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1 微生物学通报 Microbiology China Oct. 20, 2017, 44(10): DOI: /j.microbiol.china 研究报告两种 L- 天冬氨酸 α- 脱羧酶的表达与酶学性质分析陈夏林李由然顾正华丁重阳张梁石贵阳 (1. 江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室江苏无锡 ) (2. 江南大学生物工程学院江苏无锡 ) * 摘要 : 目的实现单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes) 和杰氏棒杆菌 (Corynebacterium jeikeium) L- 天冬氨酸 α- 脱羧酶基因在 Escherichia coli 中异源表达, 纯化重组蛋白并对其进行酶学性质分析方法依照 E. coli 的密码子偏好性优化来源于 L. monocytotogens 和 C. jeikeium 的 pand 基因序列人工合成后以此构建表达载体 pet28a(+)-pand L.m 和 pet28a(+)-pand C.j, 转化 E. coli BL21(DE3), 实现 pand L.m 和 pand C.j 基因的异源表达利用亲和层析纯化获得携带组氨酸标签的纯酶后进行酶学性质研究, 并考察底物对酶反应的影响结果重组菌蛋白电泳分析结果表明, 重组酶 PanD L.m 和 PanD C.j 均有自加工功能, 裂解后形成了 α 亚基和 β 亚基重组酶比酶活分别为 8.9 U/mg 和 11.8 U/mg 两种酶的最适反应温度均为 60 C, 最适 ph 分别为 7.0 和 6.0, 它们都在 C, 酸性条件下较稳定与目前研究最多的谷氨酸棒杆菌 (Corynebacterium glutamicum) 来源的 PanD C.g 相比,PanD L.m 受底物天冬氨酸的抑制作用较小结论 PanD L.m 和 PanD C.j 可在高温酸性条件下特异性转化 L- 天冬氨酸生成 β- 丙氨酸, 其中 PanD L.m 受底物的抑制作用较小, 具有一定的工业应用潜力关键词 :L- 天冬氨酸 α- 脱羧酶,β- 丙氨酸, 单核增生李斯特菌, 杰氏棒杆菌, 酶学性质 Expression and characterization of two L-aspartate alpha-decarboxylases CHEN Xia-Lin LI You-Ran GU Zheng-Hua DING Zhong-Yang ZHANG Liang SHI Gui-Yang * (1. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu , China) (2. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu , China) Abstract: [Objective] In this study, two L-aspartate α-decarboxylase genes (pand) from Listeria monocytogenes (pand L.m ) and Corynebacterium jeikeium (pand C.j ) were expressed in Escherichia coli, respectively, and the recombinant enzymes were purified and characterized. [Methods] The pand Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No ); The 13th Five-Year National Key Program for Technology Research and Development of China Plan Grant (No. 2016YFD ) *Corresponding author: Tel: ; gyshi@jiangnan.edu.cn Received: January 04, 2017; Accepted: March 22, 2017; Published online ( March 24, 2017 基金项目 : 国家自然科学基金青年基金项目 (No ); 十三五国家重点研发计划项目 (No. 2016YFD ) * 通讯作者 :Tel: ; gyshi@jiangnan.edu.cn 收稿日期 : ; 接受日期 : ; 优先数字出版日期 (

2 2338 微生物学通报 Microbiol. China 2017, Vol.44, No.10 genes from L. monocytogenes and C. jeikeium were synthesized and inserted into pet28a(+) to obtain expression plasmids, which was then transformed into E. coli BL21(DE3). PanD L.m and PanD C.j were functionally expressed and the recombinant enzymes were purified by HisTrap TM affinity chromatography. Their catalytic properties were characterized and the effects of substrate concentration on enzymatic conversion were studied. [Results] Those α and β subunits were detected by Tricine-SDS-PAGE, indicating that both of the PanDs were processed by self-cleavage. The specific activities were 8.9 U/mg for PanD L.m and 11.8 U/mg for PanD C.j. They exhibited the same optimal temperature at 60 C, while they possessed different optimal ph at 7.0 and 6.0, respectively. Both the enzymes were stable at the condition of C, and ph Compared with the most studied PanD from C. glutamicum, the substrate inhibition effect of the PanD L.m was significantly less. [Conclusion] Under the high temperature and acidic conditions, PanD L.m as well as PanD C.j could specifically transform L-aspartic to β-alanine. PanD L.m could be more appropriate for industrial application because of less substrate inhibition. Keywords: L-aspartate α-decarboxylase, β-alanine, Listeria monocytogenes, Corynebacterium jeikeium, Enzymatic properties L- 天冬氨酸 α- 脱羧酶 (L-aspartate-α-decarboxylase, EC ,ADC,PanD), 又称 L- 天冬氨酸 1- 脱羧酶, 可催化 L- 天冬氨酸脱掉 α 羧基生成 β- 丙氨酸 [1-3] β- 丙氨酸是生物体内合成泛酸的重要前体物质, 是自然界中唯一存在的 β 型氨基酸, 是一种非蛋白氨基酸 β- 丙氨酸及其衍生物广泛应用于医药美容食品饲料及化工等领域, 市场需求量呈日渐上升趋势 [4] 相较于国内外目前采用的化学合成法 [5-6], 利用 PanD 生物转化 L- 天冬氨酸生产 β- 丙氨酸具有工艺简单纯化方便绿色无污染的特点, 具有十分明显的经济和社会效益 [7] PanD 主要存在于细菌古细菌放线菌等低等生物中, 可分为丙酮酰基团依赖型和磷酸吡哆醛依赖型两类与后者相比, 前者具有明显的优势, 其催化能力依赖自加工形成的丙酮酰基团, 无需外源辅助因子, 且催化特异性高, 因此更具工业应用前景 PanD 合成时, 最初转录翻译成无活性的原酶, 随后在 Gly24-Ser25 处发生裂解, 水解生成 N 端带有丙酮酰基团的 α 亚基和 C 端带有羟基的 β 亚基, 该丙酮酰基团即为酶催化的关键位点 [8-9] 酶转化反应中最关键的是生物催化剂 ( 酶 ) 的开发, 微生物的多样性为生物转化提供了更广阔的发展空间 NCBI 数据库中已报道的 pand 基因有 761 种, 但目前的研究主要集中在大肠杆菌 (Escherichia coli) [10] 结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis) [11] 幽门螺杆菌 (Helicobacter pylori) [12] 谷氨酸棒杆菌 (Corynebacterium glutamicum) [13] 钝齿棒杆菌 (Corynebacterium crenatum) [14] 和枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) [7], 而实际适合开发酶制剂的只有后 3 种其中 PanD B.s 的酶活最高为 8.4 U/mg, PanD C.g 酶学性质的相关报道最多, 最适反应温度为 55 C, 最适 ph 为 6.0, 在低于 37 C,pH 稳定性较好现有的 PanD 在催化过程中都存在一定程度的底物依赖性失活现象 [10,15], 这是限制其工业应用的关键性因素已有的研究中, 尝试通过定点突变 [16] [10] 固定化作用改变酶的性能, 但未见显著成果因此挖掘新的 pand 基因来源并研究其特性对酶法合成 β- 丙氨酸具有重要的研究意义和工业价值本文选择单核增生李斯特菌 (Listeria monocytogenes) 和杰氏棒杆菌 (Corynebacterium jeikeium) 来源的 pand 基因为研究对象, 首次实现了这两个基因的异源表达, 并对其酶学性质及底物抑制情况进行了比较分析, 为生物转化生产 β- 丙氨酸的工业应用提供了科学依据 1 材料与方法 1.1 材料目的基因菌种及质粒 : 研究中所用 pand 基因由苏州金唯智生物科技有限公司合成 ;E. coli BL21(DE3) E. coli BL21(DE3)-panD C.g ( 携带有 C.

3 陈夏林等 : 两种 L- 天冬氨酸 α- 脱羧酶的表达与酶学性质分析 2339 glutamicum 来源的 pand 基因 ) 和质粒 pet-28a(+) 均为本实验室保藏主要试剂仪器和培养基 : 限制性内切酶 Nde I Hind Ⅲ 标准分子量蛋白购自 Fermentas 公司 ;T4 DNA 连接酶 DNA marker 购自 TaKaRa 公司 ; 卡那霉素购自生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司 ; 质粒小量提取试剂盒胶回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司 ;Sepharose His Trap HP 购自美国 GenScript 公司 ; 其他试剂为国产分析纯核酸电泳仪 Bio-Rad 525BR 蛋白电泳仪购自美国 Bio-Rad 公司 ; 蛋白纯化仪 AKTA Avant 25 购自 GE Healthcare 公司 ; 高效液相色谱仪 Agilent 1260 购自美国 Agilent 公司 LB 和 TB 培养基见参考文献 [13] 1.2 方法重组菌 E. coli DE3/pET28a(+)-panD 的构建 : 从 NCBI 上查阅并筛选获得 L. monocytogenes 和 C. jeikeium 来源的 pand 序列, 由苏州金唯智生物科技有限公司合成基因序列按照 E. coli 密码子偏好性进行优化,5 端添加 CATATG ( 引入酶切位点 Nde I),3 端去除终止密码子后加 AATTGC ( 引入酶切位点 Hind III), 在蛋白 N 端和 C 端加上 His-tag 基因合成后连接载体 puc57-simple, 获得 puc57-pand 提取 puc57-pand 质粒, 用 Nde I 和 Hind III 双酶切, 经琼脂糖凝胶电泳鉴定回收纯化后, 用 T4 DNA 连接酶连接到同样经过 Nde I 和 Hind III 双酶切的 pet28a(+) 载体上, 构建重组表达载体 pet28a(+)-pand, 将重组质粒转化到 E. coli BL21(DE3) 感受态细胞中, 选取卡那平板上阳性转化子提取质粒酶切验证, 得到重组菌 E. coli BL21(DE3)/pET28a(+)-panD, 并保存于甘油管中重组蛋白的诱导表达 : 从甘油管中接 10 μl 菌体至 20 ml 含 50 mg/l 卡那霉素的 LB 培养基中, 37 C 200 r/min 培养 8 h, 取 2 ml 菌液转接至 50 ml 含 50 mg/l 卡那霉素的 TB 培养基中,37 C 200 r/min 培养,2 h 后加入 25 μl 异丙基 -β-d- 硫代半乳糖苷 (IPTG,1 mol/l),20 C 200 r/min 培养 16 h 发酵结束后收集菌体, 超声破碎, 通过 Tricine-SDS-PAGE 分析鉴定重组蛋白 Tricine-SDS-PAGE 分析方法参见文献 [17] 重组蛋白的纯化 : 用结合缓冲液 A (20 mmol/l Na 2 HPO 4 12H 2 O 20 mmol/l NaH 2 PO 4 2H 2 O 500 mmol/l NaCl 100 mmol/l 咪唑,pH 7.4) 洗涤菌体 2 次, 加入 5 ml 结合缓冲液 A, 振荡混匀后测 OD 600, 稀释 OD 至 10 后破碎, 破 1 s 停 2 s, 破碎时间 5 min, 破碎液于 4 C r/min 离心 20 min, 取上清, 即为粗酶液 Sepharose His Trap HP 用结合缓冲液 A 平衡后上样, 再平衡, 洗脱缓冲液 B (20 mmol/l Na 2 HPO 4 12H 2 O 20 mmol/l NaH 2 PO 4 2H 2 O 500 mmol/l NaCl 500 mmol/l 咪唑,pH 7.4) 洗脱, 收集的洗脱液为纯酶液, 用 Tricine-SDS-PAGE 分析采用 Bradford 法测定蛋白质浓度酶活的测定 : 酶活定义 : 在 37 C,pH 7.0 的条件下, 每分钟转化产生 1 μmol β- 丙氨酸所需要的酶量为一个酶活单位 U (μmol/min) 酶活的测定方法 :2.5 ml 转化体系中, 将 0.5 mg 的酶与磷酸缓冲液 (20 mmol/l Na 2 HPO 4 12H 2 O, 20 mmol/l NaH 2 PO 4 2H 2 O,pH 7.0) 混合,37 C 预热 20 min, 加入同样预热过的终浓度 100 mmol/l 的 L- 天冬氨酸 (ph 7.0,NaOH 溶解 ) 进行转化反应, 反应 20 min, 煮沸 20 min 灭活,1 000 r/min 离心 20 min, 取上清保存, 用邻苯二甲醛 (OPA) 衍生 β- 丙氨酸, 使用 HPLC 检测衍生后 β- 丙氨酸含量 [18] 重组酶最适温度及热稳定性测定 : 将重组酶分别置于 C 下反应 20 min, 测定酶活, 以确定最适反应温度将酶分别在以上温度放置 12 h, 然后在 37 C 条件下测定酶活, 比较酶在不同温度条件下的稳定性重组酶最适 ph 及 ph 稳定性 : 将 0.5 mg 重组酶分别加入 20 mmol/l ph 的柠檬酸 - 柠檬酸钠缓冲液 20 mmol/l ph 的磷酸氢二钠 - 磷酸二氢钠缓冲液及 20 mmol/l ph 的 Tris- 盐酸缓冲液中, 再加入 166 μl

2340 微生物学通报 Microbiol. China 2017, Vol.44, No.10 的 L- 天冬氨酸 (200 g/l,ph 7.0,NaOH 溶解 ),37 C 反应 20 min, 测酶活, 以确定最适反应 ph 将酶分别置于以上缓冲液中,37 C 放置 12 h, 然后测酶活, 比较酶在不同 ph 条件下的稳定性 1.2.7 底物 L- 天冬氨酸对 PanD 的抑制作用 : 实验组取 5 mg 酶 (PanD) 加入到含有 100 g/l 的 L- 天冬氨酸和 20 mmol/l 的磷酸缓冲液 (ph 7.

4 2340 微生物学通报 Microbiol. China 2017, Vol.44, No.10 的 L- 天冬氨酸 (200 g/l,ph 7.0,NaOH 溶解 ),37 C 反应 20 min, 测酶活, 以确定最适反应 ph 将酶分别置于以上缓冲液中,37 C 放置 12 h, 然后测酶活, 比较酶在不同 ph 条件下的稳定性底物 L- 天冬氨酸对 PanD 的抑制作用 : 实验组取 5 mg 酶 (PanD) 加入到含有 100 g/l 的 L- 天冬氨酸和 20 mmol/l 的磷酸缓冲液 (ph 7.0) 的 5 ml 反应体系中,37 C 反应 1 h, 用 Ni 柱回收酶, 取回收后的酶测酶活, 对照组底物浓度为 0 g/l 重组酶的转化实验 : 用 ph 7.0 磷酸缓冲液配制终浓度为 100 mmol/l 的 L- 天冬氨酸底物 50 ml, 加入 10 mg 的重组酶,37 C 200 r/min 反应 24 h, 测 β- 丙氨酸转化率 2 结果与分析 2.1 PanD 氨基酸序列分析及密码子优化研究中的 PanD C.j 和 PanD L.m 氨基酸序列和目前报道较多的 PanD 的氨基酸序列进行比对, 从图 1 可以看出, 这几个氨基酸序列相似程度较低, 仅有 59.91%, 其中严格保守的残基有 Lys9 His11 Arg12 Thr16 Ala18 Leu20 Tyr22 Gly24 Ser25 Ile28 Asp29 Ile46 Asn51 Gly52 Arg54 Thr57 Tyr58 Ile60 Ile69 Asn71 Gly72 Ala73 Ala74 Ala75 Gly81 Asp82 Val84 Ile85 和 Asn111, 高度保守位点较多这些酶的自加工位点均为 Gly24-Ser25 键, 有研究表明 Arg3 Arg54 Thr57 Tyr58 可能与 PanD 自加工和催化活性有关 [19], Arg54 可能与 PanD 的底物特异性有关,Lys9 可能对底物的 α 羧基的去质子化起到保护作用 PanD 的来源不同, 其 PanD 氨基酸序列差异也较大, 这可能是导致其酶活与酶学性质差异的原因根据 E. coli 所偏爱的密码子对 pand L.m 和 pand C.j 基因进行密码子优化,(G+C)% 含量分别由 45.7% 和 49.3% 变成 54.18% 和 54.67%, 氨基酸未发生改变人工合成的序列经克隆连接载体 puc57-simple, 获得 puc57-pand 2.2 重组菌的构建将 puc57-pand 质粒用 Nde I 和 Hind III 双酶切, 经琼脂糖凝胶电泳鉴定回收纯化后获得 pand 序列, 长度均在 400 bp 左右, 与理论值一致将目的基因序列连接到 pet28a(+) T7 启动子下游, 获得图 1 8 种不同来源的 PanD 氨基酸序列对比 Figure 1 Amino acid sequence alignment of 8 PanDs 注 :8 种 PanD 的 GenBank 登录号 :M. tuberculosis (NP_ ) C. jeikeium (WP_ ) C. glutamicum (NP_ ) H. pylori (NP_ ) B. subtilis (NP_ ) L. monocytogenes (NP_ ) S. enterica (NP_ ) E. coli (NP_ ); 严格保守残基用黑色框出, 自加工位点用三角标出. Note: Reference sequence of 8 PanDs: M. tuberculosis (NP_ ), C. jeikeium (WP_ ), C. glutamicum (NP_ ), H. pylori (NP_ ), B. subtilis (NP_ ), L. monocytogenes (NP_ ), S. enterica (NP_ ), E. coli (NP_ ); Strictly conserved residues are boxed in black and the self-processing site is marked by a triangle.

陈夏林等 : 两种 L- 天冬氨酸 α- 脱羧酶的表达与酶学性质分析 2341 重组质粒 pet28a(+)-pand, 将上述重组质粒转化到 E. coli BL21(DE3) 感受态细胞中, 获得重组菌 E. coli BL21(DE3)/pET28a(+)-panD 双酶切验证, 均得到了 400 bp 左右的目的条带 ( 图 2), 说明外源基因已经成功连接到表达载体上 2.

g 相同, 均不需要孵育, 可自加工裂解成 α 亚基与 β 亚基破碎得到的上清液, 用 His Trap HP 镍柱纯化 Tricine-SDS-PAGE 电泳验证结果如图 3 所示, 均获得了较纯的目的蛋白, 可用于进一步研究重组酶纯酶 PanD L.m 和 PanD C.j 在常规的酶活测定条件下 (37 C,pH 7.0), 比酶活分别为 8.9 U/mg 和 11.

m 和 pet28a(+)-pand C.j. Note: M1: DL15000 DNA marker; M2: DL2000 DNA marker; 1 2: Recombinant plasmid pet28a(+)-pand L.m and pet28a(+)-pand C.j digested by Nde I and Hind III. 图 3 重组菌 E.

m BL21(DE3)/pET28a(+)-panD C.j 和 BL21(DE3)/pET28a(+) 细胞破碎上清 ;4,5: 纯化后的重组蛋白 PanD L.m 和 PanD C.j. Note: M: Standard protein marker; 1 3: The centrifugated supernatant of the recombinant BL21(DE3)/pET28a(+)-panD L.

5 U/mg 随着温度的升高,PanD 酶活均呈现先升高后降低的趋势各温度下 PanD C.j 酶活均比 PanD L.m 高, 对温度变化也更敏感从重组酶的热稳定性实验结果图 4B 可以看出, 酶在设定的温度条件下放置 12 h, 酶活均有一定程度的损失, 温度越高酶活损失越快 50 65 C 范围内,PanD L.m 较 PanD C.

5 陈夏林等 : 两种 L- 天冬氨酸 α- 脱羧酶的表达与酶学性质分析 2341 重组质粒 pet28a(+)-pand, 将上述重组质粒转化到 E. coli BL21(DE3) 感受态细胞中, 获得重组菌 E. coli BL21(DE3)/pET28a(+)-panD 双酶切验证, 均得到了 400 bp 左右的目的条带 ( 图 2), 说明外源基因已经成功连接到表达载体上 2.3 重组酶的诱导表达与纯化重组菌 E. coli BL21(DE3)/pET28a(+)-panD 经 IPTG 诱导 16 h 后, 超声破碎, 离心后取上清, 经 Tricine-SDS-PAGE 电泳检验, 图 3 显示, 重组菌均成功表达了异源的 PanD, 条带分析结果显示, 表达量均达到 60% 以上这两组重组酶的自剪切类型与 PanD C.g 相同, 均不需要孵育, 可自加工裂解成 α 亚基与 β 亚基破碎得到的上清液, 用 His Trap HP 镍柱纯化 Tricine-SDS-PAGE 电泳验证结果如图 3 所示, 均获得了较纯的目的蛋白, 可用于进一步研究重组酶纯酶 PanD L.m 和 PanD C.j 在常规的酶活测定条件下 (37 C,pH 7.0), 比酶活分别为 8.9 U/mg 和 11.8 U/mg 图 2 重组载体 pet28a(+)-pand 酶切验证 Figure 2 The enzymatic digestion of pet28a(+)-pand 注 :M1:DL15000 DNA marker;m2:dl2000 DNA marker; 1 2:Nde I 和 Hind III 双酶切重组载体 pet28a(+)-pand L.m 和 pet28a(+)-pand C.j. Note: M1: DL15000 DNA marker; M2: DL2000 DNA marker; 1 2: Recombinant plasmid pet28a(+)-pand L.m and pet28a(+)-pand C.j digested by Nde I and Hind III. 图 3 重组菌 E. coli BL21(DE3)/pET28a(+)-panD 表达产物的 Tricine-SDS-PAGE 电泳分析 Figure 3 The Tricine-SDS-PAGE analysis of expression product in recombinant strain 注 :M: 标准蛋白 Marker;1 3: 重组菌 BL21(DE3)/pET28a(+)-panD L.m BL21(DE3)/pET28a(+)-panD C.j 和 BL21(DE3)/pET28a(+) 细胞破碎上清 ;4,5: 纯化后的重组蛋白 PanD L.m 和 PanD C.j. Note: M: Standard protein marker; 1 3: The centrifugated supernatant of the recombinant BL21(DE3)/pET28a(+)-panD L.m, BL21(DE3)/pET28a(+)-panD C.j and BL21(DE3)/pET28a(+); 4, 5: Purified PanD L.m and PanD C.j. 2.4 重组酶最适温度及热稳定性温度对两种 PanD 的酶活影响如图 4A 所示, 两者都在 60 C 时达到最高酶活, 分别为 10.9 U/mg 和 14.5 U/mg 随着温度的升高,PanD 酶活均呈现先升高后降低的趋势各温度下 PanD C.j 酶活均比 PanD L.m 高, 对温度变化也更敏感从重组酶的热稳定性实验结果图 4B 可以看出, 酶在设定的温度条件下放置 12 h, 酶活均有一定程度的损失, 温度越高酶活损失越快 C 范围内,PanD L.m 较 PanD C.j 稳定, 当温度达到 80 C, 两者的酶活基本完全丧失 2.5 重组酶最适 ph 及 ph 稳定性 PanD L.m 和 PanD C.j 的最适 ph 和 ph 稳定性实验结果如图 5A 和图 5B 所示, 随着 ph 的增加, 两者的酶活均呈现先增后降的趋势, 都在酸性条件下比较稳定 PanD L.m 适合在中性或酸性环境下作用, 最适 ph 为 7.0, 当 ph 大于 7.5 时, 酶活迅速降低 PanD C.j 可以在较宽的 ph 范围条件下作用, 最适 ph 为 ph 6.0, 此时稳定性也最好, 酶活仅损失 21%

6 2342 微生物学通报 Microbiol. China 2017, Vol.44, No.10 Figure 4 图 4 温度对酶活力的影响 (A) 及酶的热稳定性 (B) Effect of reaction temperature on PanD activity (A) and thermal stability of the enzyme (B) Figure 5 图 5 ph 对酶活力的影响 (A) 和酶的 ph 稳定性 (B) Effect of reaction ph on PanD activity (A) and ph stability of the enzyme (B) 2.6 底物对 PanD 的抑制作用丙酮酰依赖型 PanD 在有底物 L- 天冬氨酸存在时, 催化位点丙酮酰基团与磷酸吡哆醛辅因子作用相似, 可与底物共价结合形成席夫碱 [2], 促进底物脱羧, 最终产生 β- 丙氨酸, 但此过程中酶会发生自杀式的转氨作用, 发生底物依赖性失活现象 [10,15] 本研究中 PanD 酶与底物反应后, 通过 Ni 柱再次纯化回收 PanD 酶, 并去除 L- 天冬氨酸和反应产生的 β- 丙氨酸对比 PanD L.m PanD C.j 和目前研究较多的 PanD C.g 与底物反应前后酶活 ( 图 6), 发现酶与底物反应后皆呈现出不同程度的失活现象, 分别损失了 11% 43% 和 16%, 其中底物对 PanD L.m 的抑制作用最弱图 6 底物对酶活力的影响 Figure 6 Effect of substrate on PanDs activity

7 陈夏林等 : 两种 L- 天冬氨酸 α- 脱羧酶的表达与酶学性质分析重组酶的转化实验转化反应过程中每隔 1 h 取样, 测定底物的转化率, 结果如图 7 所示不同目的基因来源的 PanD 对 L- 天冬氨酸的转化结果不同反应前 4 h, 底物的转化率均迅速增长, 但随后底物转化率的增长变得缓慢, 这可能与底物对酶的不可逆抑制作用有关反应 24 h 时,PanD L.m PanD C.j 和 PanD C.g 三者对底物的转化率分别为 67.7% 82.2% 和 58.0%, PanD L.m 和 PanD C.j 对底物的转化率明显高于 PanD C.g, 值得进一步研究应用于工业生产 3 结论与讨论 PanD 作为泛酸合成途径中的重要调控酶, 可作为一些病原微生物的药物靶细胞, 如 H. pylori 和 M. tuberculosis, 是一种潜在的抗菌剂 [2,20] 在工业领域,PanD 主要用于特异性催化 L- 天冬氨酸生成 β- 丙氨酸, 可将从多肽藻青素获得的大量 L- 天冬氨酸转化成更高价值的 β- 丙氨酸, 还可用于手性拆分制备 D- 天冬氨酸和 β- 丙氨酸 [10,21] 目前有关 PanD 的研究主要集中于少数几种来源的 PanD 酶的结构解析和自剪切机理方面, 很少关注 PanD 的酶学性质, 而更多来源的 PanD 的酶学特性尚不清楚, 有待研究者的开发本研究选择 L. monocytogenes 和 C. jeikeium 来源的 PanD 在 E. coli 中表达, 并对酶学性质进行了初步分析 PanD L.m 和 PanD C.j 在普通测定条件下, 图 7 L- 天冬氨酸的转化率 Figure 7 The conversion ratio of L-Asp 酶活分别达到了 8.9 U/mg 和 11.8 U/mg, 高于现有报道 PanD 酶活 [7] 两种酶催化反应适宜的温度及 ph 范围与现有的 C. glutamicum 来源的 PanD 无明显不同, 对底物的转化率分别为 67.7% 和 82.2%, 明显高于 PanD C.g, 为工业化应用奠定了基础在实验过程中, 我们发现这两种重组酶的热稳定性并不是很好, 其中 PanD C.j 对温度尤为敏感, 后期可能需要优化反应条件与反应体系, 或从分子水平上对其进行改造, 提高酶反应的稳定性同时, 我们也发现 PanD L.m 和 PanD C.j 与其他丙酮酰依赖型 PanD 相同, 在转化过程中也存在不同程度的底物依赖性失活现象虽然 PanD L.m 酶活损失程度相对较低, 有助于提升 β-ala 生物转化的效率, 但是目前这种不可逆的失活现象的机理研究并不透彻, 需要深入的研究, 从根本上解决 PanD 的底物依赖性失活问题, 这对于 PanD 转化 L- 天冬氨酸生产 β- 丙氨酸具有重要的意义参考文献 [1] Gopalan G, Chopra S, Ranganathan A, et al. Crystal structure of uncleaved L-aspartate-α-decarboxylase from Mycobacterium tuberculosis[j]. Proteins, 2006, 65(4): [2] Lee BI, Suh SW. Crystal structure of the Schiff base intermediate prior to decarboxylation in the catalytic cycle of aspartate α-decarboxylase[j]. Journal of Molecular Biology, 2004, 340(1): 1-7 [3] Cronaa JE Jr. β-alanine synthesis in Escherichia coli[j]. Journal of Bacteriology, 1980, 141(3): [4] Luo JX, Xue JP, Shen YC. Synthesis and application of β-alanine[j]. Amino Acids & Biotic Resources, 2005, 27(1): (in Chinese) 罗积杏, 薛建萍, 沈寅初. β- 氨基丙酸的合成与应用 [J]. 氨基酸和生物资源, 2005, 27(1): [5] Huang XM, Zhang ZB, Hong M, et al. Study on solation and purification of beta-alanine by biosythesis[j]. Amino Acids & Biotic Resources, 2008, 30(3): (in Chinese) 黄秀敏, 张正波, 洪敏, 等. 生物法合成 β- 丙氨酸的分离纯化工艺研究 [J]. 氨基酸和生物资源, 2008, 30(3): [6] Zhang ZB, Gao LJ, Qiu JP. Determination of β-alanine in biocatalysis process[j]. Bulletin of Science and Technology, 2008, 24(6): (in Chinese) 张正波, 高丽娟, 裘娟萍. 生物转化体系中 β- 丙氨酸含量测定方法建立与优化 [J]. 科技通报, 2008, 24(6): [7] Deng SY, Zhang JL, Cai Z, et al. Characterization of L-aspartate-α-decarboxylase from Bacillus subtilis[j]. Chinese

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材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌