检验医学 217 年 11 月第 32 卷第 11 期 Laboratory Medicine,November 217,Vol. 32,No 患者中, 若血浆 3-MT>.2 nmol/l(37.4 pg/ ml) 或肿瘤直径 > 5 cm 表示肿瘤扩散转移的似然比增大, 尤其与嗜

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叶墀乔
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1 146 检验医学 217 年 11 月第 32 卷第 11 期 Laboratory Medicine,November 217,Vol. 32,No. 11 文章编号 : (217) 中图分类号 :R446.1 文献标志码 :A DOI :1.3969/j.issn 液相色谱 - 串联质谱检测血浆 3- 甲氧酪胺方法的建立秦嘉倩, 彭颖斐, 陈方俊, 邵文琦, 吴炯, 张春燕, 王蓓丽, 郭玮, 潘柏申 ( 复旦大学附属中山医院检验科, 上海 232) 摘要 : 目的建立一种稳定的检测血浆 3- 甲氧酪胺 (3-MT) 的液相色谱 - 串联质谱 (LC-MS/MS) 方法方法对 LC-MS/MS 的分离条件 ( 色谱柱柱温 ph 值 ) 进行优化, 建立检测血浆 3-MT 的方法, 并对该方法的线性范围回收率精密度最低检测下限和稳定性进行评价结果以同位素氘代作为内标, 采用 BEH HILIC 色谱柱进行分离流动相为 mmol/l 甲酸铵缓冲液 (ph 值为 3) 和纯乙腈, 梯度洗脱 ; 柱温为 35 LC-MS/ MS 检测 3-MT 的线性范围为 5~1 pg/ml, 定量检出限为 5 pg/ml, 天间和批间变异系数 (CV) 分别为 <6% 和 <7%, 回收率为 97.1%~19.3% 由于 3-MT 在室温中稳定性较差, 因此需冰浴送检结论建立了检测 3-MT 的 LC-MS/MS 方法, 能够灵敏准确地检测血浆 3-MT 水平关键词 :3- 甲氧酪胺 ; 液相色谱 - 串联质谱法 ; 嗜铬细胞瘤 Establishment of a liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the determination of plasma 3-methoxytyramine QIN Jiaqian,PENG Yingfei,CHEN Fangjun,SHAO Wenqi,WU Jiong,ZHANG Chunyan,WANG Beili,GUO Wei,PAN Baishen. (Department of Clinical Laboratory,Zhongshan Hospital, Fudan University,Shanghai 232,China) Abstract:Objective To establish a liquid chromatography-tandem mass spectrometry(lc-ms/ms) for plasma 3-methoxytyramine(3-MT) determination. Methods The separation condition of LC-MS/MS(chromatographic column,column temperature and ph value)was improved. The linear range,recovery rate,precision,lower limit of quantitation and stability of LC-MS/MS were evaluated. Results 3-MT was separated by BEH HILIC chromatographic column using 3-MT-d4 as internal standard. The mobile phase consisted of mmol/l ammonium formate aqueous solution(ph value was 3)and acetonitrile. The column temperature was 35. The linear range of 3-MT determination were 5-1 pg/ml. The limit of quantitation was 5 pg/ml. The inter-day and between-run coefficients of variation(cv) were <6% and <7%. The recovery rate was 97.1%-19.3%. As 3-MT was unstable in room temperature,it should be transported under 4. Conclusions A reliable LC-MS/MS for the determination of 3-MT has been established,with sensitivity and accuracy. Key words:3-methoxytyramine;liquid chromotography-tandem mass spectrometry;pheochromocytoma 嗜铬细胞瘤是一类神经内分泌肿瘤, 能产生过多的儿茶酚胺 (catecholamine,ca), 主要临床表现为不同类型的继发性高血压 [1-4] 产生 CA 的神经内分泌细胞主要为肾上腺髓质细胞, 分布于肾上腺髓质及交感神经系统神经节有部分学者认为嗜铬细胞瘤仅限于肾上腺髓质肿瘤, 但目前普遍认为应该包含异位嗜铬细胞瘤因此, 在临床实践中, 人们将嗜铬细胞瘤的特征定义为自体分泌 CA 传统的嗜铬细胞瘤的诊断指标包括血和尿 CA 尿香草扁桃酸等, 但均缺乏足够的敏感性和特异性近年来, 有研究发现变肾上腺素 (metanephrine,mn) 类物质, 包括 MN 和去甲变肾上腺素 (normetanephrine, NMN) 对嗜铬细胞瘤具有较高的诊断价值, 但其对肿瘤转移判断的作用有限 [2,5-6] 3- 甲氧酪胺 (3-methoxytyramine,3-MT) 被认为是识别嗜铬细胞瘤有无转移的重要标志 3-MT 是多巴胺的甲氧基代谢产物有研究表明, 在嗜铬细胞瘤基金项目 : 国家自然基金科学面上项目 ( ); 上海市卫生计生系统重要薄弱学科建设项目 (215ZB21) 作者简介 : 秦嘉倩, 女,1991 年生, 技师, 主要从事临床生化检验工作通信作者 : 潘柏申, 联系电话 :

2 检验医学 217 年 11 月第 32 卷第 11 期 Laboratory Medicine,November 217,Vol. 32,No 患者中, 若血浆 3-MT>.2 nmol/l(37.4 pg/ ml) 或肿瘤直径 > 5 cm 表示肿瘤扩散转移的似然比增大, 尤其与嗜铬细胞瘤的转移相关 [5] 另外, 3-MT 还可与 NMN 联合用于辅助诊断恶性嗜铬细胞瘤 [6] 然而, 使用 3-MT 辅助诊断嗜铬细胞瘤在检测方法上存在不足之处目前, 检测血浆 3-MT 大多使用高效液相色谱 (high-performance liquid chromatography,hplc) 电化学检测技术, 有些实验室甚至还在使用放射免疫法这些检测方法十分耗时繁琐, 而且特异性敏感性均不足 3-MT 在体内含量低, 同构干扰物多, 因此在用于诊断嗜铬细胞瘤时就需要特异性更好的方法 [7] 为此, 我们拟建立检测 3-MT 的液相色谱 - 串联质谱 (liquid chromatography-tandem mass spectrometry,lc-ms/ms) 方法, 以提高检测的敏感性和特异性 1 材料和方法 1.1 研究对象收集 212 年 1 12 月复旦大学附属中山医院泌尿外科和内分泌科就诊的嗜铬细胞瘤患者 21 例, 男 8 例, 女 13 例, 其中异位嗜铬细胞瘤 4 例, 年龄 29~57 岁 1.2 样本采集所有患者静卧 15 min 后, 使用乙二胺四乙酸 (ethylene diamine tetraacetic acid,edta) 抗凝真空管采集患者静脉血离心分离血浆, 并分装到尖底离心管内,-8 冻存 1.3 仪器与试剂质谱系统为 Xevo TQ MS ACQUITY UPLC System( 美国 Waters 公司 ) 标准品为纯 3-MT 盐酸盐 ( 美国 Sigma-Aldrich 公司 ), 内标品为 3-MT-d4 盐酸盐 (5 mg, 美国 Cambridge Isotope Laboratories 公司 ) 甲酸铵( 美国 Sigma 公司, 色谱级 ) 甲醇( 德国 Merck 公司, 色谱级 ) 乙腈 ( 德国 Merck 公司, 色谱级 ) 甲酸( 美国 Roe Scientific 公司, 色谱级 ) 磷酸盐缓冲液 (phosphate buffered saline,pbs; 中国吉诺生物医药有限公司 ) 1.4 样本前处理将血浆标准品内标品取出平衡至室温取患者血浆 38 μl, 加入内标 2 μl, 混匀,12 g 离心 1 min 取 PBS 36 μl, 加入标准品 2 μl, 再加入内标 2 μl, 混匀, 12 g 离心 1 min 血浆样本和标准品使用 Waters Oasis 弱阳离子交换 96 孔 1 ml 微萃取固相抽提板 (solid-phase extraction,spe) 进行抽提和萃取每孔预先使用甲醇和水各 2 μl 进行润洗 ( 流速为 1 ml/min), 随后加入混合有内标的 4 μl 样本 ( 血浆或标准品 ) 进行抽提和萃取 ( 流速为 1 ml/min), 然后再加入水甲醇及.1 % 甲酸乙腈各 2 μl, 分别将亲水亲有机相及不同极性的杂质洗脱 ( 流速为 1 ml/min), 最后使用 2% 甲酸乙腈溶液 5 μl 进行 2 次洗脱 ( 流速为 3 ml/min), 将目标分析物以及同位素内标洗脱入样本收集管内 1.5 标准品制备取 3-MT 盐酸盐纯品 15 mg, 溶解于 15 ml.1 mol/l 盐酸溶液中, 得到浓度为 1 mg/ml 的母液取 2 μl 母液用.1 mol/l 盐酸溶液滴定至 ml, 得到浓度为 2 μg/ml 的 3-MT 溶液, 将该溶液作为储备液 1,-8 保存工作液配置 : 吸取 μl 储备液 1, 用.1 mol/l 盐酸溶液滴定至 1 ml, 此时 3-MT 的浓度为 2 ng/ml, 将其作为储备液 2 使用.1 mol/l 盐酸溶液将储备液 2 按照一定比例分别稀释为 ng/ml 标准品分装后 -8 保存备用, 不能反复使用 1.6 LC-MS/MS 分离条件的优化色谱柱选择选择 B E H C 1 8 色谱柱 (2.1 mm. mm,1.7 μm) BEH Amide 色谱柱 (2.1 mm. mm,1.7 μm) 和 BEH HILIC 色谱柱 (2.1 mm. mm,1.7 μm), 比较各色谱柱的出峰效果以上色谱柱均购自美国 Waters 公司柱温对保留时间的影响将含有内标的 3-MT 标准品在不同柱温 ( ) 下进行分析, 比较 3-MT 及其内标的保留时间不同 ph 值流动相对保留时间的影响配制不同 ph 值 ( ) 的 mmol/l 甲酸铵溶液作为流动相, 检测含内标的 3-MT 标准品, 比较保留时间 1.7 色谱分析条件色谱柱为 BEH HILIC(2.1 mm. mm, 1.7 μm), 柱温 35 流动相 A1 为 mmol/ L 甲酸铵溶液, 加入甲酸将 ph 值调节至 3.; 流动相 B 1 为 1 % 乙腈 ; 流动相 A 2 为去离子水 ; 流动相 B 2 为 1 % 纯甲醇流速为.45 ml/min, 梯度洗脱初始流动相为 5%A1 95%B1, 运行 1 min 后慢慢转变成 3%A1 7%B1; 维持该比例流动相 1 min, 然后用

3 148 检验医学 217 年 11 月第 32 卷第 11 期 Laboratory Medicine,November 217,Vol. 32,No min 将流动相比例改为 4%A1 6%B1; 随后在 2 min 内使流动相比例变为 5%A1 95%B1, 维持 2 min, 使色谱柱平衡至进样前状态检测完样本后, 采用 5%A2 95%B2 冲洗系统 1 min, 然后用 %B2 冲洗系统 1 min, 最后将色谱柱保存在甲醇中整个检测过程中流速均为.45 ml/min 每个样本平均检测时间为 7 min 洗脱程序见表 1 表 1 流动相配比检测阶段时间流速流动相 A 流动相 B (ml/min) (%) (%) 质谱分析条件将萃取得到的样本上机检测, 进样量为 2 μl 仪器设置参数见表 2 表 2 质谱检测参数分析物转换离子对锥孔电压碰撞能量 (m/z) (kv) (ev) 3-MT 定性 MT 定量 MT-d4 定量方法学评价标准曲线配制含有内标的一系列标准品, 浓度分别为 pg/ml, 将标准品出峰面积 / 内标出峰面积比值与标准品浓度作回归分析以变异系数 (coefficient of variation,cv)<2% 时的最低浓度作为 LC-MS/MS 检测 3-MT 的最低定量下限线性评估测定 pg/ml 标准品, 作回归分析准确度采用回收率评估准确度选取 5 个水平的血浆,3-MT 水平分别为 pg/ml, 每个水平的血浆各分装 5 份, 共 25 份样本, 每份样本中分别加入 pg/ml 3-MT, 采用 LC-MS/MS 检测 3-MT 水平回收率 = ( 终浓度 - 初始浓度 )/ 增加浓度 % 精密度以高值 (2 pg/ml) 低值 (1 pg/ml) 标准品作为待测样本, 分别同时检测 15 次, 评价天间精密度 ; 连续检测 5 d, 每天重复 3 次, 评价批间精密度稳定性将 2 个水平的血浆样本反复冻融 [ 从 -8 到室温 (21 ) 反复解冻 3 次 ] 在室温放置 24 h 以及样本处理后在自动进样器放置 36 h, 分别采用 LC-MS/MS 测定 3-MT, 并与初始值比较, 观察其稳定性 1.1 统计学方法采用 SPSS 17. 软件进行统计分析计算均值 (x) 标准差(s) CV 偏移和回收率 2 结果 2.1 LC-MS/MS 分离条件的优化色谱柱选择 BEH C18 色谱柱和 BEH Amide 色谱柱均无法达到基线分离, 信噪比未达 1 1, 不出样品峰 BEH HILIC 色谱柱可得到强响应纯品峰, 通过进一步摸索色谱条件后可以有效分离 3-MT 柱温对保留时间的影响随着柱温的增高,3-MT 及其内标的保留时间相应缩短同时检测 MN NMN 和 3-MT, 当柱温为 35 时,3 种物质能被较好地分离, 且分析时间适中见图 1 保留时间 (min) 柱温 ( ) 图 1 柱温对保留时间的影响不同 ph 值流动相对保留时间的影响随着流动相 ph 值的增加, 保留时间相应缩短同时检测 MN NMN 和 3-MT, 当 ph 值为 3. 时, 峰型较好,3-MT 能较好地被分离因此, 色谱柱柱温设为 35, 流动相 ph 值调整为 3., 见图 2 优化色谱条件前后的色谱图见图 3 从图 3(a) 中可以看出,MN NMN 和 3-MT 不能被有效分离 ; 而从图 3(b) 中可以看出,MN NMN 和 3-MT 能有效分离且峰形较好保留时间 (min) ph 值图 2 不同 ph 值流动相对保留时间的影响

4 检验医学 217 年 11 月第 32 卷第 11 期 Laboratory Medicine November 217 Vol. 32 No a 1.64 MN b 注 a 优化前 b 优化后图 a MT.5 NMN b 注 a 3-MT b 3-MT-d4 优化色谱条件前后的色谱图 3-MT和3-MT-d4的色谱图图 MN NMN MT和内标3-MT-d4的色谱图 3-MT的保留时间为 min 3-MT-d4的保留时间为 min 见图4 图5为临床样本的色谱图该样本3-MT为13.8 ng/ml 保留时间为 min 2.3 方法学评价标准曲线 LC-MS/MS检测3-MT的线性范围为5 1 pg/ml 检测一系列低浓度标准品当3-MT为5 pg/ml时 CV<2% 因此最低定量下限为5 pg/ml 线性评估测定 pg/ml标准品回归方程是 Y=.998X r2= 准确度采用回收率评估准确度 3-MT回收率为97.1% 19.3% 12.1%±3.1% 符合回收率8% 12%的标准精密度高值 2 pg/ml 和低值 1 pg/ml 标准品的天间不精密度分别为 5.4%和3.2% 批间不精密度分别为6.6%和 6.4% 均<15% 能满足临床检测要求稳定性 3-MT在常温下稳定性较差在室温中容易降解因此样本需置4 冰浴送检见表3.5 3-MT 注 3-MT为13.8 ng/ml 图5 嗜铬细胞瘤患者检测3-MT的色谱图表3 稳定性试验结果 3-MT 反复冻融室温放置24 h 自动进样器放置36 h ng/ml % % % 讨论嗜铬细胞瘤是一种内分泌疾病大约占高血压人群的.5%.1% 由于嗜铬细胞瘤病

5 15 检验医学 217 年 11 月第 32 卷第 11 期 Laboratory Medicine,November 217,Vol. 32,No. 11 情凶险变化剧烈, 如果不及时治疗易引起心脑血管并发症, 进而导致死亡, 因此早期诊断和治疗非常重要 [8] 但早期的影像学诊断较难发现嗜铬细胞瘤, 尤其是发病于肾上腺以外的部位即使发现原发嗜铬细胞瘤, 也常常忽略肾上腺以外部位恶性肿瘤的转移嗜铬细胞瘤常见的转移部位包括主动脉旁膀胱内直肠后胸内等部位, 这些瘤体更难发现且对患者有更大的威 [5] 胁 EISENHOFER 等的研究结果显示嗜铬细胞瘤转移患者血浆 3-MT 比未转移患者高 4.7 倍, 并且是去甲肾上腺素和去甲氧基肾上腺素水平的 1.6~1.8 倍 3-MT 升高与琥珀酸脱氢酶 B 突变嗜铬细胞瘤转移和副神经结瘤的发生密切相关本研究建立了检测血浆游离 3 - M T 的 L C - M S / M S 方法并进行了方法学评价该法相较于传统的 H P L C 电化学法有诸多优势 [7],LC-MS/MS 需要的样本量更小, 只需要 3 8 μ L 血浆, 检测的敏感性和特异性更 [7] 高 PEITZSCH 等的研究结果显示 HPLC 电化学法与 LC-MS/MS 呈正相关 (r=.635), H P L C 电化学法的检测结果较高, 但在 [ 9 ] 低值时结果不可信 T W E N T Y M A N 等建立了同时检测 M N N M N 和 3 - M T 的 LC- MS/ MS 方法, 在实验过程中发现 3-MT 结果偏高引起这个现象的原因在于 MN MN-d3 NMN NMN-d3 都可能产生 3-MT 干扰离子对, 在只存在 MN 和 NMN 的纯品中发现 3-MT 的峰而采用本研究建立的 LC-MS/MS 同时检测 MN NMN 和 3-MT, 并未发现在 3-MT 的出峰位置有响应值, 且 3 种物质均能有效分离目前, 仍有一部分临床实验室在使用放射免疫法检测血浆游离 3-MT 由于 3-MT 的浓度非常低, 并且存在抗体的交叉反应, 因此免疫学方法的特异性不佳, 而且放射免疫法还存在放射污染等问题此外, 质谱方法可以做到同时检测多种分析物, 而免疫学方法每次只能检测单个分析物因此, 本研究建立的检测 3-MT 的 LC-MS/MS 方法可作为放射免疫法的替代方法本研究的不足之处在于入组例数较少, 在后续研究中我们将进一步扩大样本量来探讨 3-MT 的临床应用综上所述, 本研究建立了可靠的检测血浆 3-MT 的 LC-MS/MS 方法后续的研究目标是建立以血浆 3-MT 结果为基础的, 能适用于中国嗜铬细胞瘤患者的完整诊断策略 [1] [2] [3] 参考文献 M A N G E R W M,G I F F O R D R W. P h e o c h r o m o c y t o m a [J ]. J C l i n H y p e r t e n s (Greenwich),22,4(1): EISENHOFER G,HUYNH T T,HIROI M,et al. Understanding catecholamine metabolism as a guide to the biochemical diagnosis of pheochromocytoma[j]. Rev Endocr Metab Disord,21,2(3): PACAK K,EISENHOFER G,AHLMAN H,et al. Pheochromocytoma:recommendations for clinical practice from the First International Symposium. October 25[J]. Nat Clin Pract Endocrinol Metab, 27,3(2): [4] CH EN H,SI PPEL R S,O ' DOR ISIO M S,et [5] [6] [7] [8] [9] al. The North American Neuroendocrine Tumor Society consensus guideline for the diagnosis and management of neuroendocrine tumors: pheochromocytoma,paraganglioma,and medullary thyroid cancer[j]. Pancreas,21,39(6): EISENHOFER G,LENDERS J W,SIEGERT G,et al. Plasma methoxytyramine:a novel biomarker of metastatic pheochromocytoma and paraganglioma in relation to established risk factors of tumour size, location and SDHB mutation status[j]. Eur J Cancer, 212,48(11): GUPTA P,KHURANA M L,KHADGAWAT R, et al. Plasma free metanephrine,normetanephrine, and 3-methoxytyramine for the diagnosis of pheochromocytoma/paraganglioma[j]. Indian J Endocrinol Metab,215,19(5): PE I T Z S C H M,PR E J BI SZ A,K ROI B M, et al. Analysis of plasma 3-methoxytyramine, n o r m e t a n e p h r i n e a n d m e t a n e p h r i n e b y ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry:utility for diagnosis of dopamineproducing metastatic phaeochromocytoma[j]. Ann Clin Biochem,213,5(Pt 2): M A N G E R W M. A n o v e r v i e w o f pheochromocytoma:history,current concepts, vagaries,and diagnostic challenges[j]. Ann N Y Acad Sci,26,173:1-2. TWENTYMAN J M,CRADIC K W,SINGH R J,et al. Ionic cross talk can lead to overestimation of 3-methoxytyramine during quantification of metanephrines by mass spectrometry[j]. Clin Chem, 212,58(7): ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 龚晓霖 )

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.