22期xin

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尾由和
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1 中国农学通报 2014,30(22): Chinese Agricultural Science Bulletin 不同采收期引种柴胡不同部位总皂苷和皂苷 a d 含量的研究段英姿, 客绍英 ( 唐山师范学院生命科学系, 河北唐山 ) 摘要 : 以引种到唐山的北柴胡为样本, 研究其不同部位总皂苷和皂苷 a d 含量的动态变化规律, 探讨引种柴胡的最适采收期用紫外分光光度法和 HPLC 法分别测定不同采收期柴胡总皂苷及皂苷 a d 的含量根茎叶中均含有皂苷, 整个生长期内皂苷含量呈上下波动, 但总体呈下降趋势 ; 不同部位不同采收期均存在明显差异, 根中高于茎和叶, 茎中含量最少 ; 根中皂苷 d 含量均高于皂苷 a; 总皂苷和皂苷 a d 含量在种植第 1 年 10 月含量最高, 第 2 年 9 月含量最低, 皂苷 a d 含量第 2 年 8 月含量次高紫外分光光度法和 HPLC 法分别测定柴胡总皂苷及皂苷 a d 方法可行, 效果良好确定了引种柴胡最适采收时期, 为引种柴胡药材的采收及生产提供了一定科学依据关键词 : 柴胡 ; 采收期 ; 总皂苷 ; 皂苷 a; 皂苷 d 中图分类号 :S322.1 文献标志码 :A 论文编号 : Study on the Content of Saikosaponins and Saikosaponin a, d of Different Parts from Introduction Bupleurum chinense in Various Collecting Periods Duan Yingzi, Ke Shaoying (Department of Biology, Tangshan Teacher s College, Tangshan Hebei ) Abstract: The research took Tangshan introduction of Bupleurum chinense as the sample to study the dynamic change law of saikosaponins and saikosaponin a, d of different parts and discuss the optimal harvest time of Bupleurum chinense. The content of saikosaponins and saikosaponin a, d was determined by UV- visible spectropholometry and HPLC method. The root, stem and leaf contained saikosaponin, the content of saikosaponin in the whole growth period was fluctuated, but the overall trend was on declining. There were obvious difference in different parts and different harvest time, the content in root was more than that in stem and leaf. The content in stem was the lowest. The content of saikosaponin d in root were higher than that of saikosaponin a; the content of saikosaponins and saikosaponin a, d was the highest in October of the first year, and was the lowest in September of the second year, the content of saikosaponin a and d was higher in August. The determination methods of saikosaponins by UV- visible spectrophotometry and saikosaponin a and d by HPLC was proved to be feasible and the result was good. The optimal harvest period of introduction Bupleurum chinense was determined, which could provide scientific basis for harvesting and production. Key words: Bupleurum chinense DC.; harvesting season; saikosaponins; saikosaponin a; saikosaponin d 0 引言 2010 年版中国药典规定柴胡药材来源于北柴胡 (Bupleurum chinense DC.) 和狭叶柴胡 (B. scorzonerifolium Willd.) 的根 [1] 但有些地区如江苏地基金项目 : 国家科技部子课题板蓝根北柴胡规范化种植基地及其 SOP 优化升级研究 (2011BAI07B05-4); 唐山市科技重大项目唐山地区道地药材选育及其应用示范 ( A); 唐山师范学院项目中药材紫苏柴胡种子检验规程与质量标准研究 (2013A05) 第一作者简介 : 段英姿, 女,1974 年出生, 山东鱼台人, 讲师, 硕士, 主要从事植物育种与生物技术研究通信地址 : 河北省唐山市路北区建设北路 156 号唐山师范学院生命科学系,Tel: , dyz03247@sohu.com 收稿日期 : , 修回日期 :

2 218 中国农学通报区以狭叶柴胡全草入药 [2] 具有和解表里, 疏肝, 升阳之功能 [3] 主要用于感冒, 虚劳骨蒸, 月经不调, 子宫脱垂, 黄疸等 [4] 柴胡根中主要成分为柴胡皂苷, 其次含有植物甾醇侧金盏花醇, 以及少量挥发油多糖, 地上部分主要含黄酮类少量皂苷类木脂素类香豆素类成分 [2] ; 其中根中皂苷 a c d 含量较高, 药理实验研究表明皂苷 a d 具有明显的药理活性 [5], 目前柴胡皂苷 a d 己成为检验药用柴胡质量的标准 [6] 目前北柴胡野生资源日益减少, 各地积极推进家种生产, 且不同地区间相互引种, 为了推进唐山中药资源的多样性, 本研究室从柴胡主要产地引种柴胡至唐山对于柴胡皂苷 [7] 的研究已有不少报道, 如卫冰等研究河南种植柴胡 [8] 的不同采收期根中总皂苷含量王一飞等以皂苷 a [9] 为内参建立了 HPLC 指纹图谱鲁湘鄂等和杨慧等 [10] 用 HPLC 方法研究柴胡根中皂苷 a 和 d 含量王鹏 [11] 等研究不同产地柴胡根中皂苷 a 和总皂苷的含量李 [12] [13] 竞等和朱再标等研究了不同来源柴胡的总皂苷和 [14] 皂苷 a d 含量刘清等研究了秦岭狭叶柴胡地上部 [15] 分皂苷 a 含量的测定刘晓节等用 HPLC 法评价北柴胡引种前后不同品种柴胡的质量, 但是对于引种后北柴胡在新的生长环境不同生长期根中及地上部分茎叶中皂苷含量变化研究未见相关报道本研究对引种柴胡不同采收期全草总皂苷及根中皂苷 a d 动态含量进行测定, 旨在为引种柴胡质量评价及全草的进一步利用和开发提供依据 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 KQ 250E 超声波清洗仪 ( 唐山市超声仪器有限公司 );WF2 UV 2102C 型紫外可见分光光度计 ( 由尼柯 ( 上海 ) 仪器有限公司 ); 高效液相色谱仪 LC2000( 上海天关科学仪器有限公司 ); 手提式高速中药粉碎机 DFT-100( 上海隆拓仪器设备有限公司 ) 柴胡皂苷 a 标准品批号 ; 柴胡皂苷 d 标准品批号 ( 国药集团化学试剂有限公司 ) 1.2 材料来源于山东菏泽当地种植的某柴胡品种, 经唐山师范学院客绍英教授鉴定为伞形科植物北柴胡当年种植于唐山玉田县同仁堂中草药种植基地,2011 年 6 月 24 日播种,10 月抽茎时开始采样,30 天左右进行一次采样,11 月进入霜冻期,2012 年春天返青, 生育期和枯萎期 20 天左右采样 1 次每次取 1 m 2, 根茎叶分开烘干, 粉碎过 40 目筛, 待用 1.3 柴胡总皂苷的含量测定对照品溶液的制备精密称取柴胡皂苷 a 20 mg 的标准品, 配成 1 mg/ml 备用最佳测定波长的选择取对照品储备液配成 0.16 mg/ml 在样品中加入浓度 0.4% 的对二氨基苯甲醛乙醇溶液, 并在 70 的水浴中反应 10 min, 放置室温, 再加入磷酸 4 ml, 并在 50 的水浴中反应 20 min, 放置室温后, 以空白溶媒作为空白校正, 进行全波长扫描 (200~800 nm) 样品溶液的制备分别取柴胡根茎叶样品粉末 0.5 g, 置于 100 ml 锥形瓶中, 加入 75 ml 2% 的 KOH- CH 3OH 溶液,50 微波萃取 45 min, 离心 5 min, 静置 30 min, 取上清溶液, 临用前过 0.45 μm 滤膜过滤滤液加入浓度 0.4% 的对二氨基苯甲醛乙醇溶液, 并在 70 的水浴中反应 10 min, 放置室温, 再加入磷酸 4 ml, 在 50 的水浴中反应 20 min, 放置室温作为供试品溶液标准曲线的建立将皂苷对照品分别配成 mg/ml 按上述测定方法测定, 绘制标准曲线精密度试验取柴胡皂苷对照品溶液, 按项下方法操作方法测定吸光度, 连续测定 5 次, 计算相对标准偏差稳定性试验取柴胡根粉末 0.5 g, 精密称定按项下制备供试品溶液和项下方法, 分别于配制后 h 测定总皂苷吸光度, 计算相对标准偏差方法重复性试验取柴胡根粉末 0.5 g, 精密称定, 共 6 份按项下制备供试品溶液和项下方法, 测定总皂苷吸光度, 计算相对标准偏差加样回收率试验取柴胡根粉末 0.5 g, 精密称定加入对照品适量, 按项下制备供试品溶液和项下方法, 测定总皂苷吸光度, 计算相对标准偏差 1.4 柴胡根中皂苷 a d 的测定色谱条件色谱条件 :C18(4.6 mm 250 mm, 5 μm) 反相色谱柱, 流动相为乙腈与水 (40:60); 流速 1.0 ml/min; 柱温 25 ;UV 检测波长 210 nm 对照品溶液的制备分别精密称取柴胡皂苷 a d 20 mg 的标准品, 用甲醇溶解配成 1 mg/ml 备用供试品溶液的制备取供试品 0.5 g, 置于 25 ml 容量瓶中, 加 5% 的氨水 - 甲醇至刻度, 湿润 30 min, 定容至 25 ml, 超声 30 min, 离心 10 min, 后再静置 30 min, 取上清溶液 10 ml, 水浴蒸干, 粉末用甲醇溶

3 段英姿等 : 不同采收期引种柴胡不同部位总皂苷和皂苷 a d 含量的研究 219 解定容, 临用前用 0.45 μm 的滤膜过滤得供试液标准曲线的制备分别取柴胡皂苷 a d 照品储备液配成 μg/μl 按条件分别进样 20 μl, 按上述色谱条件测定, 峰面积为纵坐标, 浓度为横坐标绘制标准曲线精密度试验取柴胡皂苷 a d 对照品溶液, 同样色谱条件进行 HPLC 分析, 重复进样 5 次, 记录其峰面积, 计算相对标准偏差稳定性试验取同一样品 0.5 g, 同样色谱条件进行 HPLC 分析按项进行测定, 每 h 进样 1 次, 进样 5 次, 记录其峰面积, 计算相对标准偏差重复性试验取根粉末样品 0.5 g, 精密称定, 共 5 份同样色谱条件进行 HPLC 分析按项进行测定, 记录其峰面积, 计算相对标准偏差加样回收率试验取同一样品 0.5 g, 精密称定, 共 6 份, 分别精密添加柴胡皂苷 a 对照品和柴胡皂苷 d 对照品适量, 同样色谱条件进行 HPLC 分析按项进行测定, 记录其峰面积, 计算相对标准偏差 2 结果与分析 2.1 引种柴胡生长期变化本研究中发现, 引种柴胡 6 月播种,8 月开始萌动, 10 月才开始抽出地上茎,11 月进入霜冻期, 第 2 年 6 月返青, 之后才进入旺盛的生殖生长,8 月开花,9 10 月结种,11 月地上部位开始枯萎 2.2 柴胡总皂苷含量的测定方法研究进行全波长扫描 (200~800 nm), 测得最大吸收波长为 535 nm; 经统计学计算, 得标准曲线回归方程 :y=1.1439x ,r 2 =0.9963, 表明 4~64 μg 范围内, 线形关系良好对该方法的精密度稳定性重复性和加样回收率进行了考察, 结果表明 : 精密度试验 RSD 为 0.5%; 稳定性试验 RSD 为 1.18%, 表明在 5 h 内稳定 ; 重复性试验 RSD 为 2.05%; 加样回收试验平均回收率为 %,RSD 为 2.08%; 以上试验 RSD 值均小于 5%, 说明该方法可行样品总皂苷的含量测定结果及动态变化趋势据 [2] 文献知柴胡地上部位也含少量皂苷, 所以本研究对柴胡全草根茎叶的总皂苷含量进行了测定, 并对不同采收期总皂苷含量变化分析由表 1 和图 1 可知, 根茎叶均含有皂苷, 根中总皂苷含量远高于茎叶, 其中茎中含量最少随着生长, 根茎叶及全草总皂苷的含量呈上下波动, 但总体都呈下降趋势, 茎的总皂苷含量变化最平缓 ; 根的总皂苷含量在第 1 年 10 月抽茎期含量最高,11 月进入霜冻含量急剧降低, 在这 2 个时期, 茎叶中总皂苷含量变化却与之相反, 三者在第 2 年 9 月含量都达最低 2.3 柴胡根中皂苷 a d 的测定方法研究本试验色谱条件流动相乙腈与水的比例经摸索为 40:60; 流速 1.0 ml/min; 柱温 25 ;UV 检测波长 210 nm 在此条件下, 样品分离良好, 见图 2 经统计分析得标准曲线回归方程 : 柴胡皂苷 a:y= x ,r 2 =0.9997, 柴胡皂苷 d:y= x-11956, R 2 =0.9994, 说明柴胡皂苷 a,d 进样量在 0.4~16 μg 范围内与峰面积线性关系良好对该方法的精密度稳定性重复性和加样回收率进行了考察, 结果表明 : 精密度试验柴胡皂苷 a 的 RSD 为 0.67%, 柴胡皂苷 d 的 RSD 为 0.71%; 稳定性试验柴胡皂苷 a 的 RSD 为 0.79%, 柴胡皂苷 d 的 RSD 为 0.81%, 说明供试品溶液在室温下放置 16 h 稳定 ; 重复性试验柴胡皂苷 a 的 RSD 为 1.08%, 柴胡皂苷 d 的 RSD 为 1.10%; 加样回收试验柴胡皂苷 a 平均回收率为 99.8%,RSD 为 1.07%; 柴胡皂苷 d 平均回收率为 99.85%,RSD 为 0.98% 以上试验 RSD 值均表 1 不同采收期柴胡总皂苷及皂苷 a d 含量的测定结果 % 采收期皂苷 a 根皂苷 d 皂苷 (a+d) 根茎总皂苷叶全草 ( 根 + 茎 + 叶 )

4 220 中国农学通报根茎叶全草根茎叶 ) 百分含量采收日期年月日图 1 不同采收期柴胡总皂苷含量的动态变化保留时间 A. 柴胡对照品 ;B. 柴胡样品 ;1. 柴胡皂苷 a;2. 柴胡皂苷 d 图 2 高效液相色谱图保留时间

5 段英姿等 : 不同采收期引种柴胡不同部位总皂苷和皂苷 a d 含量的研究 221 小于 5%, 说明该方法可行样品根中柴胡皂苷 a d 的含量测定及动态变化趋势测定不同采收期柴胡根中皂苷 a d 的含量, 并分析含量变化趋势由表 1 和图 3 可知, 不同采收期柴胡根中皂苷 a d 和皂苷 (a+d) 变化趋势类似, 皂苷 d 含量均高于皂苷 a 第 1 年 10 月抽茎期含量最高, 第 2 年由 6 月返青期至 8 月盛花期含量呈上升趋势,8 月底含量最高,9 月结种初期急剧下降, 之后呈上下波动不同采收期柴胡根中总皂苷及柴胡皂苷 a d 的含量大小相差比较大, 柴胡皂苷 a d 高者, 总皂苷不一定高, 从返青期至结种期, 变化趋势相反, 但总体呈降低趋势百分含量皂苷皂苷皂苷总皂苷采收日期年月日图 3 不同采收期柴胡皂苷含量的动态变化 3 结论与讨论整个生长期内皂苷含量大小差异较大, 呈上下波动, 但总体呈下降趋势 ; 皂苷 a d 含量之和最低 0.644%, 最高 2.456%, 均大于 0.3%, 符合药典标准要求,2010 年版中国药典规定柴胡中柴胡皂苷 a 和 d 的总量不得少于 0.3% 可见在唐山种植引种柴胡同样有利于药材有效成分皂苷含量的积累, 可作为北柴胡适宜种植地虽然地上部位总皂苷含量低于根中, 但是茎叶的总皂苷含量之和最高达 1.484%, 说明北柴胡地上部位同样有利用的价值, 可以入药采用紫外分光光度法和 HPLC 法分别测定柴胡总皂苷及皂苷 a d, 建立了各自的测定方法, 其中 HPLC 方法中流动相是乙腈和水比例为 40:60, 峰形较好, 方法简便在本研究中 6 月播种引种柴胡, 无论全草的总皂苷还是根的皂苷 a d, 当年秋季皂苷含量比较高, 但是此期才开始抽茎, 根还不成熟, 一般不采收生长第 2 年时,8 月底皂苷 a d 含量都达最高, 但总皂苷含量却不是最高, 目前柴胡皂苷 a d 己成为检验药用柴胡质量的标准 [6], 因此本研究中以皂苷 a d 含量为主要指标, 总皂苷为次要指标综合分析, 认为 8 月采收药材比 [1] 较合适, 与药典建议的春秋 2 季采收差别很大可能是因为播种时间品种和生长环境不同造成的总皂苷及皂苷 a d 均在 9 月结种初期含量急剧降低, 可能是由于此期地上地下部位因结种体内组分分布产生了变化不同采收期皂苷 a d 含量差异较大, 但变化趋势类似, 第 2 年呈上升后下降的趋势,8 月底 [16] 含量最高这与王启帅等研究柴胡根中皂苷 a d 含量变化趋势类似, 但皂苷 a d 含量普遍高于其研究结果本研究中不同生长期取材时间间隔较长, 不能更详细地展现生长中皂苷含量的连续变化, 且从生长生殖时间上分析此引种柴胡属于晚熟品种, 后期拟多引进早熟品种, 缩短取材间隔对不同来源以及不同采收季节的柴胡样品多种有效成分进行更细致的研究, 为进一步考察北柴胡规范化种植基地及其 SOP 优化升级研究提供依据参考文献 [1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典 (2010 年第一部 )[M]. 北京 : 中国医药科技出版社,2010:263. [2] 谢东浩, 蔡宝昌, 安益强, 等. 柴胡皂有类化学成分及药理作用研究进展 [Jl. 南京中医药人学学报,2007,23(1): [3] 李芳. 李建北. 张东明. 柴胡的药理研究进展 [J]. 时珍国医国药,2004, 15(2): [4] 中国科学院西北植物研究所. 秦岭植物志 ( 第 1 卷. 第三册 )[M]. 北京 : 科学出版社,1981:390. [5] 李腾, 高展, 孙玉侠, 等. 柴胡及其制剂中皂许类成分的研究 [J]. 中成药,2011,33(11): [6] 黎明. 柴胡药用研究的近况 [J]. 北方药学,2011,8(3): [7] 卫冰, 李晓坤, 杨云, 等. 不同产地及不同采收期北柴胡中柴胡总皂苷的含量测定 [J]. 辽宁中医杂志,2012,39(12):

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g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.