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句荧灯秦
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1 Page 1 of 7 基因诊断第十期心律失常与 SCN5A 基因突变有关实时荧光定量 PCR 原理和实验与小鼠流产相关的突变基因的研究肥胖可能是心力衰竭的危险因子口服避孕药不会增加罹患乳癌的危险度高卡路里和高脂肪的摄入可能是阿尔茨海默病的高危因素抗 -CD3 单克隆抗体在新发 Ⅰ 型糖尿病患者中的应用焦虑症与 5 羟色胺转运体基因多态性的关系荧光定量 PCR 检测 234 例乙型肝炎病毒 DNA 结果分析用于 TB-DNA 扩增的痰标本前处理胰酶消化法单相躁狂症与 5HT2A 基因 T102C 多态性的相关研究 MGB 探针及其在结核杆菌耐利福平株中的应用同源盒基因与脊椎动物头面部发育英美科学家发现导致兔唇的基因参与自身免疫性疾病的基因小鼠基因组物理图谱已绘制成功单细胞基因表达谱破解恶性疟原虫的遗传密码感染性疾病分子的检测人类基因组用户指南基于 PCR 扩增方法来保持两个复杂基因组的数量差异一种用金纳米微粒探针检测 DNA 或 RNA 靶标的方法新生儿单纯疱疹病毒感染定量及 1 型和 2 型的比较实时 PCR 定量分析原发感染的母亲羊水中的 HCMV DNA HIV 的分子诊断口腔细菌和流产有关研究发现 HIV 整合到人类基因组的热点癌的不稳定通道基因诊断杂志实时荧光定量 PCR 原理和实验无论是对遗传病 ( 如地中海贫血和血友病 ) 传染病( 如肝炎和艾滋病 ) 或肿瘤进行基因诊断, 还是研究药物对基因表达水平的影响, 或者监控药物和疗法的治疗效果, 定量 PCR 技术都可以发挥很大作用定量 PCR 技术的最新进展是实时荧光定量该技术借助于荧光信号来检测 PCR 产物, 一方面提高了灵敏度, 另一方面还可以做到 PCR 每循环一次就收集一个数据, 建立实时扩增曲线, 准确地确定 CT 值, 从而根据 CT 值确定起始 DNA 拷贝数, 做到了真正意义上的 DNA 定量这是 DNA 定量技术的一次飞跃根据最终得到的数据不同, 定量 PCR 可以分为相对定量和绝对定量两种典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化, 得到的结果是百分比 ; 绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度根据所使用的技术不同, 荧光定量 PCR 又可以分为 TaqMan 探针和 SYBR Green I 荧光染料两种方法比较而言, 探针杂交技术在原理上更为严格, 所得数据更为精确 ; 荧光染料技术则成本更为低廉, 实验设计更为简便在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定定量实验与定性实验最大的不同, 是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正, 以消除偶然误差因此重复实验和设立内对照非常重要由于各种各样的客观原因, 这一点在实践中往往被轻视或忽视, 需要着重强调当然, 与定性实验一样, 定量 PCR 也要设立阴性和阳性对照, 以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题 1 为什么终点定量不准确? 我们都知道理论上 PCR 是一个指数增长的过程, 但是实际的 PCR 扩增曲线并不是标准的指数曲线, 而是 S 形曲线这是因为随着 PCR 循环的增多, 扩增规模迅速增大,Taq 酶 dntp 引物, 甚至 DNA 模板等各种 PCR 要素逐渐不敷需求,PCR 的效率越来越低, 产物增长的速度就逐渐减缓当所有的 Taq 酶都被饱和以后,PCR 就进入了平台期由于各种环境因素的复杂相互作用, 不同的 PCR 反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化, 难以精确控制所以, 即使是重复实验, 各种条件基本一致, 最后得到的 DNA 拷贝数也是完全不一样的, 波动很大 ( 图 1) 图 1 同一个样本重复 96 次 PCR 的扩增曲线传统的定量方法, 如溴乙锭染色或放射性核素掺入标记后的光密度扫描等, 测定的

2 Page 2 of 7 乳腺癌特异标志物的发现乙型肝炎 e 抗原与肝细胞性肝癌的关系端粒酶及其亚单位在甲状腺癌中的表达 p21(waf1/cip1) 的表达可能有助于舌鳞状细胞癌的预后评估病毒感染量是乙型肝炎病毒相关性肝细胞癌的重要预后因素都是 PCR 的终产物, 而不是起始 DNA 拷贝数由于 PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系, 所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数对于绝大多数实验, 比如甲肝的诊断药物疗效的监测等, 需要测定的都是 PCR 放大之前标本中的 DNA 原始拷贝数, 经过 PCR 扩增以后的 DNA 拷贝数已经不能反映真实情况在这种情况下, 就不能采用终点定量, 而要根据 CT 值确定 DNA 起始拷贝的数量基因诊断杂志启事实验室交流业内快讯酪氨酸激酶抑制剂转 1 型糖尿病使用限制性片段长度多态性毛细管电泳检测幽门螺杆菌分子信标实时荧光 PCR 法检测 HPV15 种高危和 5 种低危型别基因拷贝数变异的研究进展利用人乳头瘤病毒 mrna 和 P16 蛋白作为生物标志物改进子宫颈癌诊断应用 mrna 展示技术筛选 HCV IRES RNA 环状肽段适体一种新的基因突变在家族性房颤中被鉴定出来 2 为什么 CT 值与起始模板拷贝数成线性关系? CT 值的定义是 PCR 扩增过程中, 荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数从图 1 的重复实验中可以直观地看到, 尽管平台期 DNA 拷贝数波动很大,CT 值却是相对固定的如果用不同浓度的 DNA 作 PCR, 可以看出 DNA 浓度越高,CT 值越小 DNA 浓度每增加 1 倍,CT 值减小 1 个循环 CT 值与模板 DNA 的起始拷贝数成反比这一结论可以从数学上严格证明为使表达式简便, 以下推导忽略 PCR 效率等细节如果考虑这些因素, 可以在方程上增加修正项这些修正项的增加并不改变方程的线性性质一般地, 我们有 Rn=RB+XO(1+EX)nRS, 也就是说第 n 次 PCR 循环时的荧光信号强度 (Rn) 等于背景信号强度 (RB) 加上每个分子的荧光强度 ( 即单位荧光强度,RS) 与分子数目的乘积当循环次数 n = CT 时, 则有 RT=RB+XO(1+EX)CTRS 两边取对数, 得 log (RT -RB) = logx0 + CTlog(1+ Ex) + logrs 整理此式,CTlog(1+ Ex) = - logx0 + log(rt -RB) logrs 所以对于每一个特定的 PCR 反应来说,EX RT RB 和 RS 都是常数, 所以 CT 值与 log X0 成反比, 也就是说,CT 值与起始模板拷贝数 (X0) 的对数成反比, 起始 DNA 浓度每增加 1 倍,CT 值减小 1 个循环根据 CT 值的定量是精确和严格的, 而传统的终点定量则比较粗放如果读者有兴趣的话, 也可以假设 PCR 的效率 ( 即 Ex) 为 100%, 从上式推算出定量 PCR 标准曲线的最佳斜率和 CT 值的最佳范围 3 怎样确定 CT 值? 实验操作中,CT 值定义为在基线上方产生可检测到的统计学上显著的荧光发射时所对应的 PCR 循环次数 ( 图 2) 基线上方也就是阈值高度的量化定义是基线范围内荧光信号强度标准偏差的 10 倍阈值所在的横线与 PCR 扩增曲线的交点所指的 PCR 循环次数就是 CT 值基线范围的定义是从第 3 个循环起到 CT 值前 3 个循环止, 其终点要根据每次实验的具体数据调整, 一般取第 3 到第 15 个循环之间早于 3 个循环时, 荧光信号很弱, 扣除背景后的校正信号往往波动比较大, 不是真正的基线高度 ; 而在 CT 值前 3 个循环之内, 大多数情况下荧光信号已经开始增强, 超过了基线高度, 都不宜当作基线来处理

3 Page 3 of 7 图 2CT 值和阈值显然,CT 值取决于阈值, 阈值取决于基线, 基线取决于实验的质量,CT 值是一个完全客观的参数 CT 值越小, 模板 DNA 的起始拷贝数越多 ;CT 值越大, 模板 DNA 的起始拷贝数越少正常的 CT 值范围在之间, 过大和过小都将影响实验数据的精度 4 荧光信号和定量数据的归一化虽然大多数定量 PCR 仪都会自动扣除本底, 但是仍然需要注意荧光信号强度和定量数据的归一化校正, 以便不同样本之间的实验数据可以严格地相互比较由于加样操作的误差离心管透光性能的差异荧光激发效率的差异等偶然误差不可避免, 因此仪器收集到的原始信号必须进行归一化校正, 以消除这些因素对定量结果的影响这种校正可以通过在反应体系中添加额外的荧光染料来实现, 一般采用红色 ROX 荧光, 称为阳性参比信号 ROX 在反应缓冲液中的浓度是固定的, 因此其信号的强度与反应体系的总体积和总的荧光激发效率正相关目标基因和对照基因的信号除以阳性参比信号以后, 即 Rn = R / RROX, 就可以在同样的起点上进行比较和各种计算 ROX 校正可以提高定量数据的精度和重现性, 减少孔间差异 ( 图 3) 图 3 ROX 荧光校正 ( 左 ) 和不校正 ( 右 ) 对实验数据的影响归一后的荧光信号再扣除本底, 就得到 DRn:DRn = Rn, 样本 - Rn, 空白 DRn 是最后构建 PCR 实时扩增曲线的纵坐标无论绝对定量还是相对定量, 在得到实验结果后, 还要考虑数据之间的可比性问题在实验操作中, 取样都是以体积或重量为单位的, 但是同样体积或重量的样本所来

4 Page 4 of 7 源的细胞数目并不一样, 所以拷贝 /μl 或拷贝 /ng 的定量数据相互之间实际上并不可比只有将这些数据归一到以拷贝 / 细胞或拷贝 / 基因组为单位后, 才可进行严格意义上的比较这种校正可以通过适当的参比来完成参比一般选用 b-actin GAPDH rrna 基因等管家基因由于它们在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数是恒定的, 受环境因素影响较小, 其定量结果代表了样本中所含细胞或基因组的数量校正方法为 :[DNA] 样本 / [DNA]IPC, 或者 DCT = CT, 样本 - CT, IPC 因为 CT 值与起始 DNA 拷贝数的对数是反比关系, 可以证明, 这两种计算方法在数学上是等价的为了减少误差, 目标基因和参比基因最好在同一反应管内同时进行定量测定, 所以这种对照称为阳性内对照 (Internal Positive Control,IPC) 要进行 IPC 归一化校正, 定量 PCR 仪必须具备多色检测能力, 最好是 4 色否则, 目标基因和参比基因只能分两管作定量, 就不成其为内标了 5 污染的预防和热启动为保证定量的准确性, 要预防非特异性 PCR 扩增和污染常用的措施有使用 UNG 酶 (Uracil-N-Glycosylase) 和热启动 UNG 酶的作用原理是降解含有 du 的双链或单链 DNA 它在 50 C 激活,95 C 灭活由于商用 PCR 试剂盒均以 dutp 取代 dttp, 所以 PCR 产物都是含有 du 的 DNA 链在定量 PCR 开始前增加 50 C 的保温步骤,UNG 酶即可将已有的 PCR 产物降解破坏, 防止可能造成的污染普通的 Taq 酶即使在室温下也有一定的活性, 如果不采取措施, 在加入 PCR 试剂的过程中正式 PCR 开始前就会完成少量 PCR 扩增, 增加了背景, 影响定量精度而金牌 Taq 酶经过特殊修饰, 常温下其活性部位被封闭, 没有活性 ; 只有经过 95 C 10 min 的热启动以后, 封闭被解除, 才能开始 DNA 链延伸, 这样就最大限度地减少了杂讯的生成 6 标准曲线重复实验和阴性阳性对照定量实验, 误差是不可避免的设立重复实验, 对数据进行统计处理, 可以将误差降低到最小所以定量实验的每个样本至少要重复 3 次以上, 严格的定量更应当重复 6~ 8 次, 以满足小样本统计的要求如果作绝对定量, 则标准曲线需要在 5 个点以上标准曲线使用的标准品是浓度已知的 DNA 样本, 可以自己制备, 也可以购买商品化的试剂盒其 PCR 反应条件应当与未知样本的一致, 以便在同一反应板上同时定量阴性对照中不加模板 DNA, 而以水或缓冲液代替, 用于检验是否存在 PCR 污染阳性对照则用于检验 PCR 试剂和实验操作上可能出现的问题如果实验中设立了 IPC, 则 IPC 既可以用来校正数据, 也可以起到阳性对照的作用 7 TaqMan 探针技术原理 TaqMan 探针法是高度特异的定量 PCR 技术, 其核心是利用 Taq 酶的 3 5 外切核酸酶活性, 切断探针, 产生荧光信号由于探针与模板是特异性结合, 所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量在 TaqMan 探针法的定量 PCR 反应体系中, 包括一对 PCR 引物和一条探针探针只与模板特异性地结合, 其结合位点在两条引物之间探针的 5 端标记有报告基团 (Reporter, R), 如 FAM VIC 等,3 端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q), 如 TAMRA 等当探针完整的时候, 报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收, 仪器检测不到信号随着 PCR 的进行,Taq 酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针, 其 3

5 Page 5 of 7 5 外切核酸酶活性就会将探针切断, 报告基团远离淬灭基团, 其能量不能被吸收, 即产生荧光信号 ( 图 4) 所以, 每经过一个 PCR 循环, 荧光信号也和目的片段一样, 有一个同步指数增长的过程信号的强度就代表了模板 DNA 的拷贝数图 4 TaqMan 探针的荧光信号产生机制 TaqMan 探针根据其 3 端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种 : 普通的 TaqMan 探针和 TaqMan MGB 探针 MGB 探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团 (Non-Fluorescent Quencher), 本身不产生荧光, 可以大大降低本底信号的强度同时探针上还连接有 MGB (Minor Groove Binder) 修饰基团 ( 图 5), 可以将探针的 Tm 值提高 10 C 左右因此为了获得同样的 Tm 值,MGB 探针可以比普通 TaqMan 探针设计得更短, 既降低了合成成本, 也使得探针设计的成功率大为提高因为在模板的 DNA 碱基组成不理想的情况下, 短的探针比长的更容易设计实验证明,TaqMan MGB 探针对于富含 A/T 的模板可以区分得更为理想图 5 TaqMan MGB 探针 8 SYBR Green I 荧光染料技术原理 SYBR Green I 是一种只与 DNA 双链结合的荧光染料 ( 图 6) 当它与 DNA 双链结合时, 发出荧光 ; 从 DNA 双链上释放出来时, 荧光信号急剧减弱因此, 在一个体系内, 其信号强度代表了双链 DNA 分子的数量 SYBR Green 荧光染料法定量 PCR 的基本过程是 :1 开始反应, 当 SYBR Green 染料与 DNA 双链结合时发出荧光 2 DNA 变性时,SYBR Green 染料释放出来, 荧光急剧减少 3 在聚合延伸过程中, 引物退火并形成 PCR 产物 4 聚合完成后,SYBR Green 染料与双链产物结合, 定量 PCR 系统检测到荧光的净增量加大

6 Page 6 of 7 图 6 SYBR Green I 荧光染料与 DNA 双链的结合 SYBR Green I 荧光染料能与所有的 DNA 双链相结合, 对 DNA 模板没有选择性, 所以特异性不如 TaqMan 探针要想用荧光染料法得到比较好的定量结果, 对 PCR 引物设计的特异性和 PCR 反应的质量要求就比较高在此前提下, 本法是一种成本低廉的选择 9 定量 PCR 仪简介目前在国内使用得比较多的荧光实时定量 PCR 仪有美国应用生物系统公司 (Applied Biosystems,ABI) 的型和罗氏公司的 LightCycler 等下面以 ABI 最新推出的 7000 型为例作简单介绍 7000 型荧光定量 PCR 仪设计满足临床检验医学研究和基础实验的要求, 面向低通量至中等通量的用户随机配置的定量 PCR 引物和探针设计软件 Primer Express 非常有用, 因为到目前为止还没有其他软件有能力设计定量 PCR 所需的 TaqMan 探针 7000 型有实时动态 (Real-Time) 和终点读板 (Plate Read) 两种运行模式实时动态模式用于定量, 测定 DNA 或 RNA 拷贝数 7000 型可以动态显示 PCR 扩增曲线的生成, 定量的线性范围大于 7 个数量级, 区分 5000 和个拷贝的 DNA 模板可信度达 99.7% 终点读板模式用于基因型鉴定点突变检测和单核苷酸多态性 (SNP) 分析等当然, 7000 型也可以作为普通 PCR 仪使用 ABI 已经发布 12 万个商品化的定量 PCR 试剂盒, 覆盖人类全部 4 万个基因, 平均每个基因 3 个检测试剂盒, 为运用型开展课题研究创造了绝佳的条件 7000 型最大特色是具备多色检测能力, 荧光检测的波长范围为 530~590 nm, 能够有效地分辨 FAMTM / SYBR? Green I VICTM / JOETM TAMRATM 和 ROXTM 等荧光染料多色荧光检测技术为多重定量 SNP 分析基因型分型和带阳性内对照的阴 / 阳性分析提供了基础多重定量即在同一反应管内同时对多个目标基因进行定量, 可以大大提高精度并节约成本 7000 型支持两种定量化学 :TaqMan 荧光探针和 SYBR Green I 荧光染料其熔解曲线 (Dissociation Curve) 功能用于判断 PCR 扩增反应是否特异, 有无杂带生成进一步阅读材料基本方法 [1] Lie, Y. S. and C. J., Petropoulos. "Advances in quantitative PCR technology: 5 nuclease assays." Curr Opin Biotechnol 9: [2] Orlando, C., P., Pinzani, and M., Pazzagli. "Developments in quantitative PCR." Clin Chem Lab Med 36: 绝对定量 [3] Becker K., D. Pan and C.B. Whitley Real-time quantitative polymerase chain reaction to assess gene transfer. Hum. Gene Ther. 10: , 1999.[4] de Kok, J.B., Hendriks, J.C., van Solinge, W.W., Willems, H.L., Mensink, E.J., and

7 Page 7 of 7 Swinkels, D.W. Use of real-time quantitative PCR to compare DNA isolation methods. Clin.Chem. 44(10): , [5] Wang X., X. Li, R.W. Currie, R.N. Willette, F.C. Barone and G.Z. Feuerstein. Application of real-time polymerase chain reaction to quantitate induced expression of interleukin-1beta mrna in ischemic brain tolerance. J. Neurosci. Res. 59(2): ,2000. 相对定量 [6] de Kok, J.B., Ruers, T.J., van Muijen, G.N., van Bokhoven, A., Willems, H.L., and Swinkels, D.W. Real -time quantification of human telomerase reverse transcriptase mrna in tumors and healthy tissues. Clin.Chem. 46(3): 313-8,2000.[7] Moody, A., Sellers, S., and Bumstead, N. Measuring infectious bursal disease virus RNA in blood by multiplex real-time quantitative RT- PCR. Virol. Methods 85(1-2) 55-64,2000.[8] Zhang, A.W., Hartman, G.L., Curio-Penny, B., Pedersen, W.L., and Becker, K.B. Molecular Detection of Diaporthe phaseolorum and Phomopsis longicolla from Soybean Seeds. Phytopathology 89(9): , 作者单位 : 美国应用生物系统公司 (Applied Biosystems) 实时荧光定量 PCR 技术研究进展及其 5-15 荧光定量 PCR 快速检测铜绿假单胞菌 3-26 实时荧光定量聚合酶链反应检测唾液 1-3 荧光定量 PCR 技术检测 DNA 疫苗在生殖 9-26 定量 PCR 室间质评可接受范围的探讨 5-17 SYBR Green I 实时荧光定量 PCR 检测 1-4 结核分枝杆菌标本的不同处理方法对 8-17 实时荧光定量 PCR 检测乳腺癌组织中 7-4 页首粤 ICP 备号版权所有 : 中山大学达安基因股份有限公司版权所有信息化合作 : 汇灵信息备案编号 : 未经书面特别授权, 请勿转载或建立镜像, 违者依法追究网站支持 : 讯域科技地址 : 广州市高新区科学城香山路 19 号邮编 : 公司总机电话 : 传真 :

124 河南农业科学第 42 卷, (HPS) ;PRRSV PCV2, [4] PRRSV CSFV ;20, PRRSV,CSFV [5-9],, 1.2 主要试剂和仪器 Real-timePCR PRRSV CSFV PCV2, 3 RotorGene, RG-3000; ND-1000 Na

124 河南农业科学第 42 卷, (HPS) ;PRRSV PCV2, [4] PRRSV CSFV ;20, PRRSV,CSFV [5-9],, 1.2 主要试剂和仪器 Real-timePCR PRRSV CSFV PCV2, 3 RotorGene, RG-3000; ND-1000 Na 河南农业科学,2013,42(2):123-127 JournalofHenanAgriculturalSciences PCR PRRSV CSFV PCV2,, (, 450011) : 根据 TaqMan 复合荧光探针设计原则, 应用 Primer5.0 和 Oligo6.0 软件设计检测猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 猪瘟病毒 (CSFV) 和猪圆环病毒 2 型 (PCV2) 的特异性引物和探针,