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椰岑宓
5 years ago
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1 蛋白质复合物的纯化免付费热线电话

2 蛋白质复合物的纯化内容简介蛋白质 - 蛋白质相互作用纯化的困难分析技术纯化 ng to µg 规模 µg to mg 规模结论

(2004) Science 303, 540-543 Number of proteins involved in interactions

3 简介蛋白质 - 蛋白质复合物线虫中找出 5000 相互作用了解复合物和相互作用的功能可能导致药物的发现 Protein-protein interactions in C. elegans, Interactome Li, S. et al. (2004) Science 303, Number of proteins involved in interactions per cell compartments in yeast Schwikowski et. al. (2000) Nature Biotech. Vol 18, p /

简介蛋白质复合物多于两个蛋白质的组合 10-100 蛋白质执行主要的细胞功能讯号传导, 细胞周期调控, 转译 2/3 原核细胞的蛋白质和 4/5

4 简介蛋白质复合物多于两个蛋白质的组合蛋白质执行主要的细胞功能讯号传导, 细胞周期调控, 转译 2/3 原核细胞的蛋白质和 4/5 真核细胞的蛋白质以复合物形式存在 A model of transcription mediator complex C from Saccharomyces cerevisiae 4/

染色质组装 Chromatin assembly RNA 核小体 Nucleosome 多聚腺苷复合物

5 简介蛋白质复合物和功能剪接去除内含子 Intron 剪接体 Spliceosome 蛋白质降解蛋白酶体 Proteasome RNA 合成和调控外切酶体复合物 Exosome complex 染色质组装 Chromatin assembly RNA 核小体 Nucleosome 多聚腺苷复合物 Polyadenylation complex 核糖体 Ribosomes 伴侣蛋白 Chaperonins 5/

6 简介纯化复合物的困难 RNA 性质大分子困难结合载量低钻不进层析凝胶孔很多蛋白质低含量相互作用低稳定性找出适合的诱饵蛋白很难一起表达假阳性样品体积很大产率很低失去构成部分 ( 假阴性 ) 失去活性需要添加剂使用温和条件 6/

7 简介分析和鉴定胰酶酶解质谱 LC-MS/MS, MALDI MS, ESI-MS 1D SDS-PAGE 2D 电泳从数据库鉴定蛋白质胰酶酶解 7/

8 简介分析技术目标大小蛋白质 - 蛋白质相互作用体外蛋白质 - 蛋白质相互作用体外和原位结构技术分子筛散射光谱超离质谱电泳表面等离子共振 -Biacore 蛋白芯片 Far-Western blotting 电子和 Confocal 显微镜 FRET ( 荧光共振能量转移检测系统 ) Y2H - 酵母双杂交系统多顺反子表达 Polycistronic expression 噬菌体展示 In-cell 系统 X- 射线晶体学,NMR Dafforn, T., (2007) Acta Crys. D63, /

9 复合物的纯化 1. ng to µg 规模为了质谱鉴定蛋白质 2. µg to mg 规模为了结构 / 功能研究

10 ng - µg 规模什么是诱饵蛋白? 蛋白质复合物诱饵诱饵诱饵抗体标记抗体 10 /

11 ng - µg 规模 ng - µg 规模的纯化结合试验 Pull-down assays 1. 免疫共沉淀 2. 亲和结合 GST 结合试验串联亲和纯化 (TAP) 11 /

12 ng - µg 规模免疫共沉淀传统方式交联诱饵蛋白质 + + Protein A/G Sepharose 诱饵蛋白质 ProteinA/G Sepharose 抗体离心离心 SDS-PAGE 使用含 50 mm DMP (Dimethyl pimelimidate dihydrochloride) 的 200 mm 三乙醇胺, ph /

13 ng - µg 规模 GST 结合试验谷胱甘肽 s- 转移酶对照试验 Glutathione Sepharose 细胞裂解液细胞裂解液 GST- 诱饵对照 SDS-PAGE 13 /

14 ng - µg 规模串联亲和层析 (TAP) 钙调素结合肽 TEV 酶切位点 TEV 酶切 IgG Sepharose 在 Ca ++ 离子下结合用 EGTA 洗脱天然表达特异性增加减少假阳性条件温和快速结合的标记 Rigaut et al., (1999) Nature Biotechnology 17, /

15 ng - µg 规模串联亲和层析修饰高级真核细胞表达系统利用 RNAi 压制内源性诱饵蛋白质 (Forter et.. al., (2003) Nat Biotech, Vol 21 p 89-92) 使用 Protein G Streptavidin binding peptide 获得多达 10 倍的产量 (Burckstummer et. al., (2006) Nat Met, 3, ) 植物拟南芥鼻病毒 3C 蛋白酶能在低温下保持活性在第二步使用 His 或 myc 标记 (Rubio et al., (2005) Plant Journal 41 (5), ) 流程的修饰做出适应随后分析技术的改变, 例如 : 分析完整复合物的 ESI-MS 15 /

10/300 GL 400 mm 醋酸氨 200 µg complex 超离 3

16 ng - µg 规模外切体复合物 ; 两步纯化 20 L 酵母细胞培养裂解液 IgG Sepharose 1 ml 柱分子筛 Superdex /300 GL 400 mm 醋酸氨 200 µg complex 超离 3 µg/µl -10 不同亚单元 -Has 外切核酸酶的活性 254 nm 280 nm 完整复合物的纳升电喷雾质谱 ESI-MS 作用图 H. Hernandex et al., (2006) EMBO reports, Vol 7, no /

17 ng to µg 规模结论 : ng - µg 纯化规模方法免疫共沉淀亲和结合优点无需表达如果有抗体, 可以很迅速 Rapid if antibody is available 通用可纯化低含量蛋白质复合物缺点不通用需要特异抗体标记可能影响结果和内源性复合物的竞争 17 /

18 复合物的纯化 1. ng - µg 规模为了通过质谱鉴定蛋白质 For identifying proteins by mass spectrometry 2. µg - mg 规模为了结构 / 功能研究

19 µg mg 规模 µg mg 规模的纯化非重组重组天然复合物未标记复合物标记复合物亲和层析分子筛离子交换疏水层析 19 /

20 µg mg 规模非重组 20S 蛋白酶体复合物控制蛋白质的降解 14 不同蛋白质的复合物 4 个环每一个环七聚物每一个蛋白质 kda MW: 700 kda Schmidtke et al., (1997) J Mol Biol, 268, /

Mono Q Hydroxyapatite Phenyl Superose Superose 6 13S

21 非重组蛋白酶体前体的多步纯化从一个人类细胞的萃取物从 DEAE Sepharose 的 0.5 M KCl 洗脱物蔗糖梯度离心 13S 16S 20S Heparin Sepharose 20S 蛋白酶体 Mono Q Hydroxyapatite Phenyl Superose Superose 6 13S 蛋白酶体前体 16S 蛋白酶体前体 Schmidtke et al., (1997) J. Mol. Biol. 268, /

22 µg mg 规模 µg mg 规模的纯化非重组重组天然复合物未标记复合物标记复合物亲和层析分子筛离子交换疏水层析 22 /

23 µg mg 规模重组诱饵蛋白非标记蛋白质标记蛋白质共同表达载体 B 诱饵 ait RNA/DNA 细胞萃取纯化和体外 reconstitution 纯化和体外 reconstitution 体内组装体外组装亲和纯化分子筛分子筛分子筛标记 / 非标记蛋白质 ; 共同裂解分子筛 23 /

24 诱饵蛋白标记诱饵蛋白和 pre mrna (1) 体外组装剪切体 Splicesome 噬菌体外壳蛋白, MS2 以 MBP 标记 ~145 不同蛋白质 mrna A schematic figure for spliceosome 5 小 nuclear RNAs (snrnas) 发夹核糖核蛋白复合物从 mrna 前体去除内含子 Zhou et al., (2002) PNAS vol 99, no 19, p /

25 诱饵蛋白剪切体的纯化和 pre mrna (2) 的体外组装 + 分子筛 : Sephacryl TM S-500 放射性标记细胞核萃取 ~145 不同蛋白质亲和层析 ~145 不同蛋白质 Zhou et al., (2002) Nature 419, 大小 : nm

26 重组非标记蛋白质体外 reconstitution (1) 核小体组蛋白 DNA DNA 包围着八位体核小体包在染色质纤维中染色质中的重复单元 146 碱基 DNA 包围着组蛋白八位体 26 /

27 非标记蛋白质非标记蛋白质的复性体外 reconstitution (2) 在大肠杆菌中以包涵体形式表达每一个组蛋白溶解在变形条件下做分子筛和阴离子交换混合和复性成八位体分子筛在 2.8 Å 分辨率下的核小体晶体结构加 146 bp DNA 组装成核小体 Luger et al., (1997) Nature 389, /

28 重组标记蛋白质 - 体外 reconstitution (1) 调节因子复合物 (RFX sub-complex) 3 蛋白质, RFX5, RFXAP, RFXB DNA 结合需要和激活 MHCII 基因 RFX5-5 domains 齐聚 Oligomerization domain DNA- 结合 domain 激活 domain 螺旋 domain 富含脯氨酸 domain Major Histocompatibiliy Class II (MHCII) 增强子 Garvie et. al., (2007) Biochemistry, 46, /

5/50 or Mono S 5/50 浓缩 Gel filtration HiLoad 16/600 Superdex 75 pg or HiLoad

29 标记蛋白质 His 标记蛋白质纯化 - 体外 reconstitution (2) His 标记和 TEV- 酶切位点 6 构造 - 不同长度 2 构造 IMAC - Ni Sepharose HisTrap 1 ml TEV 酶切 Ion exchange chromatography Mono Q 5/50 or Mono S 5/50 浓缩 Gel filtration HiLoad 16/600 Superdex 75 pg or HiLoad 16/600 Superdex 200 pg Garvie et. al., (2007) Biochemistry, 46, /

30 标记蛋白质鉴定相互作用部分 (3) 分子筛 B+AP+5 AP+5 RFX5 (1-90) 系统 : ÄKTApurifier 层析柱 : 一或两根柱串联一起, Superose 6 10/300 GL Superdex /300 GL 检测 : 280 nm 吸光度 AU 洗脱体积 (ml) Garvie et. al., 2007, Biochemistry, 46, /

31 µg mg 规模产品分子筛凝胶 Superdex 200 Superose 6 Sephacryl S-300 HR Sephacryl S-400 HR Sephacryl S-500 HR Sephacryl S-1000 SF 分离范围 Mr 球蛋白排阻 ~ 200 nm 排阻 ~ 400 nm 31 /

32 结论 : µg mg 规模纯化方式 - 非重组 - 重组亲和标记 Protein A, GST, CBP, MBP, His, SBP 纯化技术亲和层析分子筛

33 结论 : 复合物纯化 ng - µg 规模串联亲和纯化以增加特异性 GST 或抗体结合 µg - mg 规模亲和层析分子筛

34 谢谢!

35 ÄKTApurifier, HisTrap, HiLoad, Sepharose, Sephacryl, Superose, Superdex, Mono Q and Mono S are trademarks of GE Healthcare companies. GE, imagination at work and GE monogram are trademarks of General Electric Company. All goods and services are sold subject to the terms and conditions of sale of the company within GE Healthcare which supplies them. A copy of these terms and conditions is available on request. Contact your local GE Healthcare representative for the most current information General Electric Company All rights reserved. GE Healthcare Bio-Sciences AB, a General Electric Company. GE Healthcare Bio-Sciences AB, Björkgatan 30, SE Uppsala, Sweden.

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Microsoft Word - 2014-共14學門規劃彙集.docx 103 年度生科司學門發展規劃及成果報告科技部生命科學研究發展司中華民國 104 年 1 月 31 日目錄 1. 生物科學學門... 1 2. 農產資源科學學門... 13 3. 農業環境科學學門... 33 4. 生物多樣性及長期生態學門... 45 5. 形態及生