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瑾远池
5 years ago
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1 复旦学报医学版 2 基因与人类神经管畸形 1+ 的相关性周翔宇杨雪艳聂晨霞陈瑛王红艳李红复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室现代人类学教育部重点实验室上海苏州市立医院生殖与遗传中心苏州长治医学院生物教研室长治摘要目的探讨,' 基因序列变异与人类神经管畸形 '"*" 发生的相关性方法应用 %! 和 #" 技术在例患者和例对照人群中进行,' 基因突变扫描和关联分析结果在患者的,' 基因中共检测到个新发现的序列变异位点 %%7 )%7) 和 % 其中 %%7) 位点变异在例对照人群中未检测到其为患者所特有的变异位点对 %%7) 和 % 这个位点的关联分析结果表明在显性遗传模式下位点的等位基因与的发生显著相关携带或基因型的个体的患病风险是携带基因型的个体的倍 (8- 生物信息学预测结果表明位点的等位基因会改变转录因子 % 和 9 对该区域的结合结论 %%7) 和位点的等位基因是人类发生的遗传性风险因子关键词神经管畸形平面细胞极性信号通路,' 基因变异位点突变中图分类号文献标志码 )1% 1#%2 #1+ 9.( :!%+ 4)7 :%+ -$#%,.$ 4! 2)7.!%+ -.! %!.!1!.!1!$&! )#!% %-#!"%!!$! $*#!#% )!+!%(!"$!!&' $! )#!$$! %!"$! "#.#/!,'"#""",'!#&' "*" 0 ""!%"'"+" """' """#!#%!#"# "%%7)%7)%"*,'!* "")&!"#&%%7) %*"##""" '"' "")""+&"""#" ''!*"'+""#&"&-'"# 上海市自然科学基金面上项目 9 教育部博士点新教师基金!"#$%&'#!'!&'&

2 周翔宇等,' 基因与人类神经管畸形的相关性!"+#%*'"*"+"#"#!''( 8-0*&"'+""#"'' '"""#!*"+*""*"% 9& "#'' '''%%7)!"*"#& $%'"*" '' '"+ "#+,'!"&"" 1%%#*0:;8999+*0- (':884 神经管畸形 '"*" 是一类常见的严重出生缺陷由胚胎发育早期神经管不闭合或闭合不全而引起常见表型主要有无脑儿脑膨出颅脊柱裂脊柱裂等我国山西省是世界上的高发地区发病率达到国内外研究已经证实母体孕期补服叶酸能够有效降低发病率但具体机制尚不清楚目前已有超过个基因被报道与发病有关越多越多的动物实验结果表明平面细胞极性 '' '"+ 信号通路相关基因与的发生密切相关信号通路又称非经典 2" 信号通路在胚胎发育早期对汇聚延伸运动进行调控进而影响到神经管的闭合果蝇等模式生物的研究结果显示参与信号传导与调控的核心基因包括,-2 3,3.%)*- $%* 等,'!'%'" 6"!" "0 基因属于, 基因家族编码产生分泌信号蛋白这些蛋白在胚胎发育时期参与细胞命运和组织分化类型的调控并被认为与肿瘤的发生密切相关 20 蛋白的氨基酸序列高度保守在人类中其与 2) 蛋白的相似度达到 8 人类与小鼠的 20 蛋白序列相似度甚至达到 8 这些都暗示着,' 基因在功能上的保守性和重要性研究人员已在模式生物中证实,' 基因通过介导信号传导来调控原肠胚的形成间叶细胞的聚集和软骨细胞的分化这些结果都表明,' 基因与信号的正常传导密切相关我们实验室的既往研究结果及一些文献报道均表明人类的发生与信号通路相关基因变异密切相关然而,' 基因与人类的发生是否相关目前尚无明确报道为了探究,' 基因与的相关性我们对来自山西和苏州的例患儿和例对照人群进行了,' 基因的外显子序列变异分析和单核苷酸多态性!''% " '+&#& 关联研究材料和方法研究材料病例组例胎儿样本采自我国发病率最高的山西省由北京首都儿科研究所收集和南方城市苏州市立医院母子健康研究中心依据表型进行分类表对照组例对照样本来自山西省和苏州市所有正常对照由山西长治医院苏州市立医院及北京首都儿科研究所进行常规体检后采集排除先天性心脏病智力低下精神分裂症高血压糖尿病和癌症等出生缺陷和重大疾病病例组和对照组的样本采集均获得复旦大学生命科学学院伦理委员会批准并签署知情同意书表 81+ 患儿的样本信息 1#8'1+ *&" #, #"+ '8! ''! )#'+ #'' -#'+ ## * 2 基因的,' 扩增及测序采用 $,%! 技术设计,' 基因编码区个外显子 3% 和 3% 序列引物表然后进行扩增测序反应使用 0!+ 试剂盒美国

3 复旦学报医学版年月 )0- 公司用 )0- 测序仪检测结果用 % & 软件分析变异位点的基因分型应用 #" 技术对检测到的变异位点和位点进行基因分型 % #" 试剂盒来自美国 )0- 公司 #" 是基于单碱基延伸原理的基因分型技术针对变异位点设计单碱基延伸引物每个引物之间相差使变异位点在 #" 分型图中依次排开用软件对结果进行分析如果检测位点为纯合则只出现个单峰如果是杂合则会出现双峰最后随机挑选 8 的 #" 结果进行测序验证图统计学分析采用检验比较病例组与对照表 2 基因编码区,' 扩增引物序列 1#,2,'!! & & $, 3%)777777))7)7)7)7%3 3%)777))))))%3 $, 3%7))77)7)%3 3%7777%3 $, 3%)77777))7)))))7%3 3%7)7)777))777%3 $, 3%7)7)7)7)77%3 3%)))%3 图 82 基因变异位点的, 基因分型图 *8!2#, )#!"+*"77))7777"'+*&'*""!#"0#!"+* )7#!"+*0"##"+!"#!"+ )7"'+ 7 )0' 70' 组之间各位点的等位基因及基因型频率分布差异并对所有检测到的位点进行哈迪 % 温伯格平衡检验.+%2!'&.2$ 结果 2 基因在 1+ 患儿中的测序结果对例患儿的,' 基因整个编码区及部分非编码区进行突变分析共发现个序列变异位点且均位于,' 基因的非编码区图表在编码区域未检测到任何突变位点或位点基因分型结果对病例组检测到的个遗传变异位点进行基因分型结果在例对照样本中均未检测到 %%7) 位点表明该位点是一个疾病特有的遗传变异位点图其他个变异位点在对照组中均检测到图 1+ 患儿 2 基因中个序列变异位点所处位置 *!21+

4 周翔宇等,' 基因与人类神经管畸形的相关性表 1+ 患儿 2 基因中检测到的序列变异位点 1#2!# 6" " 7"+ ) " " " -"%%%7) -"%%7) -"%% 3%%)7 -"%%7 -"%% -"%%7) -"%% )''*+ 77 7) )) 77 7) )) )) ) ) )) 3%)7777)7777)77 77)))7)777)%3 3%)7)777 )7%3 3%)7))))7) )))%3 3%7)777)) 3%)77)%3 3%7)7)) )))77%3 3%777)7)77)7)77) 7)7%3 3%)77777)7) 7)777777%3 3%))77)7)7 )777))77))7%3 ) ) ) ) 基因型的个体患的风险是携带基因型个体的倍 (8- 此外我们还发现在共显性遗传模型下携带基因型的个体患的风险是携带图病例组中发现的突变位点 4-2-8" 的测序图 *4-2-8" 7 )0' 70', 位点的关联分析我们选取个位点和频率 8 进行关联研究连锁不平衡分析的结果表明个位点之间不存在连锁不平衡现象 " " 且个位点在对照样本中的基因型分布都符合.2$ 表病例 % 对照的关联分析结果显示在显性遗传模式下病例组和对照组中位点等位基因的频率分布有显著差异其中等位基因与患病风险增加相关携带或基因型个体的倍 (8- 其他两个位点和在关联研究中无显著差异表单倍型分析的结果表明个位点的等位基因以 %)% 组合时个体患的风险虽然没有增加但值有统计学意义表 28 位点的生物信息学预测利用在线转录因子预测软件 #" 1% #$).#"&' 对和进行分析预测结果表明在位点当等位基因出现时转录因子 % 和 9 与该位点结合而当等位基因出现时会导致这种结合力的丧失表明该位点可能参与转录因子的调控图讨论, 基因家族众多成员中的,,' 和, 基因在模式生物中已被证实是参与信号传导的个成员其中 2) 和

5 复旦学报医学版年月表 9339:8 和 28 在病例组和对照组的频率分布 1#9+#339: '7"+ 8 "' ( 8- ' &" % 8 8 % &" 8 8 % 8 8 % % % (&" % % ) )) 8 )7 8 8 % &" % 8 8 % &" 8 8 % 8 8 % % % (&" % %.2.+%2!'"'! )'' 表 2339:8 和 28 的单倍型分析结果 1#2339:8 28 ( 8- ' ) ) % ) % ) % 7 % 20 在氨基酸序列上有极高的保守性我们研究中采集的例胎儿样本均携带严重的表型如无脑颅脊柱裂脑膨出等虽然人类与,' 基因之间的相关性并不能被在胎儿样本中未检测到,' 基因编码区突变这一结果所验证但这也进一步反映出 20 蛋白序列的高度保守性及其功能的重要性我们在,' 基因翻译起始位点上游处的第一内含子中检测到个 %%7) 的变异位点虽然我们无法采集到双亲样本以判定该位点是否为新发但对例正常对照样本的基因分型结果表明 %%7) 是一个潜在的疾病特异的罕见突变位点尽管分布频率低但罕见突变具有很强的选择性诸多实验室证据都表明罕见突变往往是造成的罪魁祸首

6 周翔宇等,' 基因与人类神经管畸形的相关性图 928 位点的转录因子结合预测结果 *9128 个位点和的病例 % 对照关联研究结果表明在显性遗传模式下的等位基因会显著升高个体患的风险虽然在基因编码区未找到支持,' 基因与相关的证据但在,' 基因的非编码区我们却发现位点的等位基因与显著相关近年来有研究报道,' 基因第三内含子的和第四内含子的个位点与糖尿病的发生显著相关此外,' 基因的过量表达会抑制经典 2 信号通路并导致脂肪水平的上升而在本研究中我们发现与发生显著相关的位点的等位基因同样位于,' 基因的第三内含子中通常认为位点可以通过 ) 转录因子外显子剪切等多个方面来影响基因功能为了探究位点等位基因是否有潜在的功能意义而不仅仅是一个遗传标记我们应用在线生物信息学数据库对位点进行了转录因子和 ) 的预测结果发现位点的等位基因会对转录因子 % 和 9 与该区域的结合产生影响但当等位基因出现时转录因子 % 和 9 无法与该区域正常结合 % % 0 是一种核转录因子存在于多种细胞中并参与细胞凋亡和有丝分裂的调控在神经系统疾病及肿瘤研究中有许多关于 % 的报道转录因子 9 本身是一种锌指蛋白与 ) 序列有很高的结合特异性病例组位点的基因型和的频率明显高于对照组根据生物信息学的预测结果我们推测等位基因可能会影响转录因子与该区域的结合从而改变基因的正常表达水平不过这种推测有待今后功能实验的验证通过本研究我们在遗传水平上找到了与发病相关的突变位点 %%7 ) 还发现位点的等位基因与发病显著相关且具有潜在的功能意义参考文献 )7 ##!"* &&&''",!*" "! "#!"*'"*"$ )77"' &"*' "*"(! 7" )7"*#&' " *" +& ) 0)7597"*'"*" %&#!, 黄晶陈东方年年山西省神经管缺陷流行病学分析中国妇幼保健 0'&.'&"#+'"'"' #&'* $ )! 5'2"!'!! ""!"'"21! &' '' '"+!'!*& *'+' &""#&*" 2'1'# '' '"+ "#% +""' &"" 2'!*0'' '"+!'!' ''+"!$$' +)' ' ' '"+!'!

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