ND 张婷

Size: px

Start display at page:

Download "ND 张婷"

淦轴澄
6 years ago
Views:

1 Library Preparation VAHTS TM Turbo DNA Library Prep Kit for Illumina Vazyme Biotech Co., Ltd 网站 /Web: 咨询热线 /Tel: 销售 /Sales: 技术支持 /Support: 技术服务 /Service: Vazyme biotech co., ltd. 使用说明书 Version 6.1

2 目录 Catalog 产品概述 VAHTS TM Turbo DNA Library Prep Kit for Illumina 是针对 Illumina 高通量测序平台文库构建定向优化而成的试剂盒使用本试剂盒可以将微量片段化 DNA 样品制备成 Illumina 高通量测序平台专用文库和常规方法相比,VAHTS TM Turbo DNA Library Prep Kit for Illumina 将多步反应进行了合并, 省略了多个纯化步骤因此显著降低了起始 DNA 模板的最少需求量, 缩短了实验耗时试剂盒中提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证, 最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性产品组分组分 ND (24 rxn) ND (96 rxn) VAHTS Turbo End Prep Enzyme Mix VAHTS Turbo End Prep Reaction Buffer (10 ) VAHTS Turbo T4 DNA Ligase VAHTS Turbo Ligation Enhancer VAHTS Super-Fidelity DNA Polymerase VAHTS Super-Fidelity 2 PCR Buffer 72 μl 156 μl 48 μl 1 ml 24 μl 600 μl 288 μl 624 μl 192 μl ml 96 μl ml 贮存及有效期所有组分 -20 C 保存其他必需材料产品概述产品组分贮存及有效期其他必需材料适用范围质量控制使用方法参考实例常见问题建库流程示意 100% 乙醇灭菌超纯水低吸附 EP 管 (Eppendorf # ) AMPure XP Beads(Beckman Coulter, Inc. #A63881) 磁力架 PCR 仪 VAHTS TM Singleplex or Multiplex Oligos for Illumina (Vazyme#N302 或 #N303) 适用范围适用于将 5 ng 1 μg 片段化 DNA 样品制备成 Illumina 高通量测序平台专用文库 01/ 02

3 使用方法实验材料 :5 ng 1 μg 片段化 DNA 末端修复磷酸化并加 da 尾 1. 在灭菌 PCR 管中配制如下反应 : VAHTS Turbo End Prep Enzyme Mix 3.0 μl VAHTS Turbo End Prep Reaction Buffer (10 ) 6.5 μl 片段化 DNA x μl ddh 2 O To 65.0 μl 2. 使用移液器轻轻吹打混匀 ( 请勿震荡混匀 ), 并短暂离心将反应液收集至管底 3. 将反应管置于 PCR 仪中, 进行下述反应 : 热盖 On, 105 C 20 C, 30 min 65 C, 30 min Hold at 4 C 接头连接 1. 将下列组分直接添加至 65 μl 末端修复产物中 : VAHTS Turbo T4 DNA Ligase 2.0 μl VAHTS Turbo Ligation Enhancer 30.5 μl VAHTS Adapter for Illumina* 2.5 μl In Total To μl *VAHTS TM Multiplex Oligos set 1 for Illumina (Vazyme #N302) 或 VAHTS TM Multiplex Oligos set 2 for Illumina (Vazyme #N303) 中均提供 VAHTS Adapter for Illumina, 浓度均为 15 μm 如片段化 DNA 质量 100 ng, 直接使用 2.5 μl 即可 ; 如片段化 DNA 质量 <100 ng, 必须先使用灭菌蒸馏水将其稀释 10 倍后使用 2.5 μl 2. 使用移液器轻轻吹打混匀, 并短暂离心将反应液收集至管底 3. 将反应管置于 PCR 仪中, 进行下述反应 : 热盖 On, 105 C 20 C, 15 min Hold at 4 C 连接产物纯化使用 AMPure XP beads 进行连接产物纯化有片段长度分选和不分选两种方案可选, 只需进行其中一种即可如起始 DNA 质量 50 ng, 我们推荐您选择片段长度分选方案 ; 如起始 DNA 质量 <50 ng 或者您不需要进行片段长度分选, 请选择不分选方案 A. 片段长度不分选纯化方案 2. 吸取 100 μl (1 ) AMPure XP beads 至 100 μl 连接产物中, 使用移液器轻轻吹打 10 次充分混匀 4. 将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体待溶液澄清后 ( 大约 5 分钟 ), 小心移除上清 5. 保持 EP 管始终处于磁力架中, 加入 200 μl 新鲜配制的 80% 乙醇漂洗磁珠室温孵育 30 秒, 小心移除上清 6. 重复步骤 5 两次, 总计漂洗三次 7. 保持 EP 管始终处于磁力架中, 开盖空气干燥磁珠 10 分钟 8. 将 EP 管从磁力架中取出, 加入 28 μl 灭菌超纯水进行 DNA 洗脱涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体待溶液澄清后 ( 大约 5 分钟 ), 小心吸取 22 μl 上清至灭菌 PCR 管中注意 : 转移上清时请勿吸取 AMPure XP beads, 即使微量残留都将影响后续文库扩增效率 9. 进行文库扩增 B. 片段长度分选纯化方案 B-1. 总 DNA 捕获 2. 吸取 180 μl (1.8 ) AMPure XP beads 至 100 μl 连接产物中, 使用移液器轻轻吹打 10 次充分混匀 4. 将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体待溶液澄清后 ( 大约 5 分钟 ), 小心移除上清 5. 保持 EP 管始终处于磁力架中, 加入 200 μl 新鲜配制的 80% 乙醇漂洗磁珠室温孵育 30 秒, 小心移除上清 6. 重复步骤 5 两次, 总计漂洗三次 7. 保持 EP 管始终处于磁力架中, 开盖空气干燥磁珠 10 分钟 8. 将 EP 管从磁力架中取出, 加入 105 μl 灭菌超纯水进行 DNA 洗脱涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体待溶液澄清后 ( 大约 5 分钟 ), 小心吸取 100 μl 上清至灭菌 PCR 管中 9. 进行 B-2 片段大小分选 B-2. 片段大小分选插入片段长度 (bp) 总长度 ( 插入片段 + 接头 ) 第一轮磁珠分选比例 ( 磁珠 :DNA) 第二轮磁珠分选比例 ( 磁珠 :DNA) 表一 : 推荐 AMPure XP beads 文库分选纯化反应条件注 : 表中表示样品 DNA 体积如文库插入片段长度为 150 bp, 样品 DNA 体积为 100 μl, 则第一轮分选磁珠使用体积为 μl = 90 μl; 第二轮分选磁珠使用体积为 μl = 20 μl 03/ 04

4 以下操作流程只适合于插入片段长度为 200 bp 的文库其他长度文库请根据表一选择最适磁珠量 2. 吸取 80 μl (0.8 ) AMPure XP beads 至 100 μl B-1 纯化产物中, 使用移液器轻轻吹打 10 次充分混匀 4. 将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体待溶液澄清后 ( 大约 5 分钟 ), 小心转移上清至干净 EP 管中 5. 吸取 20 μl (0.2 ) AMPure XP beads 至上清中, 使用移液器轻轻吹打 10 次充分混匀 6. 室温孵育 5 分钟 7. 将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体待溶液澄清后 ( 大约 5 分钟 ), 小心移除上清 8. 保持 EP 管始终处于磁力架中, 加入 200 μl 新鲜配制的 80% 乙醇漂洗磁珠室温孵育 30 秒, 小心移除上清 9. 重复步骤 8 两次, 总计漂洗三次 10. 保持 EP 管始终处于磁力架中, 开盖空气干燥磁珠 10 分钟 11. 将 EP 管从磁力架中取出, 加入 28 μl 灭菌超纯水洗脱涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体待溶液澄清后 ( 大约 5 分钟 ), 小心吸取 22 μl 上清至灭菌 PCR 管中, 请勿触碰 AMPure XP beads 注意 : 转移上清时请勿吸取 AMPure XP beads, 即使微量残留都将影响后续文库扩增效率 12. 进行文库扩增除此之外, 接头连接产物也可使用柱纯化或胶回收试剂盒进行纯化, 最终使用同样体积的灭菌超纯水或者洗脱缓冲液洗脱 PCR 扩增 3. 将反应管置于 PCR 仪中, 进行下述反应 : 步骤温度时间循环数预变性 98 C 30 sec 1 变性 98 C 10 sec 退火 65 C 30 sec 6-15* 延伸 72 C 30 sec 完全延伸 72 C 5 min 1 Hold 4 C * 循环数应该根据起始 DNA 量进行调整我们推荐当起始 DNA 量为 1 μg 时, 使用 6 个循环 ; 当起始 DNA 量为 50 ng 时, 使用 10 个循环 ; 当起始 DNA 量为 5 ng 时, 使用 15 个循环 PCR 扩增产物纯化 2. 吸取 50 μl (1 ) AMPure XP beads 至 PCR 产物中, 使用移液器轻轻吹打 10 次充分混匀 4. 将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体待溶液澄清后 ( 大约 5 分钟 ), 小心移除上清 5. 保持 EP 管始终处于磁力架中, 加入 200 μl 新鲜配制的 80% 乙醇漂洗磁珠室温孵育 30 秒, 小心移除上清 6. 重复步骤 5 两次, 总计漂洗三次 7. 保持 EP 管始终处于磁力架中, 开盖空气干燥磁珠 10 分钟 8. 将 EP 管从磁力架中取出, 加入 30 μl 灭菌超纯水进行 DNA 洗脱涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体待溶液澄清后 ( 大约 5 分钟 ), 小心吸取 25 μl 上清至灭菌 PCR 管中 9. 将制备好的 DNA 文库置于 -20 C 保存除此之外,PCR 扩增产物也可使用柱纯化试剂盒进行纯化最终使用同等体积的灭菌超纯水或者洗脱缓冲液洗脱 1. 在灭菌 PCR 管中配制如下反应 : 连接反应纯化产物 VAHTS Super-Fidelity 2 PCR Buffer VAHTS Universal PCR Primer for Illumina* VAHTS Index Primer for Illumina* VAHTS Super-Fidelity DNA Polymerase In Total 22 μl 25 μl 1 μl 1 μl 1 μl 50 μl *VAHTS TM Multiplex Oligos set 1 for Illumina (Vazyme #N302) 或 VAHTS TM Multiplex Oligos set 2 for Illumina (Vazyme #N303) 中均提供 VAHTS Universal PCR Primer for Illumina 和 VAHTS Index Primer for Illumina 2. 使用移液器轻轻吹打混匀, 并短暂离心将反应液收集至管底 05/ 06

参考实例 1500-1000 - 700-500 - 400-300 - 200-150 - 100-50 - 15 - M L [FU] 40 20 0 15 100 200 300 400 1500 [bp] Agilent 2100 Bioanalyzer 文库质量分析 M:DNA Ladder L: 使用 VAHTS TM Turbo DNA Library Prep Kit for

不可以为了最大程度上简化文库构建流程,VAHTS TM Turbo DNA Library Prep Kit for Illumina 中的所有组分都在一定程度上进行了修改, 请勿使用其他任何产品代替 2. 接头连接反应之前是否需要进行产物纯化?

5 参考实例 M L [FU] [bp] Agilent 2100 Bioanalyzer 文库质量分析 M:DNA Ladder L: 使用 VAHTS TM Turbo DNA Library Prep Kit for Illumina 制备的 bp 文库 ( 接头连接产物通过 AMPure XP beads 片段长度分选方案进行纯化 ) 常见问题 1. VAHTS TM Turbo DNA Library Prep Kit for Illumina 中的连接模块是否可以用其他产品代替? 不可以为了最大程度上简化文库构建流程,VAHTS TM Turbo DNA Library Prep Kit for Illumina 中的所有组分都在一定程度上进行了修改, 请勿使用其他任何产品代替 2. 接头连接反应之前是否需要进行产物纯化? 不需要使用 VAHTS TM Turbo DNA Library Prep Kit for Illumina 进行文库构建, 仅需要在 PCR 扩增之前和之后进行产物纯化 3. VAHTS TM Super-Fidelity DNA Polymerase 在文库扩增方面的优势是什么? VAHTS TM Super-Fidelity DNA Polymerase 为文库扩增专用聚合酶配以精心优化的扩增缓冲液, 该酶可实现低偏好性高效高稳定性的文库扩增 4. VAHTS TM Super-Fidelity DNA Polymerase 是否可以使用 dutp 做为聚合材料? 不可以请勿使用包含 dutp 的引物 / 模板或直接使用 dutp 做为聚合材料 5. VAHTS TM Turbo DNA Library Prep Kit for Illumina 中不包含接头和 PCR 扩增引物, 该如何获得? VAHTS TM Singleplex Oligos for Illumina (Vazyme #N301), VAHTS TM Multiplex Oligos set 1 for Illumina (Vazyme #N302) 或 VAHTS TM Multiplex Oligos set 2 for Illumina (Vazyme #N303) 中提供这些实验材料, 可根据需要自行选择 6. 使用 VAHTS TM Turbo DNA Library Prep Kit for Illumina 进行文库构建需要的起始 DNA 量是多少? 由于 VAHTS TM Turbo DNA Library Prep Kit for Illumina 在最大程度上简化了文库构建流程, 省略了多个产物纯化步骤, 最低起始 DNA 量可达 5 ng, 最高 DNA 起始量为 1 μg 质量控制 VAHTS Turbo End Prep Enzyme Mix SDS-PAGE 纯度 : 所有酶组分纯度 >95% 核酸内切酶残留 :50 μl 反应体系中加入 10 μl 本酶和 1 μg φx174 RF I DNA,37 C 下孵育 4 小时经琼脂糖凝胶电泳检测,RF II 转化比率 <10% 磷酸酶活性检测 : 在磷酸酶活性检测缓冲液中加入 10 μl 本酶和 2.5 mm 对硝基苯磷酸,37 C 下孵育 4 小时经光谱测定法检测,405 nm 处无对硝基苯阴离子特征吸收峰功能性活性检测 : 在 1 End Prep Reaction Buffer 中加入 1 μl 本酶和 0.5 μg 包含 5 和 3 突出末端的片段化 DNA,25 C 下反应 20 分钟经毛细管电泳检测, 末端修复加 da 尾并磷酸化的 DNA 比率 >95% VAHTS Turbo End Prep Reaction Buffer (10 ) 16 小时孵育检测 :50 μl 反应体系中包含 1 End Prep Reaction Buffer 和 1 μg HindIII-λDNA,37 C 下孵育 16 小时经琼脂糖凝胶电泳检测, 条带无降解 ;50 μl 反应体系中包含 1 End Prep Reaction Buffer 和 1 μg T3 DNA,37 C 下孵育 16 小时经琼脂糖凝胶电泳检测, 条带无降解核酸内切酶残留 :50 μl 反应体系中包含 1 End Prep Reaction Buffer 和 1 μg φx174 RF I DNA, 37 C 下孵育 4 小时经琼脂糖凝胶电泳检测,RF II 转化比率 <10% RNase 活性残留 : 在 1 End Prep Reaction Buffer 中加入 40 ng FAM-RNA,37 C 下孵育 16 小时经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测, 条带无降解磷酸酶活性检测 : 在磷酸酶活性检测缓冲液中加入 1 End Prep Reaction Buffer 和 2.5 mm 对硝基苯磷酸,37 C 下孵育 4 小时经光谱测定法检测,405 nm 处无对硝基苯阴离子特征吸收峰 VAHTS Turbo T4 DNA Ligase SDS-PAGE 纯度 : 纯度 >95% 16 小时孵育检测 :50 μl 反应体系中包含 10 μl 本酶和 1 μg HindIII-λDNA,37 C 下孵育 16 小时经琼脂糖凝胶电泳检测, 条带无降解 ;50 μl 反应体系中包含 10 μl 本酶和 1 μg T3 DNA,37 C 下孵育 16 小时经琼脂糖凝胶电泳检测, 条带无降解核酸内切酶残留 :50 μl 反应体系中加入 10 μl 本酶和 1 μg φx174 RF I DNA,37 C 下孵育 4 小时经琼脂糖凝胶电泳检测,RF II 转化比率 <10% RNase 活性残留 :50 μl 反应体系中加入 10 μl 本酶和 40 ng FAM-RNA,37 C 下孵育 16 小时经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测, 条带无降解连接效率检测 :50 μl 反应体系中加入 2 μl 本酶,1 Ligation Buffer, 两端均包含 da 突出的 300 bp DNA 片段 1.5 pmol 和 30 bp 末端包含 dt 突出的双链接头 DNA 片段 15 pmol,25 C 下反应 15 分钟经琼脂糖凝胶电泳检测, 双端连接接头 DNA 的比率 >95% 07/ 08

6 VAHTS Turbo Ligation Enhancer 16 小时孵育检测 :50 μl 反应体系中包含 10 μl 本品和 1 μg HindIII-λDNA,37 C 下孵育 16 小时经琼脂糖凝胶电泳检测, 条带无降解 ;50 μl 反应体系中包含 10 μl 本品和 1 μg T3 DNA,37 C 下孵育 16 小时经琼脂糖凝胶电泳检测, 条带无降解核酸内切酶残留 :50 μl 反应体系中加入 10 μl 本品和 1 μg φx174 RF I DNA,37 C 下孵育 4 小时经琼脂糖凝胶电泳检测,RF II 转化比率 <10% RNase 活性残留 :50 μl 反应体系中加入 10 μl 本品和 40 ng FAM-RNA,37 C 下孵育 16 小时经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测, 条带无降解磷酸酶活性检测 : 在磷酸酶活性检测缓冲液中加入 10 μl 本品和 2.5 mm 对硝基苯磷酸, 37 C 下孵育 4 小时经光谱测定法检测,405 nm 处无对硝基苯阴离子特征吸收峰 VAHTS Super-Fidelity DNA Polymerase SDS-PAGE 纯度 : 纯度 >95% 核酸内切酶残留 :50 μl 反应体系中加入 10 μl 本酶和 1 μg φx174 RF I DNA,37 C 下孵育 4 小时经琼脂糖凝胶电泳检测,RF II 转化比率 <10% 磷酸酶活性检测 : 在磷酸酶活性检测缓冲液中加入 10 μl 本酶和 2.5 mm 对硝基苯磷酸, 37 C 下孵育 4 小时经光谱测定法检测,405 nm 处无对硝基苯阴离子特征吸收峰扩增性能检测 :50 μl 反应体系中加入 1 μl 本品,10 ng 人基因组 DNA 以及 0.5 μm 扩增引物扩增 1 kb 片段 30 个循环后经琼脂糖凝胶电泳检测, 有特异性 1 kb 扩增产物可见 VAHTS Super-Fidelity 2 PCR Buffer 16 小时孵育检测 :50 μl 反应体系中包含 25 μl 本品和 1 μg HindIII-λDNA,37 C 下孵育 16 小时经琼脂糖凝胶电泳检测, 条带无降解 ;50 μl 反应体系中包含 25 μl 本品和 1 μg T3 DNA,37 C 下孵育 16 小时经琼脂糖凝胶电泳检测, 条带无降解磷酸酶活性检测 : 在磷酸酶活性检测缓冲液中加入 1 本品和 2.5 mm 对硝基苯磷酸, 37 C 下孵育 4 小时经光谱测定法检测,405 nm 处无对硝基苯阴离子特征吸收峰建库流程示意 1. 使用已片段化 DNA 做为初始模板 (5 ng-1 μg); 2. 片段化 DNA 进行末端修复 5 磷酸化以及 3 加 da 尾 ; 3. 修复产物末端连接 Y 型接头 ; 4. 连接产物纯化长度分选 ; 5. 文库扩增 ; 6. 扩增产物纯化 VAHTS TM Turbo DNA Library Prep Kit for Illumina 所有批次均进行 DNA 文库构建并在 Illumina 测序平台上进行测序验证 09/ 10

Library Preparation ND

Library Preparation ND ND601-01/02 VAHTS TM Nano DNA Library Prep Kit for Illumina Vazyme Biotech Co., Ltd 网站 /Web: 咨询热线 /Tel: 400-600-9335 销售 /Sales: sales@vazyme.com 技术支持 /Support: support@vazyme.com 技术服务 /Service: service@vazyme.com