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1 中国畜牧兽医 3! " # 香猪 * 基因外显子 的多态性及其与产仔数间的关联分析 许 瑶 刘 畅 牛 熙 冉雪琴 王嘉福 贵州大学生命科学学院 贵阳 贵州大学农业生物工程研究院 贵阳 贵州大学动物科学学院 贵阳 铜仁学院 铜仁 摘 要 促卵泡激素,,%80.,'0/7%3 是垂体前叶分泌的一种糖蛋白 可通过卵泡刺激素受体,,%80.,'0/7%7%%)073 调节卵巢的功能 为了研究香猪 '/ 基因外显子 的多态性及其与产仔数的关系 试验以从江香猪为研究对象 采用 产物直接测序方法检测基因的多态性 分析基因型与香猪产仔数间的关系 对 个候选位点进行群体检测证实其中 个为 "8 位点 分别是 78 和 78 且新发现 个 " 位点 %,$*#78 和 78 位点构成 种单倍型 其中 为香猪群体的主要单倍型 > 且在香猪群体中紧密连锁 7 D 分析 种单倍型与香猪产仔数间的关系 在香猪的二胎产仔数中 单倍型 的总产仔数 00',.(%7(7"& 最高 单倍型 的 "& 最低 两者之间的 "& 相差 ** 头 在香猪的三胎产仔数中 单倍型 的 "& 最高 与单倍型 间的 "& 分别相差 和 头 78 位点的基因型与香猪的三胎产仔数呈弱的正相关关系 D* 本研究结果提示 单倍型 可以作为分子标记应用于香猪产仔数性状的辅助选育 关键词 '/ 基因 多态性 香猪 分子标记中图分类号 文献标识码 # 文章编号 ** *('-"(* +$$%&)"$)"-'.)-)-$)$,$ " ' /' " & ##(! &2!!!- (! & ## (! &$(!$ /")),,%80.,'0/7%3',-)70%8%7%0%7)0.0'7-'7%.,'0%'7'.00/7./0/%37%%)073%',.'0%0/%%%08'/ %% 0/%,0%78%'))).,'00/%),-7)/88'/%%%:9%7%%0% 0%(-),-%7'8%/'7%'0 '8%;.% %0/8'0/%%%0),-7 )/88'/ %%%:,0%78%07'08 ')89'8'',-%.80/%,%'80 8;.'7%'',-88%/0''0%80%80/%7%9%7%09),-7)/,9%7%%0%0%.07 '))).,'09//9%7%78'787%%7' %9 " %, $*# 9'8 8%7%.7 /'),0-)%8 9%7% 807.0% (%09%% 78'7880%89// 9'80/%'/'),0-)% >')7%8% 修回日期 基金项目 国家高技术研究发展计划 计划 课题 ## 贵州省农业攻关项目 黔科合 " 号 贵州省 百 层次创新型人才项目 黔科合人才 号 国家自然科学基金 * 作者简介 许 瑶 ** 女 贵州贵阳人 硕士生 研究方向 动物生物化学与分子生物学 +',*;; 通信作者 冉雪琴 * 女 教授 研究方向 动物生物化学与分子生物学 +',:;7'.%. 王嘉福 * 男 教授 研究方向 生物化学与分子生物学 +',9'.%.

2 中 国 畜 牧 兽 医 卷 0%,8%,-,'%8%;.,(7. 7 D'))).,'0.70/%77%0/%/'), 0-)%77%8)%00/%//%8000',.(%7(7"&'00/%8%%0.8')8 /'),0-)%00/%,9%80"&09'80%0/'0/'),0-)% )7.%** "& ')87%0/'/'),0-)% #0/%"&'00/%0/7%0.89'8',80/% //%80/'),0-)%9//)7.%'"&7%0/'/'),0-)%8' /%%0-)%8,.8789'89%',-77%,'0%90/0/%0/7%0.8 '))).,'0 & D*/%7%8.,088.%80%0/'0/'),0-)%.,(%.8%'8',%.,'7'7%70'88808%,%070/%,0%78%')8 0$*."'/%%),-7)/8')8,%.,'7'7%7 促卵泡激素,,%80.,'0 /7% 3 是由腺垂体前叶分泌的一种糖蛋白 通过靶细胞膜上的促卵泡激素受体,,%80.,'0 /7%7%%)073 介导卵巢的生物学功 能 包括性周期调控和卵泡的成熟等 哺乳动物 '/ 基因的!"# 开放阅读框包含 个外显子和 * 个内含子 外显子 编码部分跨膜区和胞内结 构域 检索 "& 的 " 数据库 人 '/ 基因中共发现 ** 个多态位点 其中大部分位于内含子区 有 个位点导致氨基酸变异 已知 '/ 基因外显子 的 %7#8 位点的多态性与女性的多囊卵巢综合征 < 显著相关 使得 女性的雄性激素分泌过多而出现不孕 %7#8 位点的 $ 等位基因会增加卵巢低反应 的风险 关于动物群体 '/ 基因多态性的研究多集中在 = 非翻译区和外显子 对牦牛 '/ 基因 = 端部分序列进行克隆分析 结果显示序列突 变以碱基替换为主 德国牧羊犬 '/ 基因第 外显子 * 位点的 基因型个体的产仔数显著少于 基因型 表明 " * 位点与其产仔数 存在相关性 从江香猪产于贵州省从江县月亮山区 是在特定的生态环境和粗放的饲养管理条件下 * 历经数百年的自然和人工选择形成的地方品种 但从江香猪的生产周期长且群体规模小 其养殖业 发展缓慢 本试验将 '/ 基因作为影响猪繁殖性能的候选基因 探究 '/ 基因外显子 在香猪群体中的多态性变化及其与产仔数间的关联 为揭示香猪繁殖力调控机理提供理论依据 材料与方法 试验动物 从贵州省从江县宰便乡 加鸠乡等地选取 岁龄雌性从江香猪 头 从贵州省毕节顺丰养殖 场选取大白猪 头 自猪前腔静脉采血 头 +!#5 抗凝 同时记录每头母猪的产仔数等信息 主要试剂及仪器 基因组!"# 提取试剂盒 $+ '80%7 : 均购自天根生化科技 北京 有限公司 - -,%7 仪 $%,! 凝胶成像系统均购自 &' 公司 基因组提取 参照血液基因组!"# 提取试剂盒说明书提取样本的基因组 经 > 琼脂糖凝胶电泳检测基因组完整性 保存备用 引物设计及 扩增 基于香猪基因组重测序结果 在 '/ 基因外显子 上找到 个 " 位点 78 以此位点为中心 从 "& 的 " 数据库中检索到 个候选位点 表 除 78* 位于 '/ 基因内含子 * 外 其余位点均分布于基因的编码区 在这 个候选位点外围 参照 $%&' 中已知的猪 '/ 基因!"# 序列 登录号 " 运用 7%77%%7 软件设计了 条针对 '/ 基因外显子 的引物 引物序列为 =#$$ $#$$$$$#$$##$#=! =#$#$ $##$$$##$#$#$= 预期扩增片段为 () 引物由英潍捷基 上海 贸易有限公司合成 反应体系!"# 模板 $+ '80%7: 上 下游引物各 3 < 反应条件 * 预变性 * 变性 8 退火 8 延伸 共 个循环 延伸 保存 取 产物经 > 琼脂糖凝胶电泳检测 +& 染色 凝胶成像系统拍照保存 目的片段由英潍捷基 上海 贸易有限公司测序

3 期 许 瑶等 香猪 '/ 基因外显子 的多态性及其与产仔数间的关联分析 表 * 基因外显子 周围的候选," 位点!/$!-$)$,"#$&* $$ 氨基酸位置 染色体位置 等位基因 变异形式 相对位置 "! #'8 /78%)80 #,%,%8 A'7'00-)% )80 %,'0%)80() 78* ** $ 07'7'0 78* *** 88%8%'7'0 78* ** $ 88%8%'7'0 * 78 ** 88%8%'7'0 78*** *** # 88%8%'7'0 78 *** --.8'7'0 78* * #$ 88%8%'7'0 78** *** --.8'7'0 将 '/ 基因外显子 的第 个碱基 的位置定义为 其上游的位点定义为 '00/%780('8%'/%%%:8%8'0%'8)808.)807%''7%%0%(- 统计分析将测序得到的!"# 序列用!"#0'7 软件进行序列拼接 比对 筛选 "8 位点 应用 +:%, 软件分别计算不同位点在受试群体中的基因型频率 等位基因频率 有效等位基因数, 群体遗传纯合度 和多态信息含量 2 采用 3+88 和 3'),%9A%78 软件计算 "8 的连锁不平衡参数 分析多态位点是否偏离哈迪 温伯格平衡 3'7-@%(%7%;.,(7.3@+ 状态 并构建单倍型 采用 软件对基因多态性与香猪产仔数进行关联分析! 法进行多重比较 不 同基因型对应的总产仔数 00',.(%7(7 "& 用最小二乘均值 标准误表示 差异分析应用卡方检验 /8;.'7%0%80 结 果 扩增 扩增产物经 > 琼脂糖凝胶电泳检测 结果显示为一条特异性条带 长约 () 图 与预期片段大小相近 条带清晰 整齐无拖尾 可用于测序!!"# '7%7 引物! 扩增产物!!"# '7%7/%'),'0)7%78! 图 产物琼脂糖凝胶电泳检测结果!-$$"#)"$)$)/* $$$)'-$"" * 基因外显子 区段序列分析运用!"#0'7 软件中的 %;' 程序对所有样品的序列进行分析 扩增片段长 () 包含内含子 * 的下游和外显子 的大部分区段 检测到 个候选 "8 位点 与表 相符 且在外显子 的上游 *() 处发现 个新的位点 命名为 %, 经香猪群体大样本 D 检测 个候选 "8 位点中仅有 个位点 78 和

4 ?&0 中!国!畜!牧!兽!医 )) 卷! U V **0%%200&#具有 多 态 性'U V *00?&&&?* 位 于 第 %& 外显子 0/(@A 处!该位点发 生 =%T 突 变!分 别 定 义 生 %5 突变!分别定义为 ( 55( 5 基因型'通 过序列比 对 发 现! =0/(=(T(&%T(! B0 的 基 因 型 为 ==(TT( =T 基 因 型!为 错 义 突 变!导 致 苏 氨 酸 序列 与 上 猪 的 参 考 序 列 " >V, %&' 0#相 一 致!将其定义为野生 型! T0/(T( =(&%=( 5! B05 的 基 " TGU#变 为 异 亮 氨 酸 " K D 7#& U V **0%%200& 位 于 第 %& 外显子 (&%@A 处!该位点发 生 T%= 变 异!分 别 定 义 为 TT( ==( T= 基因型!该 突 变 为 同 义 突 变!未 改 变 因型定义 为 突 变 型! =0/(T(T(&%=(! B05 基 因 型 定义为杂合型"图 0&)#' 编码的氨基酸'-#Z7 D% 位于内含子 B 中!该位 点发 图!!: &!!Q"""Q& 位点 --! 33 和 -3 基因型的序列比较 L I!!D 5 0 ) ) = : / 0/ <2 0/ A --& 33=0>-3/ <D+;: &!!Q"""Q& 2 O 9 B9 图 &!: &&!##K!!" 位点 33! -- 和 3- 基因型的序列比较 L &!D O5 0) ) /@9= : /0/ <2 0/ A 33& --=0>3-/ <D+;: &&!##K!!" 2I B9 图 %!0/ Y.# 位点 CC!,, 和 C, 基因型的序列比较 L %!D O5 0) ) /@9= : /0/ <2 0/ A CC&,,=0>C,/ <D+;0/ Y.# 2I B9

5 期 许 瑶等 香猪 '/ 基因外显子 的多态性及其与产仔数间的关联分析," 位点的基因型频率及遗传特异性分析从群体遗传学角度分析香猪 '/ 基因 7878 和 %, 位点的基因型频率和等位基因频率 并对香猪和大白猪群体间的基因频率进行 ' 检验 结果见表 由表 可知 对于 78 位点 香猪中 基因型为优势基因型 等位基因频率分别为 > 和 > 为优势等位基因 大白猪的 基因型为优势基因型 为优势等位基因 对于 78 位点 香猪中 基因型为优势基因型 为优势等位基因 大白猪中仅检测到 基因型 说明该位点在大白猪中没有多态性 2D 对于 %, 位点 两个群体中 ## 基因型均为优势基因型 # 为优势等位基因 对 7878 和 %, 位点 的多态性参数进行分析 结果见表 由表 可知 个 "8 位点在试验群体中纯合度均较高 表明这 个 "8 位点在群体中的变异较小 78 位点在香猪和大白猪中的有效等位基因数分别为 * 和 与实际检测到的 个基因数基本相符 其多态信息含量分别为 和 均表现为中度多态 2 表明该位点在 个群体中的分布均匀 能较 合理地提供遗传信息 78 位点仅在香猪群体中分布均匀 表现为中度多态 2 D 经 ' 适合性检验 除 %, 位点外 其余 个 "8 位点在香猪和大白猪群体中均处于哈迪 温伯格平衡状态 可用于下一步的连锁不平衡分析 表 * 基因 个," 位点的基因型频率 基因频率及 检验!/$!-$ $)*'$$#$*$$$#$* )$")* $$)-$$," > 基因型频率 $%0-)%7%;.%- 等位基因频率 $%%7%;.%- "! 香猪大白猪香猪大白猪 ')8 '7%@/0%)8 ')8 '7%@/0%)8 78 * 78 + *+ %, $$ $ $# # ## 表 * 基因 个," 位点的多态性参数分析!/$!-$ $$)"'$)** $$)-$$," "! 项目 0%8 香猪 ')8 大白猪 '7%@/0%)8 78 纯合度 有效等位基因数, * 多态信息含量 2 哈迪 温伯格平衡 3@+ 78 纯合度 * 有效等位基因数, * 多态信息含量 2 哈迪 温伯格平衡 3@+ %, 纯合度 * 有效等位基因数, 多态信息含量 2 * 哈迪 温伯格平衡 3@+ *+

6 中 国 畜 牧 兽 医 卷 连锁不平衡分析与单倍型构建采用 3+88 在线软件对 '/ 基因 78 和 78 位点进行连锁不平衡参数估计及单倍型构建 结果显示 个 "8 位点间仅在香猪群体中处于连锁不平衡状态 7 D 表 个位点间可构建 种单倍型 和 表 香猪和大白猪中均以 单倍型为主 频率分别为 > 和 > 且 单倍型频率在 个群体间的差异极显著 表 * 基因 个," 位点间的连锁不平衡参数估计!/$$"$#/#('($)$"$")()* $$).," 参数 7'%0%78 香猪 ')87878 大白猪 '7%@/0%) ! * 表 * 基因 个," 位点间的单倍型构建!/$9')*'$$")/"-($)* $$).," 单倍型 3'),0-)%8 香猪单倍型频率 大白猪单倍型频率 ')8/'),0-)%8 '7%@/0%)8/'),0-)%8 7%;.%-> 7%;.%-> ' 8/%78 %'788 <87'0 * > * * * * * ** + + 基因多态性与香猪产仔数的相关分析采用 软件对 78 和 78 位点的多态性与香猪的产仔数进行关联分析 结果见表 由表 可知 78 位点的基因型与香猪的头胎 二胎及三胎产仔数均不相关 78 位点的基因型与香猪的三胎产仔数呈弱的正相关 D * 对不同单倍型与香猪的产仔数间进行关联分析 结果见表 由表 可知 在香猪的二胎产仔数中 单倍型 的总产仔数 "& 最高 而单倍型 的 "& 最低 两者之间的 "& 相差 ** 头 差异显著 种单倍型个体的 "& 总趋势为 在香猪的三胎产仔数中 单倍型 的总产仔数最高 与单倍型 间的 "& 分别相差 和 头 差异极显著 单倍型 与 的 "& 相差 头 差异显著 种单倍型个体的 "& 总趋势为 在香猪的头胎和所有胎次中 种单倍型的 "& 差异不显著 表 * 基因 个," 位点与香猪产仔性状之间的相关性分析!/$!-$$)*""* $$).,")$))$&$" '" "8 头胎产仔数 780,0%78% 二胎产仔数 %,0%78% 三胎产仔数 '0%7,0%78% 78 * * 78 *

7 期 许 瑶等 香猪 '/ 基因外显子 的多态性及其与产仔数间的关联分析 表 * 基因单倍型与香猪总产仔数 "& 间的关联分析!/$,))")*""* $$-')*'$".)-))#(/$/ '" 单倍型头胎二胎三胎 所有胎次 头 3'),0-)%8 780,0%7 %,0%7 '0%7,0%7 #,)'70%8 ' * * ' #' * ' ' * '( * &( ' ' * '( #&' ' * ' ( &( ' 同列数据肩标不同小写字母表示差异显著 肩标不同大写字母表示差异极显著 肩标相同字母表示差异 不显著 %7%% 讨 论目前 对 '/ 基因外显子 多态性分析的研究报道主要集中在人上 人 '/ 基因外显子 中的多态位点主要有 $7#7$ # #,'*/7# 7*/7#7-8 #,'A',#**$ /7#,'#*$ #8%7 等 而 '/ 基因外显子 在其他动物上的多态性研究多见于牛和羊 从海门山羊中检测到 个 " 位点 * 发现 35 和 33 两 种基因型 检测到 个牛 " 位点 波尔山羊和莱芜黑山羊中发现 个 * 碱基突变 且改变了相应的氨基酸 本研究首次在从江香猪 '/ 基因中发现了 个 "8 位点 即 7878 和 %,$*# 其中 %, 位于内含子 * 中 是新发现的 " 位点 78 和 78 分别位于外显子 的 和 () 处 78 位点突变使苏氨酸 /7 变为异亮氨酸,% 在香猪中以 等位基因为主 而大白猪中 为优势等位基因 从香猪中检测到 78 位点的 种基因型 在大白猪中没有多态性 说明 78 是香猪群体的 " 位点 该多态性差异可能与地方猪品种和外来猪品种在遗传背景上的差异有关 与此相似 小梅山猪中检测到 * 位点 但在大白猪中未检 测到 *() 处的碱基变化 皖南黑猪和巴皖二元猪中检测到 * 位点 但在巴克夏猪中并未 检出 动物的产仔数性状与 '/ 基因的多态性变 化存在一定的联系 小梅山母猪 '/ 基因外显子 中检测到 位点 ## 基因型个体的总产仔数 "& 和产活仔数 "&# 比 && 基因型分别高出 * 和 头 * 位点在两胎以上及所有胎次的母猪中!! 基因型个体的 "& 和 "&# 均极显著高于 基因型 这 个位点的 # 和! 等位基因对小梅山猪产仔数有显著影响 秦川牛双胎和单胎的 '/ 基因外显子 的 位点的突变率分别为 >> 荷斯坦牛分别为 > 和 > 提示 位点可能 作为双胎性状的候选基因 单个 " 基因座一般只有二态 采用多个 "8 位点进行单倍型分析 可提高分子标记与 B 的连锁程度 比单个 " 位点的研究更有价值 在本研究中 78 和 78 位点在香猪群体中紧密连锁 7 D 在香猪的二胎产仔数中 单倍型 的 "& 最高 而单倍型 的 "& 最低 两者之间相差 ** 头 差异显著 在香猪的三胎产仔数中 单倍型 的总 "& 最高 与单倍型 间的 "& 分别相差 和 头 差异极显著 香猪中单倍型 的频率最高 > 这些研究结果提示单倍型 可能具有提高香猪产仔数的作用 结 论本研究从香猪 '/ 基因中检测到 个 "8 位点 其中 %, 为新发现的 " 位点 78 和 78 位点构成的单倍型 在香猪群体中紧密连锁 可作为提高香猪产仔数的分子标记

8 中 国 畜 牧 兽 医 卷 参考文献 'B #07.0.7%/.',,%80.,'0/7%),%:90/087%%)07?,! * $7,? "%8/,' +/%,,% 80.,'0/7%7%%)07&/%807-,%.,'7(,-)/-8,-' )'0/)/-8,-? 3# /(5***?'.3/%%0',07.0.7%,,% 80.,'0 /7% ),%: 90/ 0/% %07% %0'087%%)07?#!,! # ##* **!'%,%'808$!% A%0',7%08% %70-8-)08'07%'7'/-)%780.,'0 8-7% (-,,%80.,'0 /7% 7%%)07 %7#8),-7)/8?#3- # "!* $.& 3'7?&'%5 3$%%0'7'08,,%80.,'0 /7%7%%)07'7%'88'0% 90/ ),--80 '7-8-7%?2!! "# " # 张爱萍 张学红 贾学玲 等 卵泡刺激素受体基因多态性与西北地区汉族妇女卵巢反应性的关系? 中国优生与遗传杂志 李 雯 罗 虹 柴志欣 等 牦牛 '/ 基因 = 端部分序列克隆及生物信息学分析? 家畜生态学报 刘成武 杨 敏 德国牧羊犬 '/ 基因第 外显子 "* 与产仔数关系研究? 黑龙江畜牧兽医 * 郭宗义 从江香猪产业可持续发展对策探讨? 猪业科学 杨廷模 刘 畅 赵恒鑫 等 高产从江香猪资源调查及其 3 基因型分析? 畜牧与兽医 谢 健 喻昌燕 许 瑶 等 可乐猪乳头数性状全基因组关联分析? 中国畜牧兽医 2/'!2/. 3 2/.?%0',%,'08/) (%09%%),-7)/88%: '/ %% ',0%78%89%?!# "#/- #!%'78?'(7%'77-?%0',$%%9%'8 8'080.%8%0-09%,&.0'08 7%8)8(,%7''0-)',/-)%7)7,'-)/%0-)% 8/%%)?!#** 李 俊 张 勇 杨 红 等 从江香猪 0" 基因多态性研究及单倍型构建? 中国畜牧杂志 #/7%'75! "%/%75%0',,,%80.,'0 /7% 7%%)07 %% '7'08 9%90/)7'7-'8%'7-'%77/%'?! / *#!!# $77'.'(,'%08<%0',0.- *&',0%3#8%7),-7)/8 '%0800',0%80%8,.%? * 谭广梅 李拥军 张 丽 海门山羊 '/ 基因外显子 的 分析? 中国草食动物科学 '/',,-7)/880/%(%,,%80.,'0/7%7%%)07%%?!# * 于 艳 李建平 侯 磊 等 山羊 '/ 基因第 外显子序列的克隆与比较研究? 家畜生态学报 吴井生 王金玉 '/ 基因第 外显子多态性及其与小梅山猪产仔数的相关性? 中国农业科学 王玉金 刘 杏 贵州黑山羊 '/ 基因与繁殖性状相关性研究? 中国畜禽种业 * 雷雪芹 陈 宏 袁志发 等 牛 '/ 基因第 外显子单核苷酸多态性及其与双胎性状的关系? 中国生物化学与分子生物学报 余新沛 吕成伟 葛争鸣 等 中国白族人群 "0 基因 " 及其单倍型与基因型的研究? 中国免疫学杂志 "%%08%$7%- 3%0',)'7' 0%//7%8,.0'',-88,'%8%;.,(7. ' 0' 8,%.,%0% ),-7)/88 (%09%% )).,'080/%0'!7%%)07%%?- "#!# * 责任编辑 晋大鹏

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0 中 国 畜 牧 兽 医 卷!#&#!1%$ ##'#8'$#'#%!$8&'3%'$8!!##&#!91#$)%% 2%9% '## +&)')%%2%9%%##!%&'3- 抑制素 5 是转化生长因子 超家 族成员之一 由雌性动物的卵巢颗粒细胞分泌 主要通过负反馈抑制垂体促卵泡激素 8!!# 中国畜牧兽医! " # / 从江香猪抑制素 基因克隆及其卵巢表达研究 张 笑 苏 艳 杨世彬 王嘉福 冉雪琴 贵州大学农业生物工程研究院 贵阳 贵州大学生命科学学院 贵阳 贵州大学动物科学学院 贵阳 摘 要 为了探索抑制素 基因 5, 与从江香猪繁殖性状之间的相关性 试验采用特异性聚合酶链式反应 -) 技术克隆从江香猪 ) 基因 测定其核苷酸序列 通过等位基因特异性 -)!#!#9#8-),-) 方法检测从江香猪低产群与高产群之间

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