, 下面反应不直接发生 :AH2( 供氢体 )+H2O2 A( 供氢体的氧化物 )+2H2O2 实验可知, 有称为复合物 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 的酶底物 ( 受氢体 ) 复合体生成, 在复合体最后分解为酶和水时, 游离的原子氧使供氢体氧化而显色酶组织化学中所使用的供氢体应是含有色原性基团的发色物质, 如奈酚和联苯胺免疫组化染色步骤 ( 以 ABC 法为例 ) 溶液的配置 : M PBS 2000ml:NaCL 18g, NaH 2 PO 4 2H 2 O 0.8g, Na 2 HPO 4 12H 2 O 12g. 共六份 2. 柠檬酸盐缓冲液 : 贮存液 :0.1M 柠檬酸溶液 (A): 21.01g 柠檬酸 + 1L 蒸馏水 0.1M 柠檬酸三钠溶液 (B): 29.41g 柠檬酸三钠 + 1L 蒸馏水工作液 :9ml A 液 +41ml B 液 +450ml 蒸馏水 0.01M 柠檬酸盐缓冲液 % H 2 O 2 - 甲醇 :30% H 2 O 2 0.4ml + 400ml 纯甲醇充分混匀 4. 20% 甘油 :80ml 纯甘油 + 320ml 蒸馏水 5. 稀释抗体 : , , ( 临用前配 ) 6. 酒精的配置染色步骤 : 一步法 1. 载玻片烤箱中二甲苯 Ⅰ,60 20 ( 水浴箱中 ), 二甲苯 Ⅱ, 室温脱水,100% 95% 85% 75% 酒精, 每级均为 3 4. 蒸馏水冲洗,PBS 5 * 1 5. 微波炉修复抗原 :0.01M 柠檬酸盐缓冲液,99 肺 20, 心肾 PBS 3 * % H 2O 2- 甲醇, 室温 PBS 冲洗,PBS 3 *3, 甩干或纸巾吸去多余液体 ( 勿碰到组织 ),PAP Pen 划境线 9. block solution 封闭抗原, 室温倾出封闭液, 不洗, 滴加一抗 (60ul), 4 过夜或 37 1~2h 11. PBS 冲洗,3 *3 12. 除去 PBS, 滴加 A 增强剂, 室温 PBS 冲洗,3 *3 14. 除去 PBS, 滴加 B 剂, 室温 PBS 冲洗,3 *3 同时配置 DAB 显色剂 16. 除去 PBS,DAB 显色 10 ( 在显微镜下观察染色程度控制染色时间 ) 蒸馏水冲洗 6

7 17. 复染 : 苏目素均匀滴加 2 滴,40, 蒸馏水冲洗,60 温水泡半分钟 18. 脱水 :75% 酒精 85% 95% 100%(3 次 ), 每级透明 : 二甲苯 Ⅰ3, 二甲苯 Ⅱ3 18. 封片 : 中性树脂, 加盖玻片 ( 组织部位切勿残留小气泡 ),60 0.5h 烘干结果 : 棕褐色反应产物代表抗原 X 的定位拍照 1. 更换样品时, 除了调整焦距和视野外, 显微镜上的其他部件都不能动! 所有的样品必须一次拍摄完全特别是在拍摄过程中, 不要一会用高倍镜, 一会用低倍镜, 来回切换物镜 2. 数码相机必须设置为手动曝光, 并且保持每张照片用同样的曝光条件, 同样的曝光时间, 同样的光圈特别要注意的是, 一定要将数码相机的自动白平衡功能给关掉 3. 免疫组化切片一般染色不太深, 因此拍摄出的照片颜色较浅, 就让它浅拍摄出的照片中空白部位应尽可能呈现纯白色测量其灰度应在 250 左右如果呈现淡蓝色, 一般是相机自动白平衡在起作用另外一个因素是显微镜灯光电压不正确要使灯光本身的色温正确既不偏黄, 也不偏蓝 7

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<4D6963726F736F667420576F7264202D20C3E2D2DFD7E9BBAFB5C4B2A1C0EDD6C6C6ACBCBCCAF5B9E6B7B62E646F63> 一 H-E 技术操作规范 1. 及时固定组织 : 免疫组化的病理制片技术的规范应采用 10%~20% 甲醛液 (10% 甲醛液即用浓甲醛液 1 份加蒸馏水 9 份稀释 ) 固定组织, 因甲醛易氧化成甲酸, 因此多会偏酸性, 最理想的是配成中性甲醛液巨大组