第 1 期 丁艺, 等.Betatrophin 基因多态性与 2 型糖尿病的相关性 73 感基因的发现和相关机制研究, 以及对 T2DM 的早期预测和防治具有重要意义 Betatrophin 又名血管生成素样蛋白 8(Angptl8), 是一种主要在肝脏及脂肪组织表达的分泌蛋白, 在胰岛素抵抗 糖脂

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1 第 29 卷第 1 期 2019 年 1 月 江苏大学学报 ( 医学版 ) JournalofJiangsuUniversity(MedicineEdition) Vol.29 No.1 Jan.2019 Betatrophin 基因多态性与 2 型糖尿病的相关性 丁艺, 李昊翔, 徐梦娇, 袁婧, 赵丽, 王东, 杨玲, 袁国跃 ( 江苏大学附属医院内分泌代谢科, 江苏镇江 ) [ 摘要 ] 目的 : 探讨 Betatrophin 基因 rs 多态性与 2 型糖尿病 (T2DM) 的相关性 方法 : 分别选取 T2DM 患者 (T2DM 组 ) 和健康者 ( ) 各 200 例, 采用聚合酶链式反应 限制性片段长度多态性 (PCR RFLP) 技术, 对 Betatrophin 基因 rs 多态性进行检测 结果 :T2DM 组 Betatrophin 基因 rs 位点 C/T+T/T 基因型及 T 等位基因的频率明显高于 (P<0.05) C/T+T/T 基因型携带者空腹血糖及 120minOGTT 血糖 (2hPG) 明显高于 C/C 基因型携带者 (P<0.05) Logistic 回归分析显示,Betatrophin 基因 rs t 等位基因相对于 C 等位基因, 增加 T2DM 的发病风险 结论 :Betatrophin 基因 rs 多态性可能与 T2DM 的发生有关,T 等位基因可能增加 T2DM 的发病风险 [ 关键词 ] Betatrophin; 单核苷酸多态性 ;2 型糖尿病 [ 中图分类号 ] R587.1 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (2019) DOI: /j.isn y [ 引用格式 ] 丁艺, 李昊翔, 徐梦娇, 等.Betatrophin 基因多态性与 2 型糖尿病的相关性 [J]. 江苏大学学报 ( 医学版 ),2019,29(1): Asociationbetweenthepolymorphism ofbetatrophingene andtype2diabetesmelitus DINGYi,LIHao xiang,xumeng jiao,yuanjing,zhaoli,wangdong,yangling,yuanguo yue (DepartmentofEndocrinology,AfiliatedHospitalofJiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212001,China) [Abstract] Objective:Toinvestigatetheasociationbetweenrs polymorphism ofbetatrophin geneandtype2diabeticmelitus(t2dm).methods:a totalof200subjectswitht2dm (T2DM group)and200healthycontrols(controlgroup)wereenroledinthisstudy.thegenotypeofbetatrophin SNPrs wasdetectedbythepolymerasechainreaction restrictedfragmentlengthpolymorphism (PCR RFLP).Results:ThefrequencyofC/T+T/TgenotypeandTaleleofrs weresignifi cantlyhigherint2dmgroupthanthoseincontrolgroup(p<0.05).fastingplasmaglucoseand120min OGTTglucose(2hPG)incarierswithC/T+T/TgenotypewerehigherthanthosewithCCgenotype. LogisticregresionanalysisshowedthattheriskofT2DMincreasedinbetatrophinrs Talelecar rierscomparedwiththosewithcalele.conclusion:thebetatrophinrs genepolymorphismmay beasociatedwitht2dm.thetalelemayincreasetheriskoft2dm. [Keywords] Betatrophin;singlenucleotidepolymorphism;type2diabetes 近年来,2 型糖尿病 (T2DM) 患病率在全球范围内逐年上升, 据统计, 截至 2017 年全球 20~79 岁糖尿病患者约 4.25 亿, 预计到 2045 年将上升至 6.29 亿, 其中 T2DM 约占 90% [1] T2DM 是由遗传和环 境因素共同作用导致的一种代谢性疾病, 其中, 遗传因素在 T2DM 的发生发展中起着非常重要的作用 大量研究表明, 一些基因的单核苷酸多态性 (SNP) 与糖尿病的发生发展相关 [2], 因此 SNP 对 T2DM 易 [ 基金项目 ] 国家自然科学基金资助项目 ( , ); 江苏省自然科学基金资助项目 (BK ); 江苏省重点研发计划项目 (BE ); 江苏省高层次卫生人才 六个一工程 项目 (LGY ); 江苏省 六大人才高峰 第十二批高层次人才项目 (2015 WSN 006) [ 作者简介 ] 丁艺 (1993 ), 女, 硕士研究生 ; 袁国跃 ( 通讯作者 ), 主任医师, 教授, 博士生导师,E mail:yuanguoyue@ hotmail.com

2 第 1 期 丁艺, 等.Betatrophin 基因多态性与 2 型糖尿病的相关性 73 感基因的发现和相关机制研究, 以及对 T2DM 的早期预测和防治具有重要意义 Betatrophin 又名血管生成素样蛋白 8(Angptl8), 是一种主要在肝脏及脂肪组织表达的分泌蛋白, 在胰岛素抵抗 糖脂代谢等方面发挥着重要作用 [3-4] 研究发现, 在 db/db 糖尿病模型鼠中,Betatrophin 在肝脏和脂肪组织中的表达增加, 同时血清 Betatro phin 水平显著升高 [5] [6] Rong 等研究发现, 在小鼠肝脏中过表达 Betatrophin, 小鼠血糖状况改善, 且在 HepG2 细胞中 Betatrophin 可能影响糖原合成和糖异生 本课题组国内外首次发现 T2DM 患者血清 Betatrophin 水平显著升高与胰岛素抵抗相关 [7] 国外有研究表明,Betatrophin 基因 rs c/t 基因型携带者患 T2DM 的危险性增加 [8] 而该基因多态性与 T2DM 的关系国内尚未见报道 本研究以江苏地区汉族 T2DM 患者为研究对象, 通过检测 Betatro phin 基因 rs 多态性, 探讨该位点与 T2DM 的相关性 因组 DNA 提取试剂盒提取外周血 DNA 以 DNA 为模板采用 PCR 方法扩增含有 SNP 位点的 DNA 片段 Betatrophin 基因上游引物为 5 CAGGAGTTC TATTGTGCGGC 3 ; 下游引物为 5 CCTGATGCAAC TATCGCACC 3, 由上海生工公司合成 PCR 总反应体系为 20μL, 包含 5 PCR 反应缓冲液 4μL,10 mmol/ldntp 混合液 0.4μL,10μmol/L 引物各 0.8 μl,dna 聚合酶 0.4μL, 模板 DNA0.8μL, 余用双蒸水补齐 PCR 的扩增反应条件 :94 预变性 5min,94 变性 15s,60 退火 15s,72 延伸 15 s, 循环 35 次, 最后 72 延伸 5min 扩增片段长度 387bp PCR 产物利用限制性内切酶 BseGI(Ther moscientific 公司 ) 进行酶切,55 水浴酶切过夜 以 3% 琼脂糖凝胶电泳酶切产物后观察结果 ( 图 1),C/C 型可见 1 条条带 (387bp),C/T 型可见 2 条条带 ( bp),T/T 型可见 1 条条带 (331bp), C/T 型 T/T 型另有 56bp 条带, 由于迁移速度过快而不可见 [9] 1 对象与方法 1.1 研究对象选取 2016 年 3 月至 2018 年 5 月在江苏大学附属医院内分泌科就诊的 T2DM 患者 (T2DM 组 )200 例, 均符合 1999 年 WHO 糖尿病诊断标准, 其中男 110 例, 女 90 例, 平均年龄 (54.16±10.56) 岁 ; 并选取同期健康体检者 200 例作为, 其中男 92 例, 女 108 例, 平均年龄 (52.82±10.32) 岁 T2DM 组排除 1 型糖尿病 特殊类型糖尿病 糖尿病急性并发症或严重慢性并发症以及严重心 肝 肾功能不全等 本研究经医院伦理委员会批准 1.2 临床及生化指标检测采用统一标准测量并记录研究对象身高 体重 腰围 臀围 血压等一般临床资料, 并计算体重指数 (BMI) 腰臀比等 研究对象空腹 10h 后, 采集血液, 然后行口服葡萄糖耐量试验 (OGTT) 及胰岛素释放试验, 采用葡萄糖氧化酶法检测空腹血糖及 120minOGTT 血糖 (2hPG), 高效液相层析法测定糖化血红蛋白 (HbA1c), 放射免疫法测定空腹胰岛素 (FIns), 酶法测定三酰甘油 总胆固醇 高密度脂蛋白胆固醇 (HDL C) 及低密度脂蛋白胆固醇 (LDL C) 采用稳态模型评估胰岛素抵抗指数(HOMA IR), 即 HOMA IR= 空腹血糖 FIns/ Betatrophin 基因 rs c/t 多态性检测使用天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司的血液基 M:500bpDNA 标准参照物 ;1 2:C/C 基因型 ;3 4:C/T 基因型 ;5 6:T/T 基因型图 1 Betatrophin 基因 SNP 位点 rs 的基因型电泳分型 1.4 DNA 测序为验证基因分型结果的准确性, 随机选取代表不同基因型的 PCR 扩增产物的标本, 外送华大基因公司进行双向测序, 结果见图 统计学处理应用 SPSS16.0 软件进行统计学分析 正态分布计量资料以 x±s 珋表示, 两组间比较采用独立样本 t 检验 计数资料以例 (%) 表示, 采用 χ 2 检验 Hardy Weinberg 平衡采用拟合优度 χ 2 检验 Logistic 回归分析 SNP 位点与 T2DM 发病的风险关系 P< 0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 两组临床资料及生化指标比较 T2DM 组 BMI 腰臀比 收缩压 空腹血糖 2hPG

3 江苏大学学报 医学版 第 卷 F HbAc 三酰甘油 HOMA R均明显高于对照 舒张压 总胆固醇 LDL C 尿酸等差异均无统计学 组 而 HDL C明显低于 P 两组间 意义 P 见表 图 Be h 基因多态性测序结果 表 两组临床资料及生化指标的比较 男 女 例 年龄 岁 BM k g m 腰臀比 收缩压 mmhg 舒张压 mmhg ± ± ± ± ± DM组 ± ± ± ± ± χ值 Hb Ac 空腹血糖 mm h PG mm F μ U 三酰甘油 mm ± ± ± ± ± DM组 ± ± ± ± ± 值 总胆固醇 mm HDL C mm LDL C mm 尿酸 μm HOMA R ± ± ± ± ± DM组 ± ± ± ± ± 值 两组 Be h 基因 基因型和等 位基因频率比较 不同基因型临床资料及生化指标比较 在所有受试人群中 与 C C基因型比较 C 和 DM 组基因型分布均符合 H d y 基因型携带者空腹血糖 hpg水平明显增高 We be g遗 传 平 衡 定 律 χ P P 而 BM 腰 臀 比 HbA c F 三 酰 甘 DM 组 Be h 基 因 位 点 油 总胆固醇 HDL C LDL C HOMA R等指标的差 C 基因型及 等位基因的频率明显高于对 见表 异无统计学意义 P 照组 χ P 见表 DM相关因素的 L g c回归分析 以 DM 发生与否为因变量 以 Be h 基 表 两组 Be h 基因 基因型及等位基因频率比较 基因型 CC C 例 酰甘油 总胆固醇为自变量 行 L g c回归分析 等位基因 C DM组 与比较 P 因 等位基因 年龄 性别 BM 收缩压 三 h 基因 结果提示 年龄 收缩压 Be 等位基因可能为 DM 发生的危险因素 Be h 基因 等 位 基 因 相 对 于 C等 位 基 因 增加了 DM的发病风险 见表

4 第 1 期 丁艺, 等.Betatrophin 基因多态性与 2 型糖尿病的相关性 75 表 3 不同基因型 T2DM 患者临床资料和生化指标比较 BMI (kg/m 2 ) 腰臀比 HbA1c(%) 空腹血糖 2hPG FIns (μiu/l) CC 24.92± ± ± ± ± ±14.03 CT+TT 24.09± ± ± ± ± ±19.48 t 值 P 值 三酰甘油 总胆固醇 HDL C LDL C 尿酸 (μmol/l) HOMA IR CC 1.70± ± ± ± ± ±5.39 CT+TT 1.84± ± ± ± ± ±6.82 t 值 P 值 表 4 T2DM 相关因素的 Logistic 回归分析 变量 回归系数 标准误 Waldχ 2 P OR 95%CI 年龄 ~1.037 收缩压 ~1.076 rs (t) ~ 讨论 Betatrophin 是一种由 198 个氨基酸组成的新型分泌蛋白, 与糖脂代谢及胰岛素抵抗密切相关 [3-4] 临床研究表明, 血清 Betatrophin 水平升高与 T2DM 妊娠期糖尿病 代谢综合征相关 [10-13], 同时也与糖尿病并发症, 如糖尿病肾病 糖尿病视网膜疾病等相关 [14-15] 本研究发现,T2DM 组 Betatrophin 基因 rs 位点 C/T+T/T 基因型及 T 等位基因频率明显高于 ;Logistic 回归分析进一步提示, Betatrophin 基因 rs t 等位基因增加了 T2DM 的发病风险 有研究显示, 携带 rs c/t 基因型的非糖尿病阿拉伯人的空腹血糖水平显著高于 C/C 基因型的携带者 [16] [17] Liu 等对日本人群的研究结果发现, 与 Betatrophin 基因 rs c/c 基因型相比, 在 C/T 和 T/T 基因型携带者中,T2DM 和糖耐量受损 (impairedglucosetolerance,igt) 患者比例更高 在伊朗人群中,T2DM 患者该 SNP 位点 C/T 基因型频率显著高于, 该基因型显著增加了 T2DM 的发病风险, 且 C/T 基因型与空腹血糖 FIns HbA1c 和胰岛素抵抗相关 [8] 本研究结果也显示 Betatrophin 基因 rs 多态性与 T2DM 的发生有关, 且与 C/C 基因携带者比较,C/T+T/T 基因型携带者空腹血糖 2hPG 值增高, 与上述研究 结论一致 Betatrophin 基因 rs 多态性与脂代谢可能相关 在非裔美国人和西班牙人中,T 等位基因携带者与 C 等位基因携带者相比, 有较低水平的 LDL C [18] 一项关于广西正常人群 Betatrophin 基因多态性与血脂相关性的研究, 也观察到相似结果 [9] [18] [16] 但在欧裔美国人及阿拉伯人中该 SNP 位点与血脂相关指标没有相关性 在本研究中,C/ T+T/T 基因型携带者与 C/C 基因型携带者相比, LDL C 和 HDL C 水平有降低的趋势, 但无统计学意义, 这可能与样本量大小有关 此外, 本研究显示, 在江苏地区汉族人群中, 的 Betatrophin 基因 rs 位点最小等位基因频率 (MAF) 为 19.50%, 高于阿拉伯人的 6.18% [16] 欧洲裔美国人的 5% [18], 与非洲裔美国人的 18% [18] 广西汉族的 17.80% [9] 相近, 而略低于广西仫佬族的 23.04% [9] 及西班牙人的 26% [18] 由此可以推断,Betatrophin 基因 rs 位点多态性存在种族及地域差异 这种种族及地域的异质性可能造成了本研究与其他研究结果的差异 目前 Betatrophin 基因 rs 多态性的作用机制尚不明确 有研究推测, 由于精氨酸在该位点取代色氨酸, 导致 Betatrophin 蛋白的结构不稳定, 影响其与其他蛋白的相互作用 [8], 从而导致糖脂代谢紊乱, 进而参与 T2DM 的发生发展 然而这个假说

5 76 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 29 卷 还需要进一步的研究论证 综上所述, 本研究初步发现江苏地区汉族人群 Betatrophin 基因 rs 多态性与 T2DM 的发生有关,T 等位基因携带者患 T2DM 的发病风险增加 但本研究存在一定的局限性, 比如样本量较小, 且未验证该 SNP 对 Betatrophin 表达的影响 此外,Be tatrophin 基因 SNP 可能受到种族 环境等因素影响 因此未来还需要进行大样本 多中心的研究, 以明确不同种族 地域人群中 Betatrophin 基因 SNP 的功能作用, 深入探究其确切机制 [ 参考文献 ] [1] ChoNH,ShawJE,KarurangaS,etal.IDFDiabetes Atlas:globalestimatesoftheprevalenceofdiabetesfor 2017and2045[J].DiabetesResClinPract,2018,138: [2] StaigerH,MachicaoF,FritscheA,etal.Pathomecha nismsoftype2diabetesgenes[j].endocrrev,2009, 30(6): [3] Abu FarhaM,AbubakerJ,TuomilehtoJ,etal.AN GPTL8(betatrophin)roleindiabetesandmetabolicdis eases[j].diabetesmetabresrev,2017,33(8): e2919. [4] SiddiqaA,CiriloE,TareenSHK,etal.Visualizing theregulatoryroleofangiopoietin likeprotein8(an GPTL8)inglucoseandlipidmetabolicpathways[J]. Genomics,2017,109(5/6): [5] LiE,NakataM,ShinozakiA,etal.Betatrophinex presionispromotedinobesehyperinsulinemictype2 butnottype1diabeticmice[j].endocrj,2016,63 (7): [6] RongGX,LiWX,ChenY,etal.ANGPTL8/betatrophin aleviatesinsulinresistanceviatheakt GSK3βorAkt FoxO1pathwayinHepG2cels[J].ExpCelRes, 2016,345(2): [7] HuH,SunW,YuS,etal.Increasedcirculatinglevelsof betatrophininnewlydiagnosedtype2diabeticpatients [J].DiabetesCare,2014,37(10): [8] GhasemiH,KarimiJ,KhodadadiI,etal.Asociation betweenrs (c/t)andrs892066(c/g)vari antsofangptl8(betatrophin) andsusceptibilityto type2 diabetes melitus[j]. J Clin Lab Anal, 2018:e [9] GuoT,YinRX,WuJ,etal.Asociationoftheangio poietin likeprotein8rs polymorphismandsev eralenvironmentalfactorswithserum lipidlevels[j]. MolMedRep,2015,12(3): [10] ChenX,LuP,HeW,etal.Circulatingbetatrophinlev elsareincreasedinpatientswithtype2diabetesandas sociatedwithinsulinresistance[j].jclinendocrinol Metab,2015,100(1):E [11] Al DaghriNM,RahmanS,SabicoS,etal.Circulating betatrophininhealthycontrolandtype2diabeticsub jectsanditsasociationwithmetabolicparameters[j].j DiabetesComplications,2016,30(7): [12] 卢冰, 王苏, 洪霞飞, 等. 血清 Betatrophin 水平与妊娠期糖尿病的相关性研究 [J]. 中国糖尿病杂志,2018 (1): [13] WangH,LaiY,HanC,etal.Theefectsofseruman gptl8/betatrophinontheriskofdevelopingthemetabolic syndrome aprospectivestudy[j].scientificreports, 2016,6: [14] ChantC,SusantoH,ChuangWH,etal.Higherserum betatrophinlevelintype2diabetessubjectsisasociated withurinaryalbuminexcretionandrenalfunction[j]. CardiovascDiabetol,2016,15(1):3. [15] WangY,ZhangD,JiangZ,etal.Positiveasociation betweenbetatrophinanddiabeticretinopathyriskintype 2diabetespatients[J].Horm MetabRes,2016,48 (3): [16] Abu FarhaM,Melhem M,AbubakerJ,etal.AN GPTL8/betatrophin R59W variantisasociated with higherglucoselevelinnon diabeticarabslivinginku waits[j].lipidshealthdis,2016,15(1):26. [17] LiuJ,YagiK,NoharaA,etal.Highfrequencyoftype 2diabetesandimpairedglucosetoleranceinJapanese subjectswiththeangiopoietin likeprotein8r59w vari ant[j].jclinlipidol,2018,12(2): [18] QuagliariniF,WangY,KozlitinaJ,etal.A typical angiopoietin likeproteinthatregulatesangptl3[j]. ProcNatlAcadSciUSA,2012,109(48): [ 收稿日期 ] [ 编辑 ] 何承志

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