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1 复旦学报 医学版 组织因子途径抑制物 3; 基因多态性与急性冠脉综合征的关联性 刘荣乐 李 剑 倪唤春 金 波 朱 军 李延林 沈 伟 施海明 马 端 罗心平 复旦大学附属华山医院心内科 上海 复旦大学基础医学院分子医学教育部重点实验室 上海 摘要 目的 探讨在中国汉族人群中基因多态性与急性冠脉综合征的关系 方法 采用病例对照研究设计 选择急性冠脉综合征 $/!/, 患者 例 其中包括不稳定型心绞痛患者!$0 #, 例 急性心肌梗死患者 $/.$, 例 另有稳定型心绞痛患者!$0 #, 例 以及正常对照 例 采用聚合酶链反应产物直接测序的方法对所有纳入对象进行组织因子途径抑制物 $!!.$ "$%/%0$ (' 基因多态性分析和关联分析 结果 在所有对象的 (' 基因中共检测出 个单核苷酸多态性位点 其中! 和! 位点基因型频率和等位基因频率分布在, 组和, 组 与对照组间差异有统计学意义!!!! 位点在, 组中存在连锁不平衡 与! 位点关联分析提示主要有 ''-'-'- 和 ''-'-'- 两种单倍型!!! 位点在, 组中存在连锁不平衡 与! 位点进行关联分析 主要有 '-'-'- 和 -',',', 两种单倍型, 组与, 组之间未见明显差异 结论 (' 基因! 位点 等位基因和! 位点, 等位基因与冠心病 /%$!!4 发病存在关联性 其变异可能是中国人群冠心病发病的危险因子之一 (' 基因 ( 在冠心病患者中存在连锁不平衡 关键词 组织因子途径抑制物 (' 基因多态性 冠心病 急性冠脉综合征, 单核苷酸多态性 ( 中图分类号 文献标志码,*!!' 0#&#!& 3;!"!"" #' 4'% ) 24 :' 4& + 44'#, 8'(# $%&"%! " 1* -! " $-.!$#$$% $.$!!.$ "$%/%0$ ('# "/"%!$/!/, %! 4""$ / % "/"%!.('#!$$0/ ('!6#"" $! $!$/! $$%#"!$%,#"!!$.,"$$!#!$0#"$$!$ /.$"$$!$%, #"!$0#,"$$!$%$#"!!$.%$%/"" &#%$ 国家自然科学基金!"#$% &'5"

2 复旦学报 医学版 年 月!#$"/"%! (!$!$.('#!0*$!$% #$/".6!.$$%$(!$!!!#! $#"#!60 #$%(!.!!!!.('#!.''-'-'-''-'-'-"$%"$/"!,"$$!#!60 #$% (!.!!!. ('#!.'-'-'--',',',"$%"$/"!,"$$!%!!#.$.0$,#",#"0!,!% $$%/%$!!4"/#$%$$%/#%$0 %#%!.$.4#%!4""$%!""$#!60# (!.('#4"$$! %&$!!.$ "$%/%0$ ('"/"%!/%$!! $/!/,!#$"/"%! ( &1&!!#0(*+,'+)',*,)5 冠状动脉粥样斑块破裂合并血栓形成是急性冠脉综合征 $/!/, 的主要 发病机制 组织因子 $!!.$ 在其中发挥重要作用 ( 和 (' $!!.$ "$%/%0$ '(' 作为体内存在的两种天然的 抑制物 ( 可阻断 激活 发挥抗凝作用 (' 可抑制基质金属蛋白酶家族 $5 $"$!!(! 的活性 而 (! 与斑块的破裂密切相关 是冠脉斑块不稳定 的主要因素 国内外关于 ( 基因多态性与冠心病 /%$!!4 的研究较多 且结果存在差异 $ 等研究发现 尽管 ( 的 1 基因多态性与急性冠脉综合征无明显联系 但是其第 外显子的基因多态性可能与急性心肌梗死 $/.$, 亚组相关 国内研究提示中国北方汉族人群 (' 基因多态性与急性心肌梗死发病无明显 相关性 而关于 (' 基因多态性的研究较 少 ## 等通过对卒中患者的研究发现 (' 基因启动子区某些转录因子结合位点的单核苷酸多态性可能影响该基因的转录 进而影响该基因的调控 有学者对中国人 (' 基因进行测 序分析 发现 处单核苷酸多态性 但意义不明 目前 (' 基因多态性与冠心病的研究尚未见报 道 但有研究发现, 的患者血浆 (' 水平较低 (' 分泌不足可能是, 的潜在原因 为探索 (' 基因的表达与其基因多态性的关 系 本文通过直接测序法探索, 患者 (' 基因是否存在基因多态性 并就 (' 基因多态性与, 的关系进行了分析 资料和方法 研究对象 选择 年 月至 年 月在复旦大学附属华山医院心内科住院的冠心病患者和相匹配的正常对照作为研究对象 冠心病患者均符合 年国际心脏病学会及 +4 临床命名标准化联合专题组报告制定的诊断标准 均经冠状动脉造影证实至少一支冠状动脉狭窄 3, 的诊断参照 & 年指南 根据病史 临床症状和冠状动脉造影结果将该组患者分为冠心病, 组 稳定型心绞痛!$0#, 组以及正常对照组, 组进一步分为不稳定型心绞痛!$0#, 组和心肌梗死组, 组有胸痛症状 但心肌酶学均未见明显异常 正常对照组分为两部分 第一部分为与病例组同期住院行经皮冠脉造影检查 结果为阴性的对象 第二部分为门诊体检行冠脉, 检查 且结果为阴性的对象 排除标准 无行为能力 不能签署知情同意书 合并肝脏 肾脏及造血系统疾病 妊娠或哺乳期妇女 周围血管疾病 脑卒中急性期 感染 高热 风湿性疾病或其他自身免疫性疾病 所有患者由专人收集临床资料 记录年龄 性别 吸烟史 高血压 糖尿病及冠心病家族史 所有研究对象均由医师向患者说明

3 刘荣乐 等 组织因子途径抑制物 (' 基因多态性与急性冠脉综合征的关联性 签署知情同意书 本研究共入选 例 其中, 组 例 包括, 例和, 例, 组 例 正常对照组 例 所有患者记录吸烟史 高血压 糖尿病 冠心病家族史 以及三酰甘油 低密度胆固醇 高密度胆固醇等生化指标 并进行统计学分析 标本采集 所有对象均空腹抽取肘静脉血 常规检测血脂生化等各项指标 病例组于入院后用药前取空腹静脉血 对照组亦取空腹静脉血 置于 3&, 抗凝管中待用 抗凝静脉血标本处理 内 # 离心 收集上 层血浆 以 每管分装 置于 ; 待检 血浆 3; 检测及基因组 6$ 提取 采用酶联免疫吸附试验 &, 测定血浆 (' 试剂盒由 公司提供 采用,5/# 公司生产的小量血液基因组, 快速抽提纯化试剂盒 按照使用说明书提取基因组,; 保存 周 ; 保存 个月内备检 ( 扩增目的基因片段 目的序列的扩增引物设计和合成 针对 (' 启动子区和编码区设计引物 目的基因的标准序列来自 ) -) 引物采用 ( 软件设计 表 引物交由上海杰李生物公司合成 表 '3; 基因启动子区及编码区扩增引物序列 '"#"!##3;!" (! " 9'9!" 9'9 ($ --,,,-,---,,,,,,,,,-, ($,,,,----,,---,,-,,,,-,,,--,-, &5 -,-,,-- -,,,,,-,--- &5,,,,,---,,, -,,,,-,- &5' -,,--,-,,,,,,,,,,,-,,,,-, &5',-,,-,--,,,,-,,,, -,-,,,,,,,-,,,-,, 0 反应体系 聚合酶链反应扩增在 反应体系中进行 取,# 上 下游引物各 6, 聚合酶 莱枫生物有限公司 双蒸水补足体积 冰盆上操作 离心! 混匀 立即置于 ( 扩增仪中 扩增反应在 ( 仪 )$ 美国 上进行 循环参数为冷启动 ; 预变性 ; 变性!8;8 为复性温度 退火!; 延伸! :: 为产物长度 共 个循环 最后 ; 额外延伸 取 产物用 3 琼脂糖凝胶电泳 溴化乙锭染色 检测 0 产物纯化及测序反应 ( 产物纯化及测序反应交由上海杰李生物公司完成 采用 $$/ 软件分析结果 如果检测位点为纯合 则只出现 个单峰 如果是杂合 则会出现双峰 图 图 '$0 患者 位点 ()+'( 的测序图 '#()+'($0! -)",-"%(!$!%!0!6$%, -,!$.-!"$$!

4 复旦学报 医学版 年 月 连锁不平衡及单倍型分析 以连锁不平衡为理论依据的关联分析被认为是定位疾病位点的有效方法 单倍型作为有序的等位基因序列能够很好地反映多个位点之间联合的信息 是关联分析的一种重要数据类型 冠心病是多因素 多基因调控的复杂疾病 故本实验纳入单倍型分析方法 分析 (' 基因多态性与冠心病的关系 统计学分析 采用 ( 软件进行统计分析 计量资料采用 表示 组间比较采用两样本的 检验 多组间均数比较采用方差分析 各组等位基因频率采用直接计数法以百分比表示 组间基因型频率及等位基因频率分布比较采用 检验 同时计算比数比 及 3 可信区间 3 检验基因型频率与 4/'+0# 遗传平衡定律符合程度 两种及以上多态性分布是否连锁不平衡 #!60 组间两个及以上座位连锁不平衡参数 $9 和 值采用 4&!! 在线软件进行分析 以 $9 为标准 参见文 献 单倍型分析也采用 4&!! 软件分析 结 果 一般临床资料比较 本研究所纳入的, 组 稳定型心绞痛组和正常对照组 组研究对象在年龄 性别 胆固醇和三酰甘油水平等方面差异无显著性. 表 表 病例组与对照组临床资料与生化指标的比较 6"!"!"#! ($,#/,, $ - 4/"$! 3 0$!3 $ 3 ' 4' - #,,$/!/,$0# 基因测序结果分析 对所有研究对象进行 (' 基因测序 检测结果 表 共发现 个单核苷酸多态性!#$"/"%! ( 位点 分别是!!!!!!!! 所有研究对象基因型和等位基因频率均符合 4/'+0# 遗传平衡定律. 具有群体代表性 各组间 3; 基因多态性分布的比较, 组与正常对照组比较! 位点和! 位点基因型频率分布和等位基因频率在两组间均存在统计学差异! 位点等位基因 的频率组间差异有统计学意义. 携带 或 - 基因型的个体患, 的风险是携带 -- 基因型个体的 倍 3! 位点等位基因 - 的频率组间差异有统计学意义. 携带 -, 或 -- 基因型的个体患, 的风险是携带,, 基因型个体的 倍 3, 组与对照组比较! 位点和! 位点基因型频率分布和等位基因频率在两组间差异均存在统计学意义! 位点等位基因 的频率组间差异有统计学意义. 携带 或 - 基因型的个体患, 的风险是携带 -- 基因型个体的 倍 3! 位点等位基因 - 的频率组间差异有统计学意义. 携带 -, 或 -- 基因型的个体患, 的风险是携带,, 基因型个体的 倍 3, 组与, 组比较 所有 ( 位点基因型频率分布和等位基因频率差异均无统计学意义. 表 各组间 3; 基因多态性位点间连锁不平衡分析, 组与正常对照组比较 对所有 ( 位点进行连锁不平衡分析 发现 个 ( 位点!!! 和! 存在连锁不平衡现象 表 结合两组间存在统计学差异的! 位点进行单倍型分析 该 个 ( 位点以 ''-'-'- 和 ''-'-'- 组合时 个体患, 的风险有所增加 且具有统计学意义 表

5 刘荣乐 等 组织因子途径抑制物 (' 基因多态性与急性冠脉综合征的关联性 表 ($0 组 $ 组和正常对照组间 3; 基因不同 的基因型和等位基因频率分布 (6##!#3;$0$!! ( -$/".6, $,,.6 -$/".6,.6 -$/".6,.6!! !,,,,,,,,,,,,!,, -, -- -,,, -, -- -,,, -, -- -,!,, -, -- -,,, -, -- -,,, -, -- -,!,, -, -- -,,, -, -- -,,, -, -- -,!,,,,,,,,,,,,! -- -,,, -, -- -,,, -, -- -,,, -,,"$.,"$. 表 $0 组与对照组 个位点连锁不平衡分析 71"## $0! (! $9!!!!!!!!!!!! $9, 组与对照组比较 对所有 ( 位点进行连 锁不平衡分析 发现 个 ( 位点!! 和! 存在连锁不平衡现象 表 结合两组间存在统计学差异的! 位点进行单倍型分析 这 个 ( 位点以 '-'-'- 和 -',',', 组合时 个体患, 的风险有所增加 且具有统计学意义 表, 组与, 组比较 对所有 ( 位点进行连锁不平衡分析 未发现 ( 位点存在连锁不平衡现象 结合所有 ( 位点进行单倍型分析 发现这 个 ( 位点以 '-','-'-',''- 和 ''',',',',', 组合时 个体患, 的风险更大 且具有统计学意义 表

6 复旦学报 医学版 年 月 表 $0 组与对照组 个位点单倍型分析结果 9!!##$0!!!!!!! $ 表 $ 组与对照组 ( 个位点位点连锁不平衡分析 71"# $! (! 9!"+!!"+!!"+! 冠心病亚组 3; 基因型频率及等位基因频率分布的比较 选取有统计学意义的两个 ( 将, 组分为, 组和, 组亚组 与, 组进行比较 进行亚组间分析 发现!! 的基因型频率和等位基因频率在 组间差异无统计学意义 表 $9 表,$ 组与对照组 个位点单倍型分析结果,9!!##$!!!!!! $3.,,, ,,, 表 )$0 组与 $ 组 ) 个位点位点连锁不平衡分析 )9!!#$0$!!!!!!!!!! $3., - - -, - -, - -, -,,,,, 表 + 异常分布基因型在冠心病不同亚组间分布频率的比较 +6#+)*(+)()+'(!#3;(!#096,,, (-$/" -$/".6,.6 -$/".6,.6 -$/".6,.6! !,, -, -- -,,, -, -- -,,, -, -- -,,,$/.$,!$0#,$0#,"+,,"+,. 血浆 3; 水平检测 根据测序结果 取 行分析 结果 图 显示 等位基因组 (' 水! 位点上为 等位基因和 - 等位基因的 平为 #- 等位基因组 (', 病例各 例 分别检测血清 (' 水平 进 水平为 # 两组间差异无统计学

7 刘荣乐 等 组织因子途径抑制物 (' 基因多态性与急性冠脉综合征的关联性 意义. 干预靶点 关于 ( 的基因多态性已有较多的研究 ( 基因位于人染色体 66 含 个外显子和 个内含子 长 0 目前已发现的 ( 基因多态性有 种 外显子 ( 多态性 9' 的 多态性 外显子 // 多态性 内含子 ' 多态性 外显子 -,1$ 多态性 以及 9' ' 多态性 研究发现 内含子 ' 多态性影响血浆 ( 水平 基因型与血浆总 ( 图 +)*(+) 位点上为 0 等位基因和 等位基因的 $0 病例血浆 3; 水平 "#3;$0!&0 +)*(+) 讨 论, 是冠心病的一种 是一组严重危及生命的常见病 主要发病机制是冠脉粥样斑块破裂 暴露大量 启动凝血系统 继而血栓形成 斑块内 (! 的活性增加 分解基质胶原纤维 破坏斑块 纤维帽是斑块破裂的重要原因 作为 的体内天然抑制物 糖蛋白 ( 及 (' 在拮抗 的致血栓效果方面发挥重要作用 ( 是一种重要的 1 抑制物 3 3 的 ( 存在血浆中 相对分子质量多为 或 并多与脂蛋白结合为复合物 内皮是体内合成 ( 的主要部位 内皮内占 3 3(' 是近来发现的一种 $ 型丝氨酸蛋白酶抑制剂 也称为胎盘蛋白 ' "$ "$'((' 体内的 (' 主要由内皮细胞分泌 在内皮细胞受损或受到某种因素的刺激下动员入血 大多与脂蛋白结合 成为游离 (' 它与 ( 有相似的结构和功能 在启动外源性凝血 途径和血栓的形成中起到了重要作用 本课题组在前期研究发现 (' 与动脉粥样硬化关系密 切 动物实验表明 兔动脉粥样硬化不稳定斑块内 (' 基因及蛋白表达有明显异常 临床 研究提示 与对照组相比, 的患者血浆 (' 水平较低 #!$ 多元回归分析显示 血浆 (' 下降 血浆 (' 和 %( 水平升高与, 的发病相关 (' 分泌不足可能是, 的潜在原因 (' 有望作为, 新的临床 抗原水平升高有关 但 ' 多态性与总 ( 水平及肝素释放游离 ( 水平显著降低相关 有研究探讨了在中国人群中组织因子途径抑制物基因第 外显子 -',1 多态性与, 的关系 其对血浆游离 (' 水平可能有影响 与, 发病不存在相关性 其他结果多提示 ( 基因的突变与冠心病的发生不存在相关性 而 (' 是 及 (! 的抑制剂 可抑制 发起血液凝血级联反应 影响 (' 血浆水平变化的一个重要因素是患者的遗传背景 (' 的基因多态性能够调节 (' 的表达 从而影响 (' 的作用 基于以上理由 我们假设 ( 基因的突变可导致 (' 的表达水平改变 这种遗传变异可能参与了, 的发生 以往有关 (' 基因多态性的研究多集中在肿瘤学领域 研究发现肿瘤患者的预后与 (' 基因多态性相关 同时也有研究发现 (' 的基因多态性与缺 血性中风的发生相关 但目前有关 (' 基因多态性与冠心病关联性的研究却少见报道 我们这项研究的目的是探讨 (' 基因多态性与, 形成风险之间的相关性 本研究共分析了 例汉族人群的 (' 基因资料 对与 (' 表达相关的启动子区 编码区进行了检测 共发现!!!!!!!! 共 个 ( 位点 与正常对照组比较 其中! 位点和! 位点基因型频率分布和等位基因频率差异在, 组和, 组间均存在统计学意义! 位点等位基因 的频率分布在, 组和, 组中均有显著差异 携带 或 - 基因型的个体患, 和, 的风险分别是携带 -- 基因型个体的 倍和 倍! 位点等位基因 - 的频率分布在, 组和, 组中均有显著

8 复旦学报 医学版 年 月 差异 携带 -, 或 -- 基因型的个体患, 和, 的风险分别是是携带,, 基因型个体的 倍和 倍 而, 组与, 组比较 未发现有统计学差异的 ( 位点 提示 (' 基因! 位点 等位基因和! 位点, 等位基因与, 和, 发病有密切关联 是冠心病的发病风险因子 因为冠心病是一个由多因素 多基因调控的复杂疾病 所以本研究纳入单倍型分析方法 更有效地分析 (' 基因多态性与冠心病的关系 我们发现!!!! 位点在, 组中存在连锁不平衡 与! 位点关联分析提示主要有 ''-'-'- 和 ''-'-' - 两种单倍型 提示若患者的 (' 等位基因按这两种单倍型存在时 其发, 的风险分别是正常人的 倍和 倍 类似地!!! 位点在, 组中存在连锁不平衡 与前期组间有统计学意义的! 位点联合进行关联分析 发现主要有 '-'-'- 和 -',',', 两种单倍型 提示若患者的 (' 等位基因按这两种单倍型存在时 其发, 的风险分别是正常人的 倍和 倍 其中, 组与, 组比较未见差异 关联分析的结果提示 虽然有些 ( 位点在病例组与对照组之间无基因型和等位基因频率的差别 但因为同处于 (' 基因上 且部分 ( 位点之间存在连锁不平衡 所以当这些位点以特定单倍型存在时 也会增加个体患冠心病的风险 为进一步分析 (' 基因多态性与, 的关系 我们将所有冠心病病人分成, 组, 和, 组 个亚组进行分析 异常分布的! 位点和! 位点基因型频率和等位基因频率在各亚组间分布差异均未有统计学意义 因为 (' 基因多态性可能参与调控 (' 基因的功能 从而影响血浆 (' 的水平 所以我们筛选出! 位点上为 等位基因和 - 等位基因的, 病例各 例 分别检测血清 (' 水平 结果显示两组间差异无统计学意义 考虑可能与所选样品数较少有关 而该位点是否影响转录因子的结合还有待进一步证明 本研究发现 (' 基因多态性位点与冠心病的发生密切相关 而由于, 组, 和, 亚组样本量较小, 组与, 组间未见明显差异 故 (' 基因多态性位点与动脉粥样硬化斑块不稳定性的关系有待进一步研究 本研究结果有助于解释 (' 是冠心病发病的风险因子 为进一步验证 (' 在冠心病发病中的作用 筛选临床检验指标 防治高危人群提供了一定参考 本研究存在样本量不大 人群基因背景复杂 未同步进行所有样品血液 ('(! 水平检测等不足之处 对照组也并未全部行冠脉造影检查 部分研究对象仅做冠脉, 检查 并不能完全排除存在动脉粥样硬化的人群 因此 本组资料还不能确证 (' 基因多态性与, 发病关系的必然联系 这些有待于进一步设计大规模 随机 前瞻性的临床研究来验证 致谢 张睿 云南省宜良县第一人民医院心内科 和于佳 复旦大学附属华山医院心内科 医师在病历资料收集和病史查询等方面给予了帮助 参 考 文 献 -0!,%$!.$% #$. '!#$$ $ /.$.$%&"$/.#/ & & -!. $% #$.$ /.$ "$$! "!$# $% '!#$ $ &!$,!+!!.$ "$%/%0$'! 0/.!%!$!!!!$%!!.$!".$!6 /-#, 1&5"!! $.$!!.$ "$%/%0$!' $%!$%!!! &*6 $*(-(/"%!!. $%$!!.$ "$%/ %0$ ( # "$$! $% $/!/! %$%/!0*$!"$.$% 1!0!$$$ "!!.(&*6- 陈桂英 王晓梅 周立君 等 中国北方汉族人群 ( 基因多态性与急性心肌梗死的关系研究 哈尔滨医科大学学报 ##%/&-%,/!!.!6 $!$% "$ #.$% % $!!.$ "$%/%0$ #""$"$$! 0!& 徐勇 刘雪燕 李体远 等 中国人 (' 基因的克隆及测序分析 国外医学 临床生物化学与检验学分册 赵碧莲 刘鸿元 倪唤春 等 老年急性冠状动脉综合征早

9 刘荣乐 等 组织因子途径抑制物 (' 基因多态性与急性冠脉综合征的关联性 期血浆组织因子及其途径抑制物 的变化规律 上海医学 22%# 2 4 2, "$$'#$' 0$'!0! & #$%. %"$/".$%$!"$.$%4&!! ) % ("",#$. ((' ((' $$ 0/ $!!.$ "$%/ %0$'$5'!!$! "$! %0$ -& -% )&& %4!$! +$$.$ 0#/.$!!.$ "$%/%0$'&* & 朱颖 罗心平 马端 等 源性泡沫细胞形成中组织因子途径抑制物 的表达定位及变化规律 中国动脉 硬化杂志 黄成磊 罗心平 李剑 等 兔股动脉粥样硬化斑块模型中 及 ( 的变化规律 复旦学报 医学版 王君 朱铁兵 杨志健 急性冠状动脉综合征患者组织因子途径抑制物基因 1 的多态性 中国动脉硬化杂志!% 4$ 4,!!$.,! $$$!!.$ "$%/%0$' 0$ $% "!$$$!!.$ "$%/%0$ -!* (!,4! &!! ( # $!%!$&*) 收稿日期 编辑 张秀峰 上接第,) 页 %*4)/ &4$ )4&$% $0$"$$!$%!"0$ "!. $!%$6/#!"!,$) + 8%$0$.$/!""!$.! %$# $% "5$/. $% $0$ 88: 7$4/!"!!$ $%$0$ $%$% -!"/#!" "!.! $! 5 :&4&$.!.$0$ $% $% -" $!% /#!" 0/!$%$!$!!$!/.$/#!"/,#)-$%%$0$!# $!%/#!" -""$$! $%!"0$- 收稿日期 编辑 张秀峰

高 云 钟良军 张源明 周晓欢 梁 平 徐 隽 探讨兔牙周炎对动脉粥样硬化炎性因子的影响及抗生素对其的作用 将 只雄性新西兰大白兔随机分为 组 组为对照组 组为牙周炎组 组为动脉粥样硬化组 组为牙周炎 动脉粥样硬化组 组为干预组 牙周炎 动脉粥样硬化 替硝唑组 各组分别按照实验设计进行相应干预处理 周末处死动物 检测牙周指标 血清中总胆固醇 三酰甘油 高密度脂蛋白胆固醇 低密度脂蛋白胆固醇 反应蛋白

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