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1 22 217, Vol.38, No.22 食品科学生物工程基于两阶段氨基酸添加的谷胱甘肽发酵高产方法王大慧, 聂敏, 卫功元 * ( 苏州大学基础医学与生物科学学院, 江苏苏州 2153) 摘要 : 为提高产朊假丝酵母 (Candida utilis SZU 7-1) 发酵生产谷胱甘肽 (glutathione,gsh) 的产量, 分别考察 L- 蛋氨酸和 L- 半胱氨酸在 GSH 分批发酵和流加发酵中的作用, 结果发现 L- 蛋氨酸提升了酵母细胞在生长期的 GSH 合成能力, 而 L- 半胱氨酸显著提高了细胞生长结束后的 GSH 产量在此基础上, 提出了两阶段氨基酸添加策略, 即在分批发酵初始时 ( h) 添加 mmol/l L- 蛋氨酸, 在流加发酵过程中细胞干质量达到最大值时 ( 第小时 ) 一次性添加 3 mmol/l L- 半胱氨酸最终,GSH 产量和胞内 GSH 含量进一步提高, 分别达到 mg/l 和.1 mg/g 该两阶段氨基酸添加策略在 GSH 发酵高产中的成功应用, 对其他类似化合物的高效生产具有一定的借鉴意义关键词 : 产朊假丝酵母 ; 谷胱甘肽 ;L- 蛋氨酸 ;L- 半胱氨酸 ; 流加发酵 Improved Glutathione Production in Candida utilis by Two-Stage Amino Acid Addition WANG Dahui, NIE Min, WEI Gongyuan* (School of Biology and Basic Medical Sciences, Soochow University, Suzhou 2153, China) Abstract: In order to improve glutathione production by Candida utilis SZU 7-1, the effects of addition of L-methionine and L-cysteine on glutathione biosynthesis during batch and fed-batch fermentation, respectively, were investigated. The results indicated that addition of L-methionine improved the glutathione biosynthesis ability of yeast during cell growth phase while addition of L-cysteine significantly enhanced the production of glutathione after cell growth. Based on this finding, a two-stage strategy for amino acid addition was proposed for high glutathione production, that is, mmol/l of L-methionine was added into the medium at the beginning of fermentation ( h), and 3 mmol/l of L-cysteine was then added when the biomass achieved the maximum level ( h) during fed-batch culture. The two-stage strategy ultimately resulted in further improvements in glutathione production and intracellular glutathione content, which were mg/l and.1 mg/g at 48 h, respectively. The successful application of the two-stage amino acid addition strategy for improved glutathione production also provides a feasible approach for the efficient production of other similar compounds. Key words: Candida utilis; glutathione; L-methionine; L-cysteine; fed-batch fermentation DOI:1.75/spkx 中图分类号 :Q815 文献标志码 :A 文章编号 :-3(217) 引文格式 : 王大慧, 聂敏, 卫功元. 基于两阶段氨基酸添加的谷胱甘肽发酵高产方法 [J]. 食品科学, 217, 38(22): 22-. DOI:1.75/spkx WANG Dahui, NIE Min, WEI Gongyuan. Improved glutathione production in Candida utilis by two-stage amino acid addition[j]. Food Science, 217, 38(22): 22-. (in Chinese with English abstract) DOI:1.75/spkx 谷胱甘肽 (glutathione,gsh) 是由 L- 谷氨酸 L- 半谢起着强有力的保护作用 [4] 在 2 世纪 5 年代, 日本就开胱氨酸和甘氨酸在 ATP 的存在下, 经 γ- 谷氨酰半胱氨酸合始将 GSH 作为生物活性添加剂并积极开发应用在保健食成酶和谷胱甘肽合成酶催化得到的一种三肽化合物 [1-3] 品的生产中 [5] 在食品加工领域, 由于 GSH 在强化食品风 GSH 具有消除自由基和抗氧化作用, 因此对机体正常代味的同时对人体有保健作用, 因此被称为抗衰老因子和收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金面上项目 ( ); 国家自然科学基金青年科学基金项目 (2151); 苏州市农业应用基础研究项目 (SNG21) 作者简介 : 王大慧 (1975 ), 女, 副教授, 博士, 研究方向为食品微生物与生物技术 wangdh@suda.edu.cn * 通信作者 : 卫功元 (1975 ), 男, 教授, 博士, 研究方向为发酵工程 weigy@suda.edu.cn

2 生物工程食品科学 217, Vol.38, No 长寿因子, 它的应用前景要明显优于其他类型的防腐剂或抗氧化剂 [] 微生物发酵法被认为是 GSH 生物合成最有效的方法之一 [5] 一直以来, 研究者们采用菌种遗传改造发酵条件优化以及前体物质添加等方法来提高 GSH 的产量和合成效率 [2], 但仍然存在许多技术瓶颈, 以至于 GSH 的国产化还没能完全实现在 GSH 生物合成过程中,L- 半胱氨酸的水平是能否实现 GSH 高效合成的关键因素, 因此添加 L- 半胱氨酸可以显著提高 GSH 的发酵产量 [-8] 然而, 当 L- 半胱氨酸超过一定浓度时将抑制细胞的生长, 所以在发酵过程中 L- 半胱氨酸主要在细胞生长结束时添加或者采用流加方式 [9-1] 此外, 在胞内腺苷甲硫氨酸合成酶的催化下,L- 蛋氨酸能与 ATP 反应生成 S- 腺苷甲硫氨酸, 它是大多数酵母细胞内唯一的甲基供体而细胞在生长旺盛时甲基化反应非常频繁, 因此在培养基中添加 L- 蛋氨酸可以促进这一过程的发生 [11-] 与此同时,L- 蛋氨酸在代谢过程中生成的 S- 腺苷同型半胱氨酸会经过多步反应形成 L- 半胱氨酸, 最终可能有利于 GSH 的合成 [13] GSH 是胞内产物, 通常从提高细胞密度和或胞内 GSH 含量两个方面入手来提高 GSH 的发酵产量 [14-15] 在前期针对产朊假丝酵母 (Candida utilis SZU 7-1) 高密度培养的研究中, 发现采用多项式流加策略可以获得较高的细胞密度, 但是胞内 GSH 含量却并没有明显提高 [1] 因此, 有必要采取有效措施实现细胞高密度和 GSH 高产的统一本研究在前期工作的基础上, 分别考察 L- 蛋氨酸和 L- 半胱氨酸在酵母细胞生长过程中以及生长结束后对 GSH 生物合成的作用, 结合高密度培养技术, 提出基于两阶段氨基酸添加的 GSH 发酵方法, 最终实现 GSH 的高产发酵, 为实现 GSH 产业化生产提供了理论依据 1 材料与方法 1.1 菌株与培养基 C. utilis SZU 7-1 由苏州大学微生物生理与代谢调控研究室保藏斜面培养基 : 葡萄糖 2 g/l, 酵母膏 1 g/l, 蛋白胨 1 g/l, 琼脂 2 g/l,ph. 种子培养基 : 葡萄糖 2 g/l, 酵母膏 1 g/l, 蛋白胨 1 g/l,ph. 发酵培养基 : 葡萄糖 3 g/l,kh 2 PO 4 3 g/l, MgSO 4.25 g/l,mnso 4.1 g/l,feso 4.1 g/l, CuSO 4.1 g/l,znso 4.3 g/l,ph 5.5 L- 蛋氨酸和 L- 半胱氨酸浓度和添加时间根据实验要求确定流加培养基 : 葡萄糖 g/l,(nh 4 ) 2 SO 4 8 g/l, KH 2 PO 4 3 g/l,mgso g/l 葡萄糖单独灭菌后再与其他成分混合 1.2 仪器与设备 SW-CJ-2A 超净工作台吴江市龙宏净化设备有限公司 ;LDZX-5KBS 高压蒸气灭菌锅上海申安医疗器械厂 ;HZ-21K 恒温摇瓶柜太仓市华利达实验仪器设备公司 ;BIOTECH-5BGZ 搅拌式发酵罐上海保兴生物设备工程有限公司 ;LD4-2A 离心机北京医用离心机厂 1.3 方法种子培养将斜面保藏菌种活化 4 h 后接入种子培养基中, 3 2 r/min 摇床培养 2 h 摇瓶培养按照体积分数 1% 的接种量将种子接入到装有 5 ml 发酵培养基的 5 ml 三角瓶中, 于 3 2 r/min 条件下摇床培养 3 h 分批培养全自动 5 L 搅拌式发酵罐中装 3 L 发酵培养基, 将培养好的种子按照 1% 的接种量接入发酵罐中在温度 3, 通气量 3. L/min, 搅拌转速 3 r/min 条件下培养时间 3 h ph 值采用梅特勒电极在位监测, 并通过自动流加 3 mol/l H 2 SO 4 或 3 mol/l NaOH 溶液进行调节以维持 ph 值在 5.5±.2 以内高密度培养在总糖质量浓度为 15 g/l 的前提下, 以多项式流加方式实现细胞高密度培养, 具体方法见文献 [1] 在培养的第小时向体系中加入 L- 半胱氨酸, 之后温度和 ph 值保持不变, 前 3 h 内溶氧控制在 5%, 随后的 h 溶氧控制在 2%, 之后溶氧不控制 [17] 酵母生物量的测定以细胞干质量表示酵母生物量取 25 ml 发酵液, 3 5 r/min 离心 1 min, 用蒸馏水将离心后的沉淀洗涤 3 次, 收集菌体后于 7 烘干至质量恒定, 计算出细胞干质量 1.3. 指标测定葡萄糖的测定采用 3,5- 二硝基水杨酸法 [] ;GSH 的测定采用 5,5 - 二硫代双 (2- 硝基苯甲酸 )- 谷胱甘肽还原酶循环法 [19] 指标计算胞内 GSH 含量的计算胞内 GSH 含量定义为单位质量干细胞在胞内合成 GSH 产量, 计算如下式所示 : GSH / mg/g GSH / mg/l / g/l 动力学参数的计算细胞得率 GSH 得率细胞生产强度 GSH 生产强度的计算方法同文献 [19-2]

3 217, Vol.38, No.22 数据统计分析所有摇瓶实验数据均为3 组独立实验样品的平均值所有分批发酵实验数据均为3 次检测结果的平均值 Excel 21软件作图 2 结果与分析 L-蛋氨酸对酵母细胞生长和GSH合成的影响图1 Fig. 1 㒚㚲ᑆ䋼䞣 GSHѻ䞣 2 㚲 ݙ GSH 䞣 L-㲟䝌 ᑺ/ mmol/l GSHѻ䞣/ mg/l 㒚㚲ᑆ䋼䞣/ g/l 㚲 ݙ GSH 䞣/ mg/g 2.1 㪑㨴䍘䟿 ᓖ/ g/l 生物工程 3 㜎 GSHਜ਼䟿/ mg/g 1.4 食品科学图2 Fig. 2 3 添加L-蛋氨酸对GSH分批发酵过程的影响 Effect of L-methionine addition on glutathione production during batch fermentation 不同L-蛋氨酸添加浓度条件下的细胞生长和GSH合成情况 Cell growth and GSH production at different concentrations of L-methionine in ﬂask culture 在分批培养的 h 向发酵培养基中添加 mmol/l L-蛋氨酸考察L-蛋氨酸在GSH分批发酵中的作用结首先在摇瓶培养的 h 向发酵培养基中添加L-蛋果如图2所示与对照不添加L-蛋氨酸相比 L-蛋氨酸考察其对C. utilis SZU 7-1细胞生长和GSH合成氨酸的添加对酵母细胞生长几乎没有影响细胞干质量的的影响图1 结果发现在考察的浓度范围内添加 L-蛋氨酸虽然对酵母细胞生长的影响不大但明显促进变化趋势也基本一致然而在L-蛋氨酸添加的条件下葡萄糖的消耗速率却有所下降但也能在第15小时时基本耗完对于GSH的合成来说自第3小时开始 GSH的了GSH的生物合成因此GSH产量和胞内GSH含量均有显合成速率比对照明显提高 GSH产量和胞内GSH含量在著提升当添加L-蛋氨酸浓度为 mmol/l时胞内GSH 第小时达到最大值2.2 mg/l和21.5 mg/g 比对照分别含量和GSH产量均达到最大值1.9 mg/g和5. mg/l 提高了.4%和4.4% 以上结果表明作为含硫氨基酸 L-蛋氨酸在分批发酵过程中的添加同样可以促进GSH的生比对照不添加L-蛋氨酸分别提高了.7%和43.2% 由此可见 L-蛋氨酸在参与胞内含硫化合物代谢的同时明显有助于酵母细胞内GSH合成能力的提高㓶㜎ᒢ䍘䟿/ g/l L-蛋氨酸在GSH分批发酵中的作用 L-半胱氨酸是GSH生物合成的前体氨基酸之一向培养基中添加L-半胱氨酸可以提高GSH产量和胞内GSH 1 含量[9-1] 然而 L-半胱氨酸在一定程度上会抑制细胞的生长因此通常选择在细胞生长结束时添加L-半胱氨酸 8 为佳 [14] 前期研究表明采用多项式流加方法可以很好地实现C. utilis SZU 7-1细胞高密度培养酵母细胞快 4 速生长细胞干质量在 h达到最大值[1] 为此本研究 3 㓶㜎ᒢ䍘䟿/ g/l 2 1 在多项式流加培养的基础上考察L-半胱氨酸在高密度培养条件下对GSH生物合成的影响 3 GSHӗ䟿/ mg/l 2.2 物合成与积累 2.3 高密度培养条件下添加L-半胱氨酸的作用 3 8. mmol/l 22.5 mmol/l 37.5 mmol/l mmol/l 3. mmol/l

4 㜎 GSHਜ਼䟿/ mg/g Fig. 3 㪑㨴䍘䟿 ᓖ/ g/l mmol/l 22.5 mmol/l 37.5 mmol/l 㪑㨴䍘䟿 ᓖ 2 㓶㜎ᒢ䍘䟿 mmol/l 3. mmol/l GSHӗ䟿/ mg/l GSHӗ䟿/ mg/l 9 3 图4 添加L-半胱氨酸对高密度培养条件下GSH合成的影响和.5±.1 mg/g 添加L-半胱氨酸后酵母细胞干质量逐渐下降且L-半胱氨酸浓度越高其对细胞干质量的不利影响越大然而 GSH在添加L-半胱氨酸之后快速合成其产量及胞内GSH含量均在第48小时达到最大值其中当L-半胱氨酸添加浓度为3 mmol/l时 GSH 产量与胞内GSH含量分别为 mg/l和21. mg/g 比对照分别提高了59.7%和85.4% 由此可见 L-半胱氨酸在细胞生长结束后可以明显地促进GSH的生物合成特别地在提高胞内GSH含量上的作用非常显著 2.4 两阶段氨基酸添加策略的提出及在GSH高产中的应用以上实验结果表明在细胞生长阶段添加L-蛋氨酸或在细胞生长停止之后添加L-半胱氨酸均有利于GSH产量和胞内GSH含量的提高因此本研究提出了两阶段氨基酸添加的策略即在高密度培养的起始 h 添加 mmol/l L-蛋氨酸然后在细胞干质量达到最大值时第小时一次性添加3 mmol/l L-半胱氨酸考察该策略对C. utilis SZU 7-1生物合成GSH的影响结果见图4 由图4可以看出 L-蛋氨酸的添加并没有影响高密度培养过程中细胞的生长在第小时细胞干质量达到最大值7.44 g/l 同时胞内GSH含量为7.5 mg/g GSH产量为5.8 mg/l 比图3中不添加L-蛋氨酸时的结果分别增加了.1%和21.% 这表明L-蛋氨酸在高密度培养过程中对于维持胞内GSH含量起到了一定的积极作用联合添加L-半胱氨酸和L-蛋氨酸时的GSH高密度发酵过程 the addition of L-cysteine at h and L-methionine at h high cell density culture 在总葡萄糖质量浓度为15 g/l前提下实现酵母细胞的高密度培养在第小时一次性向发酵培养基中添加不同浓度的L-半胱氨酸 GSH合成与细胞干质量随培养时间的变化情况见图3 不同批次高密度培养结果具有很好的一致性第小时的细胞干质量 GSH产量和胞内 GSH含量分别为 7.±.75 g/l 435.4±5.4 mg/l 3 9 High-cell-density culture of C. utilis for GSH production with Fig. 4 Effect of L-cysteine addition on glutathione production under 4 GSHӗ䟿㜎 GSHਜ਼䟿 1 2 㜎 GSHਜ਼䟿/ mg/g 图3 15. mmol/l 3. mmol/l 㓶㜎ᒢ䍘䟿/ g/l. mmol/l 22.5 mmol/l 37.5 mmol/l , Vol.38, No 食品科学生物工程在两阶段氨基酸添加策略下进行GSH高密度发酵 GSH产量和胞内GSH含量比L-半胱氨酸单独添加时的结果有了进一步提高在第48小时二者分别达到1 7.1 mg/l 和.1 mg/g 高密度发酵模式下采取不同氨基酸添加方式的发酵过程参数如表1所示经过比较分析可以看出两阶段氨基酸添加策略不但有利于提高胞内GSH 含量与GSH产量而且显著地提高了GSH生产强度因此基于两阶段氨基酸添加的GSH发酵高产方法是可行的也具有一定的实际应用价值表1 氨基酸不同添加方式下的GSH高密度发酵过程主要参数比较 Table 1 Comparison of parameters involved in GSH production by high cell density cultivation under different amino acid addition modes 参数 L-半胱氨酸浓度/ mmol/l a 两阶段氨基酸添加b 细胞干质量/ g/l GSH产量/ mg/l 胞内GSH含量/ mg/g 细胞得率/% GSH得率/ 细胞生产强度/ g/ L h 2.48 GSH生产强度/ mg/ L h 注 a. L-半胱氨酸添加时间发酵第小时 b. h添加 mmol/l L-蛋氨酸发酵第小时添加3 mmol/l L-半胱氨酸 3 讨论 GSH分子中既含有氨基和羧基又含有巯基和γ-谷氨酰基正是这种化学结构上的特殊性使GSH在医药和食品等行业中具有广泛的应用前景[1] 为此研究者们利用基因工程手段构建了一系列GSH高产菌株[21-22] 并围绕GSH生物合成酶[23-] 代谢调控[25-2]和胞外分泌[]等展开了深入研究尽管如此针对GSH发酵过程进行优化

5 2 217, Vol.38, No.22 食品科学生物工程仍然一直是提高 GSH 生产效率的有效方法 [3] 本研究利用 C. utilis SZU 7-1 发酵生产 GSH, 分别从前体氨基酸添加和高密度培养等角度探索提高 GSH 产量的措施研究表明, 作为 GSH 前体氨基酸之一的 L- 半胱氨酸, 当在酵母细胞培养的合适阶段适量添加, 可以明显地提高 GSH 产量 [1,14] 由于 L- 半胱氨酸对细胞生长的抑制作用,GSH 的过量合成都是在细胞量不变或略微下降的基础上发生的因此, 添加 L- 半胱氨酸可以显著提高胞内 GSH 含量, 即提升了酵母细胞合成 GSH 的能力另外一种含硫氨基酸 L- 蛋氨酸, 它在代谢过程中是 L- 半胱氨酸生物合成的前体物质 [13], 所以 L- 蛋氨酸的添加将有利于在细胞生长期提高胞内用于 GSH 合成的 L- 半胱氨酸的供给, 进而有效地提高 GSH 产量值得注意的是,L- 蛋氨酸的适量添加, 可以在不影响细胞生长的前提下促进细胞在生长过程中合成 GSH( 图 2) 因此, 采用两阶段氨基酸添加策略, 可以同时促进生长期和稳定期的细胞过量合成 GSH, 最终提高整个发酵过程中的 GSH 合成总量 ( 图 4) GSH 属于胞内产物, 在发酵生产时提高酵母细胞合成 GSH 的能力对于提高 GSH 产量非常有效 [2] 与此同时, 采用合适的培养方法提高细胞密度也有助于 GSH 的高效合成用于 GSH 生产菌株高密度培养的方法有很多, 包括恒速流加指数流加底物浓度反馈控制流加等 [8,1,14], 这些方法均取得了一定的成效为解决底物葡萄糖的流加速率和浓度不断提高与细胞消耗 [1] 葡萄糖速率之间的平衡, 将多项式流加策略应用于 C. utilis SZU 7-1 的高密度培养中,GSH 产量与分批发酵比较有了很大提高 ( 图 3) 由于 C. utilis SZU 7-1 在流加发酵过程中不产生或只产生少量的乙醇, 因此, 细胞和 GSH 对底物的得率要高于酿酒酵母的结果 [14] 多项式流加策略在酵母细胞高密度培养中的成功应用, 为 GSH 高产提供了理论支持表 2 近 2 年国内外流加发酵法生产 GSH 主要参数比较 Table 2 Comparison of main parameters for GSH production by fed-batch fermentation in recent 2 years 菌株前体物质 GSH 产量 / 胞内 GSH GSH 生产强度 / 参考 (mg/l) 含量 /(mg/g)(mg/(l h)) 文献 E. coli WSH-KE1 谷氨酸半胱氨酸甘氨酸 ATP [28] E. coli BL21(pUC-gshF) 谷氨酸半胱氨酸甘氨酸葡萄糖 [29] C. utilis WSH 2-8 葡萄糖 [32] C. utilis WSH 2-8 谷氨酸半胱氨酸甘氨酸 ATP [33] H. polymorpha DL-1 葡萄糖甲醇 [3] P. pastoris D 谷氨酸半胱氨酸甘氨酸葡萄糖 [31] S. cerevisiae 2-2 半胱氨酸甘氨酸葡萄糖 [34] S. cerevisiae Sa-734 半胱氨酸葡萄糖 [9] S. cerevisiae T5 谷氨酸丝氨酸甘氨酸葡萄糖 [7] S. cerevisiae T5 谷氨酸半胱氨酸甘氨酸葡萄糖 [35] S. cerevisiae T5 谷氨酸半胱氨酸甘氨酸葡萄糖 [] C. utilis SZU 7-1 蛋氨酸半胱氨酸葡萄糖本研究注 :. 数据未给出为进一步提高微生物合成 GSH 的能力和效率, 研究者们纷纷构建了许多基因工程菌株, 在高密度培养的基础上, 采用生物转化方法实现 GSH 的过量合成 [28-31] 近 2 年来, 国内外采用流加发酵法生产 GSH 的主要文献列于表 2 可以看出, 与其他传统发酵法特别是与生物转化法相比, 本研究中的 GSH 产量还有不小的差距但是, 采用两阶段氨基酸添加策略, 酵母胞内 GSH 含量相对较高若综合考虑所采用的流加发酵方法和原料成本等因素, 本研究的结果仍然具有一定的竞争力综上, 本研究在分别考察了 L- 蛋氨酸和 L- 半胱氨酸在 GSH 分批发酵和高密度发酵中的作用的基础上, 以 GSH 高产为目标, 提出了两阶段氨基酸添加策略, 即在分批培养初始 ( h) 时添加 mmol/l L- 蛋氨酸, 然后在高密度培养过程中当细胞干质量达到最大值 ( 第小时 ) 时一次性添加 3 mmol/l L- 半胱氨酸将该两阶段策略应用到 GSH 的高密度发酵中,GSH 产量最高为 mg/l, 胞内 GSH 含量和 GSH 生产强度也显著提升本研究结果为 GSH 的高效生产提供了一种方法, 同时也对其他类似化合物的高产发酵具有一定的借鉴意义参考文献 : [1] MEISTR A, ANDERSON M E. Glutathione[J]. Annual Review of Biochemistry, 1983, 52: DOI:1.114/annurev. bi [2] LI Y, WEI G Y, CHEN J. Glutathione: a review on biotechnological production[j]. Applied Microbiology and Biotechnology,, : DOI:1.17/s y. [3] 王玮玮, 唐亮, 周文龙, 等. 谷胱甘肽生物合成及代谢相关酶的研究进展 [J]. 中国生物工程杂志, 214, 34(7): DOI: / j.cb [4] SEO Y J, LEE J W, LEE E H, et al. Role of glutathione in the adaptive tolerance to H 2 O 2 [J]. Free Radical Biology and Medicine,, 37: DOI:1.11/j.freeradbiomed..7.. [5] 陈坚, 卫功元, 李寅, 等. 微生物发酵法生产谷胱甘肽 [J]. 无锡轻工大学学报,, 23(5): DOI:19-38X() [] SEN C K. Nutritional biochemistry of cellular glutathione[j]. The Journal of Nutritional Biochemistry, 1997, 8: -72. DOI:1.11/ S (97) [7] WEN S H, ZHANG T, TAN T W. Utilization of amino acids to enhance glutathione production in Saccharomyces cerevisiae[j]. Enzyme and Microbial Technology,, 35: DOI:1.11/ j.enzmictec [8] WANG Z, TAN T W, SONG J. Effect of amino acids addition and feedback control strategies on the high-cell-density cultivation of Saccharomyces cerevisiae for glutathione production[j]. Process Biochemistry,, 42: DOI:1.11/j.procbio [9] LORENZ E, SCHMACHT M, STAHL U, et al. Enhanced incorporation yield of cysteine for glutathione overproduction by fed-batch fermentation of Saccharomyces cerevisiae[j]. Journal of Biotechnology, 215, 21: DOI:1.11/ j.jbiotec [1] ALFAFARA C G, MIURA K, SHIMIZU H, et al. Cysteine addition strategy for maximum glutathione production in fed-batch

6 生物工程食品科学 217, Vol.38, No.22 culture of Saccharomyces cerevisiae[j]. Applied Microbiology and Biotechnology, 1992, 37: DOI:1.17/BF1781. [11] LU S C. S-adenosylmethionine[J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2, 32: DOI:1.11/ S (99) [] 聂敏. 发酵法生产谷胱甘肽及其高产策略研究 [D]. 苏州 : 苏州大学, 21: [13] BRONSNAN J T, BRONSNAN M E, BERTOLO R F P, et al. Methionine: a metabolically unique amino acid[j]. Life Sciences,, 1: 2-7. DOI:1.11/j.livsci [14] WEI G Y, WANG D H, CHEN J. Overproduction of glutathione by L-cysteine addition and a temperature-shift strategy[j]. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 28, 13(3): DOI:1.17/ s [15] 贾建萍, 裘娟萍, 周彦钢. 谷胱甘肽分批补料发酵动力学模型的建立 [J]. 现代食品科技, 2, 28(4): DOI: (2) [1] NIE M, WEI G Y, SHAO N, et al. A novel strategy on the high-celldensity cultivation of Candida utilis for the enhanced production of glutathione[j]. Korean Journal of Chemical Engineering, 21, (4): DOI:1.17/s y. [17] WANG D H, YANG B, WEI G Y, et al. Efficient preparation of selenium/glutathione-enriched Candida utilis and its biological effects on rats[j]. Biological Trace Element Research, 2, 15: DOI:1.17/s [] WANG Y, WANG D, WEI G, et al. Enhanced co-production of S-adenosylmethionine and glutathione by an ATP-oriented amino acid addition strategy[j]. Bioresource Technology, 2, 17: 19-. DOI:1.11/j.biortech [19] WANG Y L, WANG D H, WEI G Y, et al. Improved co-production of S-adenosylmethionine and glutathione using citrate as an auxiliary energy substrate[j]. Bioresource Technology, 213, 131: DOI:1.11/j.biortech [2] 郑丽雪, 王立梅, 梅艳珍, 等. 酿酒酵母生产谷胱甘肽分批发酵动力学研究 [J]. 食品科学, 211, 32(1): [21] WANG D Z, WANG C, WU H, et al. Glutathione production by recombinant Escherichia coli expressing bifunctional glutathione synthetase[j]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 21, 43: -53. DOI:1.17/s [22] SASAKI K, HARA K Y, KAWAGUCHI H, et al. Nanofiltration concentration of extracellular glutathione produced by engineered Saccharomyces cerevisiae[j]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 21, 1: 9-1. DOI:1.11/j.jbiosc [23] YANG J H, LI W, WANG D Z, et al. Characterization of bifunctional L-glutathione synthetases from Actinobacillus pleuropneumoniae and Actinobacillus succinogenes for efficient glutathione biosynthesis[j]. Applied Microbiology and Biotechnology, 21, 1: DOI:1.17/s [] TANG L, WANG W, ZHOU W, et al. Three-pathway combination for glutathione biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae[j]. Microbial Cell Factories, 215, 14: 139. DOI:1.1/s [25] ZHANG J, QUAN C, WANG C, et al. Systematic manipulation of glutathione metabolism in Escherichia coli for improved glutathione production[j]. Microbial Cell Factories, 21, 15: 38. DOI:1.1/ s [2] CHEN J L, XIE L, CAI J J. Enzymatic synthesis of glutathione using engineered Saccharomyces cerevisiae[j]. Biotechnology Letters, 213, 35: DOI:1.17/s [] KIRIYAMA K, HARA K Y, KONDO A. Extracellular glutathione fermentation using engineered Saccharomyces cerevisiae expressing a novel glutathione exporter[j]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2, 9: 1-7. DOI:1.17/s [28] LI Y, CHEN J, MAO Y Y, et al. Effect of additives and fed-batch culture strategies on the production of glutathione by recombinant Escherichia coli[j]. Process Biochemistry, 1998, 33: DOI:1.11/S (98)38-7. [29] WANG C, ZHANG J, WU H, et al. Heterologous gshf gene expression in various vector systems in Escherichia coli for enhanced glutathione production[j]. Journal of Biotechnology, 215, 214: 3-8. DOI:1.11/j.jbiotec [3] UBIYVOVK V M, ANANIN V M, MALYSHEV A Y, et al. Optimization of glutathione production in batch and fed-batch cultures by the wild-type and recombinant strains of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha DL-1[J]. BMC Biotechnology, 211, 11: 8. DOI:1.1/ [31] FEI L, WANG Y, CHEN S. Improved glutathione production by gene expression in Pichia pastoris[j]. Bioprocess and Biosystems Engineering, 29, 32(): DOI:1.17/s x. [32] NIE W, WEI G Y, DU G C, et al. Enhanced intracellular glutathione synthesis and excretion capability of Candida utilis by using a low phstress strategy[j]. Letters in Applied Microbiology, 25, 4(5): DOI:1.1111/j X x. [33] LIANG G B, LIAO X Y, DU G C, et al. Elevated glutathione production by adding precursor amino acids coupled with ATP in high cell density cultivation of Candida utilis[j]. Journal of Applied Microbiology, 28, 15(5): DOI:1.1111/j x. [34] WANG M, SUN J, XUE F, et al. The effect of intracellular amino acids on GSH production by high-cell-density cultivation of Saccharomyces cerevisiae[j]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2, 18(1): DOI:1.17/s [35] WEN S H, ZHANG T, TAN T W. Maximizing production of glutathione by amino acid modulation and hih-cell-densit fed-batch culture of Saccharomyces cerevisiae[j]. Process Biochemistry, 2, 41(): -28. DOI:1.11/j.procbio [] XIONG Z Q, GUO M J, GUO Y X, et al. RQ feedback control for simultaneous improvement of GSH yield and GSH content in Saccharomyces cerevisiae T5[J]. Enzyme and Microbial Technology, 21, 4(7): DOI:1.11/j.enzmictec

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Microsoft Word - 793-797 tb20150504赵宏宇s-高校教改纵横.doc 微生物学通报 Microbiology China tongbao@im.ac.cn Apr. 20, 2016, 43(4): 793 797 http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn DOI: 10.13344/j.microbiol.china.150504 高校教改纵横生物工程专业发酵课程群建设探索 * 赵宏宇