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1 国际流行病学传染病学杂志 年 月第 卷第 期! "# $%&''%! 论著 芹菜素纳米乳对肝纤维化的治疗作用 潘旭旺庄让笑黄玮玮方红英王福根邵益丹史婷婷席建军潘红英 杭州 浙江中医药大学附属杭州市西溪医院制剂室 潘旭旺 庄让笑 黄玮玮 方红英 王福根 邵益丹 史婷婷 席建军 杭州 浙江省人民医院感染病科 潘红英 通信作者 潘红英!" $? 6#%%6) 摘要 目的研究芹菜素纳米乳对肝纤维化大鼠的治疗作用 并对其作用机制进行初步研究 方法采用四氯化碳 ((! 复制大鼠肝纤维化模型 ) 只 *$ 大鼠经适应性饲养 周后 随机分为 组 每组 + 只 正常组以,-. 橄榄油皮下注射 模型组以 + / ((! 橄榄油为造模剂 按,-. 皮下注射 治疗组分 组 在皮下注射 + / ((! 橄榄油的同时灌胃给予芹菜素纳米乳 次 - 阳性对照组给予造模剂的同时给予水飞蓟宾 -. 每周造模 次 间隔 连续 0 周 末次给药后 1 取大鼠血清和肝脏 观察芹菜素纳米乳对大鼠血清肝功能指标 &, 和 &* 肝纤维化指标透明质酸 & 层黏连蛋白, 型胶原 ( 型前胶原 ( 和肝组织中丙二醛 $& 羟脯氨酸 超氧化物歧化酶 *$ 谷胱甘肽过氧化物酶 2*3 转化因子 24 金属蛋白酶抑制因子 平滑肌肌动蛋白 *& 达的影响 结果芹菜素纳米乳能显著降低 &,&*, (( 水平 )06 均 7 升高 *$ 和 2*8 活性 降低 含量 5+66)+6 均 7 显著降低 24 和 *& 的达 5006+) 和 )7 结论芹菜素纳米乳对 ((! 致肝纤维化大鼠具有一定的治疗作用 其作用机制可能与抗脂质过氧化反应 影响 24 *& 达有关 关键词 肝硬化 芹菜素纳米乳 转化生长因子 基质金属蛋白酶抑制因子 平滑肌肌动蛋白基金项目 浙江省中医药科技计划项目 9&) 杭州市卫生科技计划 重点 项目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

2 国际流行病学传染病学杂志 年 月第 卷第 期! "# $%&''%! +++ 7!! # '! #% #6 " 23$ -2,4! '# # ",6 + 7+!!< '# 5%% % " 0/4= 0-2/& = +7= 7!! & '!% '#%! '# # "> %% % % #% 6! > "! 5 # '! " 0-= 0/4 2/& 5%% # %% & '!% 0-0/4 2/&!"#?@ 0! % /# 2## 0#! 6 4! 86 ",A ',! 2## 0#! 6? 肝纤维化是各种慢性肝病进展中由于肝内纤维生成与降解失衡 导致过多的胶原在肝内沉积所致 常伴有炎症 并可发展为肝硬化 阻断肝纤维化的发生和发展 对防治肝硬化和慢性肝病具有重要意义 芹菜素是一种分布广泛的天然黄酮类化合物 存在于多种食物和药物中 具有多方面药理活性 主要现在抑制肿瘤 抗氧化 抗菌 预防高血 () 压及动脉硬化等作用 研究明 芹菜素有一定的 () 抗肝纤维化作用 但其作用机制尚不明确 本文以芹菜素纳米乳为研究对象 初步探讨其对肝纤维化大鼠的治疗作用及机制 现报道如下 材料与方法一 材料 主要仪器 &*+ 生化仪 贝克曼库尔特,, 数显恒温水浴锅 国华电器有限公司 $-+& 酶标仪 南京华东电子集团医疗装备有限责任公司./ 病理切片机 上海徕卡仪器有限公司 01, 涡旋混合器 天悦电子 主要试剂四氯化碳! 购自上海凌峰化学试剂有限公司 批号 橄榄油购自国药集团化学试剂有限公司 批号 芹菜素纳米乳自制 批号 + 水飞蓟宾购自天津天士力制药股份有限公司 批号 + &0 和 &20 检测试剂盒购自日本和光 超氧化物歧化酶 23$ 丙二醛 /$& 谷胱甘肽过氧化物酶 -2,45 羟脯氨酸,6 试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品 转化因子 0- 单抗 金属蛋白酶抑制因子 0/4 单抗 平滑肌肌动蛋白 2/& 单抗及 其相应二抗试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司 实验动物 2$ 大鼠 7 只 雄性 清洁级 体重 由浙江省医学科学院提供 大鼠生产许可证 28 浙 大鼠使用许可证号 218 浙 二 实验方法 动物造模及给药 7 只 2$ 大鼠经适应性饲养 周后 随机分为 组 每组 + 只 正常组以 9: 橄榄油皮下注射 模型组以 +;! 橄榄油为造模剂 按 9: 皮下注射 治疗组分为低 中 高剂量组 每组 + 只大鼠 在皮下注射 +;! 橄榄油的同时灌胃分别给予芹菜素纳米乳 ++ 9: 次 9 阳性对照组给予造模剂的同时给予水飞蓟宾 9: 造模剂给药每周 次 间隔 连续 周 每周称重 次 根据体重调节给药量 样本采集大鼠于末次给予芹菜素纳米乳及水飞蓟宾 后 用 ; 戊巴比妥钠 9 腹腔注射麻醉 腹腔静脉取血 离心留取血清 分离肝组织 一部分 冻存备用 剩余部分用 ; 福尔马林固定 行免疫组化检测 指标检测采用全自动生化分析仪 按试剂盒说明书对 &0&20 等指标进行测定 血清肝纤维化指标,& 和 送艾迪康医学检验中心检测 肝组织氧化和抗氧化指标检测 准确称取组织重量 按重量 体积 7 的比例加入 7 倍的生理盐水 冰水浴条件下制成 ; 的组织匀浆 + 9

3 国际流行病学传染病学杂志 年 月第 卷第 期! "# $%&''%! 离心半径 1 # 离心 取上清液测定肝织匀浆中 5$&.6 含量和 -7$8-./9 活性 免疫组化检测制备肝组织切片 按试剂盒说明书进行免疫组化染色并检测,8:,5/-5& 在肝脏中的达 三 统计学分析所有数据均以 形式示 采用单因素方差分析处理 采用 -/-- 统计软件中 7;6 &7& 进行处理 组间两两比较用 *-$ 检验 结果一 芹菜素纳米乳对肝功能的影响各组间 &*,&-, 差异均有统计学意义 4 1 均 2 与正常组比较 模型组大鼠血清中 &*,&-, 水平显著升高 均 2 芹菜素纳米乳低 中 高剂量组 &*, 均低于模型组 2 和 21 低 中剂量组 &-, 也低于模型组 2 和 21 高剂量组 &-, 高于中剂量组 2 见 二 芹菜素纳米乳对肝纤维化损伤的影响各组间除.& 外 4131* /0 0 差异均有统计学意义 模型组 * /00 含量较正常组均显著升高 221 芹菜素纳米乳低 中 高剂量组 */0 和 0 含量均较模型组低 2 芹菜素纳米乳 个剂量组间上述指标比较 差异无统计学意义 31 见 三 芹菜素纳米乳对肝纤维化大鼠肝脏组织 5$& 含量和 -7$ 活性的影响各组间 -7$ 差异有统计学意义 412 5$& 差异无统计学意义 431 模型组肝脏 -7$ 活性较正常组降低 但差异无统计学意义 31 阳性对照组 -7$ 活性高于模型组 2 芹菜素纳米乳各剂量组均能够升高肝脏组织 -7$ 活性 但差异无统计学意义 31 阳性对照组及芹菜素纳米乳各剂量组均能降低肝组织 5$& 含量 但差异无统计学意义 31 芹菜素纳米乳各剂量组 -7$ 活性均显著低于阳性对照组 2 详见 四 芹菜素纳米乳对肝纤维化大鼠肝组织.6 含量和 8-./9 活性的影响各组间.6 含量 8-./9 活性差异有统计学意义 412 与正常组比较 模型组大鼠肝组织中.6 含量显著升高 8-./9 活力显著降低 均 2 与模型组比较 芹菜素纳米乳 个剂量组.6 含量均显著降低 8-./9 活性均显著升高 221 与阳性对照组比较 芹菜素纳米乳中 高剂量组.6 含量均显著降低 8-./9 活性均显著升高 221 芹菜素纳米乳中剂量组 8-./9 活性高于低剂量组和高剂量组 均 2 详见 芹菜素纳米乳对 00! 致肝纤维化大鼠血清肝功能及肝纤维化指标的影响 41 组别 肝功能指标 ()* 肝纤维化指标 +* &*, &-,.& * /0 0 正常组 模型组 阳性对照组 11 # 11 1 # # 1 # 低剂量组 # 1 1 # # 111 # 中剂量组 # # 1 1 # # 1 # 高剂量组 # # 1 # # 值 值 注 00! 四氯化碳 正常组 以 *+ 橄榄油皮下注射 模型组 以 100! 橄榄油为造模剂 *) 皮下注射 阳性对照组 给予造模剂的同时给予水飞蓟宾 ) 低中高剂量组皮下注射 100! 橄榄油的同时灌胃给予芹菜素纳米乳 给药剂量分别为 11 ) 次 )&*, 丙氨酸转氨酶 &-, 天冬氨酸转氨酶.& 透明质酸 * 层黏连蛋白 /0 型前胶原 0 型胶原 与正常组比较 1 与模型组比较 # 1 与中剂量比较

4 国际流行病学传染病学杂志 年 月第 卷第 期! "# $%&''%! 五 芹菜素纳米乳对 ()*(+, 和 -+& 达的影响各组间 (+,()* 和 -+& 差异均有统计学意义.//01 与正常组相比 模型组 ()*(+, 和 -+& 达增加 均 芹菜素纳米乳各剂量组 (+, ()* 和 -+& 达与模型组比较均降低 除低剂量组 ()* 外 差异均有统计学意义 1 与阳性对照组比较 芹菜素纳米乳低剂量组 (+,()*-+& 以及中剂量组的 -+& 达较高 均 高剂量组 (+,()* -+& 的达较低 或 1 高剂量组 (+,()* 和 -+& 低于中剂量组 详见 但芹菜素不溶于水 亲水性和亲脂性均较差 难以被消化道黏膜吸收 口服吸收差 生物利用度较低 大大限制了它的临床应用 本文将其制备成芹菜素纳米乳 大大增加了其溶解性 提高了生物利用度 本研究结果明 芹菜素纳米乳各剂量组可明显降低肝组织 2 水平 增强 -3$)-,4 活性 提示芹菜素纳米乳具有抑制脂质过氧化反应 修复肝细胞损伤 从而恢复肝脏结构和功能的作用 水飞蓟宾具有抗氧化自由基的药理学功效 其 保肝作用明显 常作为保肝药物筛选的阳性药物 本研究将水飞蓟宾作为阳性药物 研究芹菜素纳米乳各剂量组是否具有类似的作用 结果明 芹菜素纳米乳对肝功能指标 &6(&-( 和肝纤维化 项指标 &6,77 的影响各剂量组差异无 讨 论 统计学意义 作用类似 与阳性对照组比较 芹菜素纳米乳中 高剂量组 2 含量均显著降低 )-,4 有研究显示芹菜素有一定的抗肝纤维化作用 活性均显著升高 芹菜素纳米乳高剂量组 (+, 芹菜素纳米乳对 77! 造模肝纤维化大鼠肝组织氧化和抗氧化指标的影响.1 组别 肝组织氧化和抗氧化指标 -3$89 +$&!9 29 )-,489 正常组 00/ 0/1 0 /11 模型组 011 0/ 0 : : 阳性对照组 1/ :; 1 ; /// : 低剂量组 0/ 01 / ; :# 中剂量组 /10 /0 :; 10 :; 高剂量组 :; //1 :; 值 10 / 0 10 值 1 注 77! 四氯化碳 正常组 以 69 橄榄油皮下注射 模型组 以 177! 橄榄油为造模剂 69 皮下注射 阳性对照组 给予造模剂的同时给予水飞蓟宾 9 低中高剂量组皮下注射 177! 橄榄油的同时灌胃给予芹菜素纳米乳 给药剂量分别为 11 9 次 9-3$ 超氧化物歧化酶 +$& 丙二醛 2 羟脯氨酸 )-,4 谷胱甘肽过氧化物酶 与正常组比较 : ; 1 与模型组比较 # 1 与中剂量比较 芹菜素纳米乳对 77! 造模肝纤维化大鼠免疫组化指标的影响.1 组别 (+, ()* -+& 正常组 / / 010 模型组 1 : : 0 : 阳性对照组 0/ # :# / :# 低剂量组 11 / : 0 :# 中剂量组 0 # 1 :# 0 :# 高剂量组 /0 # 1 ;# / # 值 // 01 值 注 77! 四氯化碳 正常组 以 69 橄榄油皮下注射 模型组 以 177! 橄榄油为造模剂 69 皮下注射 阳性对照组 给予造模剂的同时给予水飞蓟宾 9 低中高剂量组皮下注射 177! 橄榄油的同时灌胃给予芹菜素纳米乳 给药剂量分别为 11 9 次 9(+, 金属蛋白酶抑制因子 ()* 转化生长因子 -+& 平滑肌肌动蛋白 与正常组比较 : ; 1 与模型组比较 # 1 与中剂量比较

5 国际流行病学传染病学杂志 年 月第 卷第 期! "# $%&''%!. ()*+,& 的达较低 作用均明显优于水飞蓟宾 由此可以看出 芹菜素纳米乳与水飞蓟宾有类似作用 某些方面可能优于水飞蓟宾 ()* 为公认的致肝纤维化最主要的细胞因 -./ 子之一 其达水平与肝纤维化严重程度呈显著正相关 ()* 通过旁分泌与自分泌 种方式 与细胞膜上的受体结合 启动与维持肝星形细胞的活化 调节细胞增殖 产生细胞外基质 0, 增生沉积 同时 ()* 还可抑制基质金属蛋白酶,,1% 合成 从而使 0, 降解减少 0, 的降解在肝内主要依赖,,1% 在肝纤维化的发生 发展过程中 (,1 基因达逐渐增强 到肝硬化阶段达到高峰 而 (,1 可通过抑制,,1% 活性 减少 0, -/ 的降解而致肝纤维化 肝硬化的发生 因此 肝纤维化的发生 发展与 ()* 及 (,1 的达上调密切相关 本文结果明 芹菜素纳米乳各剂量组肝组织 ()* 和 (,1 达较模型组明显减少 且呈剂量依赖性 剂量越高 作用越明显 提示芹菜素纳米乳抗肝纤维化的作用机制可能是抑制 ()* 的自分泌和旁分泌达及促进活化肝星形细胞的凋亡 同时抑制 (,1 的达 +,& 主要存在于平滑肌细胞中 大鼠在肝星形细胞活化过程中达 +,& 因此 +,& 可作为肝星形细胞激活的标志 本组 +,& 在 00! 诱导的肝纤维化模型组中的达显著增多 而芹菜素纳米乳各剂量组 +,& 达明显低于模型组 同样呈剂量依赖性 说明芹菜素纳米乳可抑制肝星形细胞向肌成纤维细胞转化从而发挥抗纤维化作用 综上所述 芹菜素纳米乳对 00! 所致肝纤维化大鼠有较好的治疗作用 其作用机制可能与降低或清除氧自由基 抑制肝脏脂质过氧化过程和抑制 ()*(,1 和 +,& 达 减少 0, 合成 促进 0, 降解有关 肝纤维化的发生发展机制复杂 本实验只作了初步的探讨 今后将进一步从相关信 号通路方面作进一步研究 参考文献 -/ 孙斌 瞿伟菁 张晓玲 芹菜素的药理作用研究进展 -/ 中药材.. $ %%. +' 2 3' :%7#6 1 %% " 7 677#! #7! 7# -/ '7! " 06%,#7!,77!%.. $ ;%%. -/ 张硕 袁希平 洪波 等 芹菜素对血吸虫病小鼠肝纤维化的影响 -/ 营养学报 ' ! ""# " 7 67# " %% '# #7 7#6! #-/ &#7 ' 7 +#7.. -/ 张硕 洪波 王庆林 等 种黄酮类化合物对 00! 致小鼠肝纤维化的防治作用 -/ 华西药学杂志 $.;#<=#% ! 6 ""#% " " ' "!7> % 00! '#!> " %% # -/ 4% 067 '7! " 1677#'#7! +##% $.;#<=#% -/ 黄欣 龚益飞 王毅 等 代谢组学方法研究水飞蓟宾对四氯化碳致小鼠肝损伤的保护作用 -/ 高等学校化学学报 $ ;%%. '7 8) * 47 7!,7 # %' " 67? #> ""# " %! " 6 #7 7#6! '#!> ' #-/ 06#7! '7! " $ ;%%. -./ 党双锁 李亚萍 ()* 在肝纤维化研究中的新进展 -/ 世界华人消化杂志 $;%% $ &>7#% '%7 6! " 7%" =6 "7# 6 76 %% "!> " %%-/ 4! 06% '7! " $%! $ ;%% -/ 年国侠 黄正明 杨新波 等 水芹总酚酸抗四氯化碳所致肝纤维化作用的实验研究 -/ 解放军药学学报 $ ;%% 7 )8 '7 5, !""# " 7! 6!#% 7# " 76 7>7#7 67# " %% 7%-/ &$ ;%% 收稿日期.

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