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坑爱韩
7 years ago
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1 ICS B41 DB45 广西壮族自治区地方标准 DB 45/T 鸭肝炎病毒 PCR 快速检测技术规程发布实施广西壮族自治区质量技术监督局发布

2 前言聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction, PCR) 是一种核酸体外扩增技术, 应用该技术对鸭肝炎病毒进行快速检测, 是诊断该病的重要手段之一本技术规程在充分参考文献资料实验和生产应用验证的基础上制订的, 适用于兽医临床对该病的快速鉴别诊断本标准的附录 A 附录 B 附录 C 附录 D 为规范性附录, 附录 E 附录 F 为资料性附录本标准由广西壮族自治区水产畜牧兽医局提出本标准起草单位 : 广西大学动物科学技术学院本标准主要起草人 : 韦平磨美兰韦天超蒙秋李婵本标准为首次发布 I

3 鸭肝炎病毒 PCR 快速检测技术规程 1 范围本标准规定了应用 PCR 技术检测鸭肝炎病毒的技术规范, 其中包括材料准备操作方法及结果判定本标准适用于临床上鸭肝炎的快速诊断, 可对病鸭病料组织及病毒分离物进行检测 2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准 2.1 鸭肝炎 (Duck hepatitis, DH) 和鸭肝炎病毒 (Duck hepatitis virus, DHV) 鸭肝炎又名鸭病毒性肝炎 (Duck viral hepatitis, DVH), 由鸭肝炎病毒引起的一种 6 周龄以内雏鸭高度致死性的传播迅速的接触性传染病鸭肝炎病毒有三个血清型, 分别引起 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 型鸭肝炎, 通常我们所说的鸭肝炎主要指 I 型鸭肝炎病毒所引起的 I 型 DHV 为小 RNA 病毒科肠道病毒属, 无囊膜, 基因组为不分节段的单股正链 RNA, 病毒粒子很小, 直径为 20 nm~40 nm, 大致呈球型或半球形, 二十面体对称, 其病毒 RNA 具有感染性 2.2 聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction, PCR) PCR 技术是一种在体外快速扩增特定基因或 DNA 序列的方法通过热变性复性延伸的 PCR 循环过程 30 次 ~35 次后, 目的基因的 DNA 呈百万倍的扩增 2.3 半巢式 PCR 半巢式 PCR 是在巢式 PCR 的基础上发展起来的一种更敏感的检测方法在用于第 1 次 PCR 的引物扩增的片段内再设计一对新的引物, 以第 1 次 PCR 产物为模板再进行 PCR 扩增如在第 2 次扩增时仅需设计单条引物, 另一条可与第 1 次扩增时的其中一条引物共用即为半巢式 PCR 2.4 引物 (primer) 与待扩增 DNA 片段两侧互补的一段寡核苷酸 2.5 随机引物寡聚脱氧核糖核酸 ( 通常为六聚体 ), 用于以 RNA 为模板在反转录酶的参与合成 cdna 1

4 3 材料 3.1 用于 DHV 检测的特异性引物根据 DHV 的基因组特性, 在病毒编码 VP0 基因保守序列位置设计合成了 1 对寡核苷酸引物 DHVA1/DHVA2, 并在当中设一条上游引物 DHVTs, 与 DHVA2 一起作为半巢式 PCR 的引物,( 基础 PCR 引物 :DHVA1/DHVA2; 半巢式 PCR 引物 :DHVTs 和 DHVA2; 见附录表 A.1), 其中基础 PCR 和半巢式 PCR 扩增片段大小分别为 426bp 和 293bp, 两对引物的使用浓度均为 25 mmol/l 3.2 试剂 RNA 抽提试剂盒如下 : Trizol; 稀释液 (Solution RW); UNIQ-10 柱 ; RNase-free H2O 见附录 F 反转录试剂如下 : 5 倍 RT Buffer; dntps 混合物 : 包括 datp dttp dctp dgtp; RNA 酶抑制剂 ; M-MLV 反转录酶 ; 随机引物 PCR 试剂盒如下 : Taq DNA 聚合酶 ; MgCl2; PCR 缓冲液 ; dntps 混合物 : 包括 datp dttp dctp dgtp 见附录 F 电泳试剂如下 : 1% 琼脂糖 ; 10 mg/ml 溴化乙锭 ; 凝胶加样缓冲液 ; 1 倍 Tris- 硼酸电泳缓冲液其他试剂如下 : 氯仿 + 异戊醇 (RNA 抽提液 ); 无水乙醇 ; 灭菌双蒸水 ; DEPC H2O 按照附录 B 附录 C 规定的方法执行 2

5 3.3 仪器设备及耗材仪器设备如下 : PCR 仪 ; 紫外线检测仪 ; 凝胶成像系统 ; 小型高速离心机 ; 水浴锅 ; 旋涡振荡器 ; 乳钵或玻璃研磨器 ; 微量加样器 :200 µl~1000µl 40 µl~200 µl 5 µl~40µl 0.5µL~ 10 µl 和 0.05 µl~ 2µL 等多种规格一次性耗材如下 : 手套 ; 离心管 :1.5mL 和 0.5 ml; PCR 反应管 :0.2 ml 和 0.5 ml; 吸头 :1 000µL 200µL 5µL~40µL 0.5µL~10µL 等多种规格 4 操作程序注 : 注意事项见附录 E 4.1 待检样品的准备无菌采取待检病鸭肝脏病变组织样品约 0.5 g, 置于 1.5 ml 离心管中, 充分剪碎, 加入 0.5 ml 灭菌生理盐水研磨成匀浆或者病毒分离物 0.5mL( 禽胚分离液或细胞培养液 ) 置于 1.5 ml 离心管中, 以 g 离心 5 min, 收集上清液, 供 RNA 抽提, 或者 -20 保存备用 4.2 待检样品 RNA 抽提取 4.1 获得的上清液 250μL, 加入 Trizol 500μL, 剧烈振荡, 使之混匀 ; 加入氯仿 + 异戊醇 (24:1) 共 100μL, 剧烈振荡 30 s, g 离心 5 min; 吸取上清液 450μL, 移入另一 Ependorff(EP) 管, 加入 150μL 无水乙醇, 混匀 ; 将上述混合液全部移入 UNIQ-10 柱内, 室温放置 2 min, g 离心 1 min, 小心取出柱, 倾去收集管中的废液, 将柱放回收集管中, 加入稀释液 (Solution)RW 450μL, g 离心 1min; 小心取出柱, 倾去收集管中的废液, 将柱放回收集管中, 加入稀释液 (Solution)RW 450μL, g 离心 1 min; 小心取出柱, 弃去废液, g 离心 1 min; 小心取出柱, 放到无菌的无 RNA 酶 (RNase-free) 的 EP 管里, 在柱的内膜中央加入 25μL 无 RNA 酶水 (RNase-free H2O), 于 42 温育 5 min; g 离心 1 min, 即得 RNA 样品液获得的 RNA 用于反转录合成 cdna 4.3 反转录过程反转录操作在冰浴条件下, 按下列试剂用量在 PCR 反应管中分别加入各成分 : RNA 样品 :15.5 µl; 3

6 25 mmol/l 随机引物 :1 µl; 5 倍 RT Buffer:5 µl; dntps:2 µl; RNA 酶抑制剂 :0.5 µl; M-MLV 反转录酶 :1 µl 反转录程序加完试剂后瞬时离心混合将 PCR 反应管置于 PCR 仪内, 按下面反应程序进行反转录反应 :25 5 min, 42 1 h,96 5 min, 获得的 cdna 样品可直接用于 PCR, 也可置 -20 保存待用 4.4 PCR 检测基础 PCR 在冰浴条件下, 按下列试剂和用量在 PCR 反应管中分别加入各成分 : 10 倍 Buffer:2.5 µl, 终浓度为 1 倍 ; 25 mmol MgCl2:1.5 µl, 终浓度为 1.5 mmol; 5 U/µL Taq DNA 聚合酶 :0.3 µl, 终浓度为 0.06 U/µL; 25 mmol/l DHV 上下游引物各 1 µl, 终浓度为 0.5 mmol/l; dntps:0.5μl; cdna:2μl; 灭菌双蒸水 : 补足至总体积为 25µL 加完试剂后瞬时离心混匀将 PCR 反应管置于 PCR 仪内, 按如下程序进行反应 :1 95,5 min; 2 94,30 s;3 56,30 s;4 72,30 s;2~4 循环 35 次 ;5 72,8 min; 6 4 结束反应 PCR 产物保存于 4 冰箱以备电泳半巢式 PCR 在冰浴条件下, 按下列试剂用量在 PCR 反应管中分别加入各成分 : 10 Buffer:2.5µL, 终浓度为 1 倍 ; 25 mmol MgCl 2:1.5 µl, 终浓度为 1.5 mmol; 5 U/µL Taq DNA 聚合酶 :0.3 µl, 终浓度为 0.06 U/µL; 25 mmol/l DHV 上下游半巢式引物 :1 µl, 终浓度为 0.5 mmol/l; dntps:0:5 µl; 基础 PCR 产物 :1 µl; 灭菌双蒸水 : 补足至总体积为 25µL 加完试剂后瞬时离心混匀将 PCR 反应管置于 PCR 仪内, 按如下程序进行反应 :195,5 min; 294,30 s;358,25 s;472,30 s; 2~4 循环 35 次 ;572,8 min;64 结束反应 PCR 产物保存于 4 冰箱以备电泳阴性及阳性对照阴性对照健康鸭相应组织按上述样品 RNA 抽提的操作方法获得的 cdna 样品 2µL 模板作阴性对照阳性对照 4

7 用参考株 DHV-IE5 株按上述样品 RNA 抽提的操作方法获得的 cdna 样品 2µL 模板作为阳性对照 5 PCR 检测结果判断 5.1 电泳注 : 废弃的溴化乙锭或含溴化乙锭的电泳液凝胶等要集中回收处理, 处理方法见附录 D 琼脂糖凝胶制备制备方法见附录 C 加样将 10 µl PCR 产物与 2µl 凝胶电泳加样缓冲液混合均匀, 加至琼脂糖凝胶样品孔中同时设置标准分子量 DNA Marker 对照电泳条件以 5 V/cm 胶长的稳压进行电泳, 直至溴酚蓝指示剂到达离琼脂糖凝胶末端 2 cm~3 cm 时停止 5.2 结果判定将电泳后的琼脂糖凝胶置于紫外光透射仪上观察, 与标准 DNA 分子量及阳性对照比较, 分析结果, 或用凝胶成像系统拍照保存若应用基础 PCR, 被检样品在 426 bp 的片段位置上出现一条 DNA 扩增带, 判定为 DHV 阳性, 记为 (+); 若被检样品在该位置无 DNA 扩增带出现, 可暂时判定为 DHV 阴性, 记为 (-) 应用半巢式 PCR 检测时, 被检样品在 293 bp 的片段位置上出现 DNA 扩增带, 判定为 DHV 阳性, 记为 (+); 若被检样品在该位置无 DNA 扩增带出现, 则判定为 DHV 阴性, 记为 (-) 检测结果凝胶电泳图见附录 A.2 5

8 附录 A ( 规范性附录 ) 引物序列及检测结果判断 A.1 DHV 特异性引物寡核苷酸序列及扩增的目的基因 A.1.1 DHV 特异性引物寡核苷酸序列见表 A.1 A A.1 引物序列引物种类引物名称特异性引物的核苷酸序列基础 PCR DHVA1 5' GCC TAA TGG TCT TCG TTG TG 3' DHVA2 5' CCG TTG GGT CTA GTA TTG TCT 3' 半巢式 PCR DHVA2 5' CCG TTG GGT CTA GTA TTG TCT 3' DHVTs 5 TAG TTC CTG AGG GAC AGA TGT T 3 A.1.2 扩增的目的基因 DHV 基因组 VP0 基因的部分序列 A.2 PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳图 PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳图见图 A.1 和 A bp 400bp 附录 B ( 规范性附录 ) 溶液的配制 426bp 1 标准 DNA 分子量 (500 bp ladder DNA marker); 2 参考株 DHV-IE5 (+); 3 鸡胚分离物(+); 4 病鸭肝脏组织(+); 5 阴性对照(-); 注 : 426 bp 为扩增 DHV 获得的目的基因片段 ; 一表示检测结果阴性 ; + 表示检测结果阳性图 A.1 基础 PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳图 6

9 bp 250bp 293bp 1 标准 DNA 分子量 (50 bp ladder DNA marker); 2 参考株 DHV-IE5 (+); 3 病鸭肝脏组织(+); 4 鸡胚分离物(+); 5 阴性对照(-); 注 : 293 bp 为扩增 DHV 获得的目的基因片段 ; 一表示检测结果阴性 ; + 表示检测结果阳性图 A.2 半巢式 PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳图 7

10 附录 B ( 规范性附录 ) 溶液的配制 1) B.1 DEPC H2O 的制备 DEPC H2O 按下列方法进行配制 : 焦碳酸二乙酯 (DEPC):0.1 ml; 双蒸水 :100 ml; 将 0.1mL DEPC 加入 100 ml 双蒸水中配成 0.1% 的水溶液室温作用 12 h 以上, 其间间歇摇混几次或在室温下磁力搅拌 20 min, 然后 Pa 高压灭菌 30 min, 室温保存注 :DEPC 是强的蛋白变性剂和致癌物, 开瓶时要使瓶子尽可能远离人, 因内部的压力可能导致飞溅 B.2 氯仿 + 异戊醇 (RNA 抽提液 ) 的配制氯仿 + 异戊醇 (RNA 抽提液 ) 按下列方法进行配制 : 三氯甲烷 :96 ml; 异戊醇 :4 ml; 在 96 ml 三氯甲烷中加入 4 ml 异戊醇, 室温保存 B mol/l EDTA(pH 8.0) 的配制 0.5 mol/l EDTA(pH 8.0) 按下列方法进行配制 : 二水乙二胺四乙酸二钠 (EDTA-Na2 2H2O):186.1 g; 氢氧化钠 :20.0 g; 双蒸水 : 定容至 ml; 在 800 ml 双蒸水中加入 g EDTA-Na2 2H2O, 在磁力搅拌器上剧烈搅拌, 调节溶液 ph 值至 8.0, 然后定容至 ml, 分装后 Pa 高压灭菌 30 min 室温保存 B.4 凝胶加样缓冲液的配制凝胶加样缓冲液按下列方法进行配制 : 蔗糖 :40.0 g; 0.5 mol/l EDTA(pH 8.0):20 ml; 10%SDS:5 ml; 溴酚蓝 :50.0 mg; 双蒸水 :75 ml; 先将蔗糖完全溶解于双蒸水, 然后按顺序加入其余各成分, 待所有成分溶解混合均匀后, 用 0.22 um 的微孔滤膜过滤除菌,4 保存 B.5 10 mg/ml 溴化乙锭的配制 10 mg/ml 溴化乙锭按下列方法进行配制 : 溴化乙锭 (EB):1.0 g; 1) 所用常规试剂均为分析纯 (AR) 产品 8

11 双蒸水 :100 ml; 在 100mL 双蒸水中加入 1.0 g 溴化乙锭, 磁力搅拌数小时以确保其完全溶解, 然后用铝箔包裹容器或移至棕色瓶中, 保存于室温注 : 溴化乙锭是强诱变剂并带有毒性, 使用含有这种染料的溶液时应戴上手套, 称量时要戴面罩废弃溴化乙锭或含溴化乙锭的电泳液凝胶等要集中回收处理, 处理方法见附录 D B.6 Tris- 硼酸电泳缓冲液的配制 B 倍 Tris- 电泳硼酸缓冲液的配制 5 倍 Tris- 电泳硼酸缓冲液按下列方法进行配制 : Tris:54.0 g; 硼酸 :27.5 g; 0.5 mol/l EDTA(pH 8.0):20 ml; 双蒸水 : 定容至 ml B 倍 Tris- 电泳硼酸缓冲液的配制 1 倍 Tris- 电泳硼酸缓冲液按下列方法进行配制 : 5 倍 Tris- 电泳硼酸缓冲液 :100 ml; 双蒸水 :400 ml 9

12 B 附录 C ( 规范性附录 ) 1%1% 琼脂糖凝胶的制备 C.1 1% 琼脂糖凝胶的制备 C.1.1 将凝胶托架水平放置在工作台上, 放上梳子, 使梳齿下沿距离托架底板 0.5 mm~1.0 mm C.1.2 配制足够量的凝胶 : 称取 1.0 g 琼脂糖, 加入 100 ml 1 倍 Tris- 硼酸电泳缓冲液, 加热溶解琼脂糖 C.1.3 待琼脂糖溶液冷却至约 50 时, 加入 10 mg/ml 溴化乙锭溶液 5 µl, 使其终浓度为 0.5 µg/ml, 充分混合, 避免起泡倒入凝胶托架, 把凝胶厚度控制在 3 mm~5 mm 之间 C.1.4 将凝胶连同托架一起放入电泳槽中, 加入 1 倍 Tris- 硼酸电泳缓冲液, 使之没过凝胶表面约 2 mm, 轻轻拔出梳子, 以备加样电泳附录 D ( 规范性附录 ) 溴化乙锭溶液的净化处理 D.1 浓度大于 0.5 mg/ml 的溴化乙锭溶液的净化处理加入足量的水使溴化乙锭溶液降低至 0.5 mg/ml 以下, 在此溶液中加入 0.2 倍体积新配制的 5% 次磷酸和 0.12 倍体积新配制的 0.5 mol/l 亚硝酸钠, 调节该溶液的 ph 至 3.0 以下, 小心混匀在室温作用 24h, 加入 5 倍量的 1 mol/l 碳酸氢钠溶液, 混合均匀, 倒去溶液 D.2 含有 0.5 µg/ml 溴化乙锭电泳缓冲液的净化处理每 ml 溶液中加入 100 mg 粉状活性炭, 在室温作用 1 h, 不时摇动, 用滤纸过滤溶液, 丢弃溶液, 另用塑料袋封装滤纸和活性炭焚化处理 10

13 附录 E ( 资料性附录 ) 注意事项 E.1 注意事项 E.1.1 本操作程序应在一个无 RNase 和 DNase 的环境下进行, 整个操作过程宜在超净工作台中进行, 并使用一次性手套 E.1.2 玻璃器皿常规洗净后, 用终浓度为 0.1% DEPC 的蒸馏水灌满浸泡,37 处理 2 h 倒去浸泡的 DEPC, 再用灭菌双蒸水漂洗几次 Pa 高压灭菌 30 min 后, 再用 50 烘烤 4 h 以上或 100 干烤 15 min E.1.3 离心管 PCR 反应管加样吸头应使用一次性塑料制品, 使用前均应用 DEPC H2O 处理过或直接购买 RNase Free 产品, 然后经 Pa 高压 30 min 灭菌附录 F ( 资料性附录 ) 试剂 F.1 RNA 抽提试剂盒试剂盒包含了 RNA 抽提所必需 Trizol Solution RW( 稀释液 ) RNase-free H2O, 可从商业生物试剂公司购买使用时按照本规范的要求使用 F.2 PCR 试剂盒试剂盒包含了 PCR 扩增所必需的各种酶 dntps MgCl2 和 PCR 缓冲液等试剂, 可从商业生物试剂公司购买使用时按照本规范的要求使用 11

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

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