刘艳霞等单核苷酸多态性位点 %!2 与溃疡性结肠炎及大肠癌的相关性端目前研究认为溃疡性结肠炎是遗传易感性个体在免疫环境精神肠道菌群等多种因素共同作用下发生的慢性肠道炎症病因尚不十分明确溃疡性结肠炎相关结直肠癌是溃疡性结肠炎患者的重要死亡原因之一其发生可能与溃疡性结肠炎的病变范围

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疾爵鄂
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1 北京大学学报医学版 :79;9#97#;$)27$&, 单核苷酸多态性位点 &5 与溃疡性结肠炎及大肠癌的相关性刘艳霞杨雪松付卫姚宏伟北京大学第三医院消化科普外科北京论著摘要目的探讨 %!2 多态性与散发性大肠癌发病风险的相关性初步比较 %!2 多态性在溃疡性结肠炎患者和普通人群中的分布差异方法该病例对照研究共纳入 2 例散发性大肠癌患者例溃疡性结肠炎患者和 2 例对照者采集外周静脉血并提取基因组 7 采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱平台进行基因型分型采用非条件 $!, 回归方法校正年龄性别并比较各组间的等位基因和基因型频率分布差异结果大肠癌组的 : 等位基因频率及 ::: 基因型频率均高于对照组差异具有统计学意义 E 溃疡性结肠炎组的 : 等位基因频率及 ::: 基因型频率均高于对照组差异具有统计学意义 DD 和 E 结论 %!2 多态性与散发性大肠癌的发病风险相关 %!2 多态性在溃疡性结肠炎患者和普通人群中的分布可能存在差异且溃疡性结肠炎患者中的 : 风险等位基因频率可能高于普通人群关键词多态性单核苷酸结肠炎溃疡性结直肠肿瘤中图分类号文献标志码文章编号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位点位于 01) 原癌基因的上游区域内该区域具有增强子活性且能与转录因子类似物 %"!,%'$" /,$%).&#0 发生特异性结合 %!2 多态性能够影响 #0 与该增强子区域的结合能力从而影响 #0 对 01) 原癌基因的转录调节作用目前研究认为 %!2 位点可能通过上调 01) 原癌基因的表达水平增强大肠癌的发病风险溃疡性结肠炎属于炎症性肠病的一种病变好发于直肠和乙状结肠也可累及全结肠甚至回肠末基金项目国家高技术研究发展计划 2 计划资助 ''$%& *&7$") &,"$)$*&!&%, " &<&)$'(&" 1%$%($/# "2 1%$%( #$%&!'$" "$%!&() *"?&!$"+(&," 网络出版时间网络出版地址 ' ---,". "&.,(!&)()

2 刘艳霞等单核苷酸多态性位点 %!2 与溃疡性结肠炎及大肠癌的相关性端目前研究认为溃疡性结肠炎是遗传易感性个体在免疫环境精神肠道菌群等多种因素共同作用下发生的慢性肠道炎症病因尚不十分明确溃疡性结肠炎相关结直肠癌是溃疡性结肠炎患者的重要死亡原因之一其发生可能与溃疡性结肠炎的病变范围患病时间炎症程度发病年龄和结直肠癌家族史等因素有关年 5&! 等的研究发现溃疡性结肠炎患者的大肠癌发病风险是普通人群的倍目前研究多认为包括溃疡性结肠炎在内的慢性炎症能够增加癌变风险但与之相关的分子机制并不清楚部分研究认为溃疡性结肠炎炎症向癌的转变过程可能与肠道上皮反复发生炎症损伤增生和修复有关 2 作为一种与细胞生长代谢过程相关的重要转录因子 01) 参与了肠道上皮的增生和损伤修复过程并可能在溃疡性结肠炎的炎症和癌变过程中发挥一定作用本研究通过分析和比较 %!2 多态性在散发性大肠癌患者和对照人群中的分布差异进一步探讨该位点多态性与大肠癌发病风险的相关性并通过比较 %!2 多态性在溃疡性结肠炎患者和对照人群中的分布差异初步探讨该位点多态性与溃疡性结肠炎及溃疡性结肠炎癌变之间可能存在的相关性 7 所有 7 样品的浓度需大于 ( 且光密度 "( 2 "( 比值介于 2 4 之间采用!*&!" 软件设计并合成引物正向引物为 F#::::##:##: :##:F 反向引物为 F#::::#### ######F 延伸引物为 F::## :#:::F 采用中国科学院北京基因组研究所的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱平台对 7 样品进行基因型分型通过系统自带软件 *'&% 对检测结果进行判读种基因型的聚类性能,)!&%"'&%/$%(",& 均不低于 2 基因型分型示意图如图所示统计方法采用卡方检验检测是否符合 %*&"&% 平衡定律 E 为不符合平衡定律采用非条件 $!, 回归分析方法校正年龄性别并计算 + 值和 3 置信区间所有的统计分析均由 9= 1!,! 软件实现以双侧概率 E 为标准判断差异是否具有统计学意义多重比较时需采用 $"/&%$" 校正法对检验水准进行校正即以初始检验水准除以多重比较的次数资料与方法研究对象该病例对照研究共纳入 2 例散发性大肠癌患者例溃疡性结肠炎患者和 2 例对照者大肠癌组溃疡性结肠炎组和对照组人群均为年至年期间就诊于北京大学第三医院的患者或体检者受检者之间均不存在血缘关系溃疡性结肠炎组需排除恶性肿瘤病史大肠癌组需排除自身免疫性疾病遗传性大肠癌和其他恶性肿瘤病史对照组需排除自身免疫性疾病和恶性肿瘤病史大肠癌以术后病理组织学结果为诊断依据溃疡性结肠炎的诊断标准参照年中华医学会消化病分会炎症性肠病诊断与治疗的共识意见中的诊断标准本研究通过了北京大学第三医院医学伦理委员会的审核并获得所有受检者的知情同意临床信息采集与基因型分型各自独立进行互不干扰临床信息采集采用问卷调查和病历回顾相结合的方式进行研究方法采集 ( 抗凝的外周静脉血采用血液基因组 7 提取试剂盒 97:7 提取基因组 & $!%&'%&!&""&<&,$"%$)"!(')&!$/"$,)-, <& &&" %&($<& /%$(/%&%")*!! 图单核苷酸多态性位点 %!2 的基因型分型结果结果!&&"$*' "%&!)!$/!")&",)&$& '$)*($%'!(%!2 临床特征和数据情况大肠癌组共纳入了 2 例散发性大肠癌患者平均年龄为 C2 岁 4 岁其中男性例 3 女性例 3 该组共

3 北京大学学报医学版 :79;9#97#;$)27$&, 包括 2 例直肠癌和例结肠癌患者其中有 2 例患者存在局部淋巴结转移和远处器官转移溃疡性结肠炎组共纳入例溃疡性结肠炎患者平均年龄为 C 岁 4 岁其中男性例 3 女性 2 例 3 通过肠镜检查结果明确溃疡性结肠炎的炎症累及范围其中非广泛性溃疡性结肠炎患者有例肠镜结果提示炎症局限于直肠和左半结肠广泛性溃疡性结肠炎患者有例肠镜结果提示肠道炎症从远端向近端发展并累及右半结肠此外有例无法通过肠镜结果进行明确分型因此不纳入溃疡性结肠炎亚组的分析中对照组共纳入 2 例体检者平均年龄 2 C 岁 4 岁其中男性例 3 女性例 3 卡方检验结果提示 %!2 的基因型频率分布在对照组中符合 %*&"&% 平衡定律在溃疡性结肠炎组和大肠癌组中不符合 %*&"&% 平衡定律 E 各组的基本临床信息可见表表大肠癌组和溃疡性结肠炎组的临床资料 +%#)",)$/##%$' " #%$' ##%$' D2 #",&%!& &,( ($,$)$" &!,&" ",$)$" %"!<&%!&,$)$"!,&" ",$)$" & #%$' D!&!&%$" *&%! *&%! *&%! =$%&" *&%!?&"$/,$)! 1%$,! &/!&?&"!<& "."$-" 9&(! ##,$)$%&,),",&% # ),&%<&,$)!,)",$'$)$,)!"$/,$)$%&,),",&%" 2 %!2 多态性在大肠癌组和对照组之间分布的比较 %!2 位点的种基因型在大肠癌组中的频率分别为 : 和 3 :: 在对照组中的频率分别为 23 3: 和 3:: 大肠癌组的 : 等位基因频率 23 高于对照组 3 通过 $!, 回归分析校正年龄性别并比较两组间的等位基因频率分布差异结果提示两组间的等位基因频率分布差异具有统计学意义 E+D 42 表进一步通过 $!, 回归分析比较两组之间的基因型频率分布差异检验水准为此时分析结果显示两组之间的基因型频率分布差异也具有统计学意义 E 表在分析过程中我们根据癌变部位是否发生局部淋巴结转移和远处器官转移将大肠癌组进一步划分为直肠癌组结肠癌组转移癌组和非转移癌组结果显示直肠癌组和结肠癌组的 : 等位基因频率均高于对照组分别为 3 和 3 非转移癌组和转移癌组的 : 等位基因频率也高于对照组分别为 23 和 23 比较直肠癌组与对照组之间的等位基因频率分布差异检验水准为结果提示 : 等位基因在两组间的频率分布差异具有统计学意义 D+D2 4 比较两组间的基因型频率分布差异检验水准为结果提示差异具有统计学意义 E 表采用同样方法比较结肠癌组非转移癌组转移癌组与对照组之间的等位基因和基因型频率分布差异结果提示差异均具有统计学意义 E 表 %!2 多态性在溃疡性结肠炎组和对照组之间分布的比较溃疡性结肠炎组的各基因型频率分别为 3 3: 和 23::: 等位基因频率 23 高于对照组 3 $!, 回归分析结果提示两组间的等位基因频率分布差异具有统计学意义 D+D 4 进一步比较基因型频率分布差异 :: 纯合基因型在两组间的频率分布差异具有统计学意义 D : 杂合基因型频率分布差异同样具有统计学意义 E 进一步比较非广泛性溃疡性结肠炎组广泛性溃疡性结肠炎组和对照组之间的等位基因和基因型频率分布差异检验水准分别为和非广泛性溃疡性结肠炎组广泛性溃疡性结肠炎组与对照组之间的 : 等位基因频率分布差

4 刘艳霞等单核苷酸多态性位点 %!2 与溃疡性结肠炎及大肠癌的相关性异无统计学意义 DD 非广泛性溃疡性结肠炎组与对照组之间的基因型频率分布差异也无统计学意义 D::D: 广泛性溃疡性结肠炎组与对照组之间 :: 纯合基因型频率分布差异不具有统计学意义 D 而 : 杂合基因型频率分布差异具有统计学意义 D 溃疡性结肠炎各组与对照组之间的比较结果见表和表表 %!2 多态性与大肠癌的相关性 +%&!$,$" $/%!2 '$)*($%'!(-,$)$%&,),",&% %!2 ## 3 #$"%$) 3 +3)* )&)& : E :&"$*'& 2 2 : 2 E :: 2 E ##,$)$%&,),",&% $!,%&%&!$" ($&)!& *&" &"&% 表 %!2 多态性与直肠癌结肠癌的相关性 +%&!$,$" $/%!2 '$)*($%'!(- %&,),",&%",$)$",",&% %!2 &,),",&% #$)$",",&% 3 +3)* 3 +3)* )&)& 2 : 2 E :&"$*'& : 2 E 22 2 E :: 2 E 2 2 E $!,%&%&!$" ($&)!& *&" &"&% 表 %!2 多态性与转移癌非转移癌的相关性 +%&!$,$" $/%!2 '$)*($%'!(-,",&%(&!!! %!2 (&!!! $(&!!! 3 +3)* 3 +3)* )&)& 2 : 2 E E :&"$*'& 2 : 2 2 E E :: E 22 E $!,%&%&!$" ($&)!& *&" &"&% 表 %!2 多态性与溃疡性结肠炎的相关性 +%&!$,$" $/%!2 '$)*($%'!(- ),&%<&,$)! %!2 # 3 #$"%$) 3 +3)* )&)& : 2 2 :&"$*'& 2 : E :: 2 # ),&%<&,$)! $!,%&%&!$" ($&)!& *&" &"&%

5 2 北京大学学报医学版 :79;9#97#;$)27$&, 表 %!2 多态性与溃疡性结肠炎炎症范围的相关性 +%&!$,$" $/%!2 '$)*($%'!(- &?&"$/,$)! %!2?&"!<& 7$"&?&"!<& 3 +3)* 3 +3)* )&)& : :&"$*'& : 2 :: $!,%&%&!$" ($&)!& *&" &"&% 讨论单核苷酸多态性位点 %!2 位于染色体 2@ 区域年 &&% 等的全基因组关联分析研究最初发现 %!2 多态性可能与欧洲血统男性的前列腺癌发病风险相关在这之后又有个独立的全基因组关联分析研究同时发现 %!2 位点除了与前列腺癌发病风险相关外也与西方人群大肠癌的发病风险相关 %!2 多态性与大肠癌的相关性存在种族差异研究发现 %!2 多态性与德国人群美国白种人和中国人群的大肠癌发病风险均相关然而并未找到与美国黑人大肠癌发病风险相关的证据目前研究提示该位点除了与大肠癌和前列腺癌的发病风险相关外与其他多种癌症的发病风险也具有相关性 2 2 年 $.$)$%,>*. 等的研究发现 %!2 多态性与肾癌甲状腺癌喉癌的发病风险相关年 A$ 等的研究也提示 %!2 与胃癌发病风险具有一定的相关性本研究对 %!2 多态性在大肠癌组和对照组之间的分布情况进行比较结果显示大肠癌组的 : 风险等位基因频率高于对照组与已有的研究报道一致进一步统计分析发现大肠癌组和对照组之间的等位基因和基因型频率分布差异均具有统计学意义 E 且 %!2 位点在直肠癌结肠癌转移癌非转移癌亚组与对照组之间的等位基因和基因型频率分布差异也具有统计学意义虽然本研究的样本量相对较小但考虑到本研究结果与之前已有的研究报道结果相符也可以提示 %!2 多态性可能与大肠癌的发病风险相关随着越来越多的研究发现 %!2 位点与癌症发病风险相关 %!2 位点的具体作用机制也得到进一步研究年的两项独立研究同时发现 %!2 位点可能参与了 ",&" " 信号通路靶基因 01) 的转录调节 %!2 位点位于距 01) 原癌基因约. 的上游区域内该区域除了具有增强子的特性外也是与 #0 转录因子发生特异性结合的区域 %!2 位点的 : 风险等位基因与 #0 转录因子结合能力的上调相关 #0 是 ",&" " 通路中非常关键的转录调节因子可以与,&" " 结合并促进 01) 靶基因的转录激活 7" 等的细胞水平研究发现 %!2 多态性能够影响 01) 原癌基因的表达水平而 % 等的动物实验研究也发现敲除包含 %!2 在内的上游区域可以使小鼠肠道的 01) 基因转录水平降低并增强小鼠对癌变诱导剂的抵抗能力提示 %!2 位点可能通过上调 01) 原癌基因的表达水平来增强大肠癌的发病风险 01) 是一种能够影响一系列靶基因表达的转录因子正常状态下它通过调节肠道上皮细胞的增生迁移分化和凋亡等功能来维持肠道的平衡状态早期研究发现 01) 在溃疡性结肠炎的炎症组织中存在表达上调年 8$"!<& 等的基因敲除动物实验发现 01) 的高表达能够促进溃疡性结肠炎模型小鼠的肠道上皮再生和修复与此同时研究还观察到 01) 高表达的小鼠肠道组织存在较明显的异型增生改变年 8$"!<& 等进一步对溃疡性结肠炎癌变小鼠模型进行了研究发现 01) 高表达状态的小鼠更容易发生溃疡性结肠炎相关结直肠癌提示 01) 基因的高表达状态可能在肠道炎症和癌变中具有双重作用调节 01) 基因的表达水平对维持肠道的正常状态具有相对重要的作用 %!2 作为连接 ",&" " 信号通路中 #0 转录因子和 01) 靶基因的重要节点其突变状态可能会在一定程度上影响 #0 转录因子对 01) 基因表达水平的调控进而影响 01) 基因的表达水平和功能作用本研究通过比较 %!2 位点在溃疡性结肠炎和对照组中的分布状态发现溃疡性结肠炎组的

6 刘艳霞等单核苷酸多态性位点 %!2 与溃疡性结肠炎及大肠癌的相关性 : 等位基因频率 23 高于对照组 3 进一步分析发现两组之间的等位基因和基因型频率分布差异均具有统计学意义 DD 和 E 此外研究还发现广泛性溃疡性结肠炎组的 : 杂合基因型频率高于对照组 D 以上分析结果初步提示 %!2 位点在溃疡性结肠炎患者和普通人群中的分布可能存在差异溃疡性结肠炎患者的大肠癌发病风险要高于普通人群但与之相关的分子机制并不清楚部分研究认为溃疡性结肠炎炎症向癌的转变过程可能与肠道上皮反复发生炎症损伤增生和修复有关 2 01) 作为一种与细胞生长代谢过程相关的重要转录因子在肠道损伤上皮的增生和修复过程中发挥了较重要的调控作用基于目前已有的研究现状和本研究的分析结果我们初步假设 %!2 位点在溃疡性结肠炎患者和普通人群中的分布可能存在差异且 %!2 位点可能通过上调 01) 基因的表达水平在一定程度上增加溃疡性结肠炎患者的癌变风险由于本研究存在样本量不足的问题并没有对溃疡性结肠炎癌变人群进行多态性分析所以并不足以证明 %!2 位点与溃疡性结肠炎及溃疡性结肠炎癌变具有相关性在后续研究中我们希望通过扩大样本量和收集溃疡性结肠炎癌变病例对该假设进行进一步探讨参考文献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收稿本文编辑赵波

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽