第卷第期年月西安交通大学学报医学版!" #$# # %&'& $ & 基础研究通过靶向促进骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化岳宗进刘汝银于露冯仲锴王新立河南中医药大学第二附属医院河南郑州 % 摘要目的探讨 &' % 在骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化中的作用及其机

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州野易
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1 第卷第期年月西安交通大学学报医学版!"#$## %&'& $& 基础研究通过靶向促进骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化岳宗进刘汝银于露冯仲锴王新立河南中医药大学第二附属医院河南郑州 % 摘要目的探讨 &'% 在骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化中的作用及其机制方法从大鼠中分离培养传至第代用于本实验以 ()* 转化生长因子 + 诱导向髓核样细胞分化为模型检测 ()* 诱导后蛋白多糖,,- 型胶原蛋白./ 和.0 的蛋白及 &-, 表达水平 (+1 检测 &'% 的表达水平随后通过上调或下调 &'% 水平检测,,-./ 和.0 的蛋白及 &-, 表达水平双荧光素酶报告系统验证 &'% 的靶基因并上调或下调 &'% 水平后检测靶基因的蛋白表达水平过表达靶基因并检测其与 &'% &'&'! 共转染对,,-./ 和.0 表达的影响最后上调或下调靶基因后检测 &'% 表达水平的变化结果 ()* 诱导向髓核样细胞分化后,,-./.0 和 &'% 高表达上调 &'% 后,,-./ 和.0 的表达升高下调 &'% 后,,-./ 和.0 的表达降低双荧光素酶报告系统证实是 &'% 的靶基因 &'% 通过抑制的表达上调,,-./ 和.0 的表达水平上调后 &'% 表达下调下调后 &'% 表达上调结论 &'% 通过靶向促进骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化对 &'% 亦具有负向调控作用关键词骨髓间充质干细胞髓核样细胞 &'% 中图分类号 %% 文献标志码,!"! #!!$%"&$&!!'$&''&'&$&#%"! "+'"/2 #+'" /#*-)"+34'5,-) 0'"+6' $47&$"8'"$$$!",8'6'4$9:'4689$"4""';$7:'8 (74''"46'"$:$$'!'"$$"#%'"4 ()(#%"(# # )!$*#+,#""#&)!$*-" $. #&)!$*-"" &")!$*+, #-"#"( /0&"'1#1*1' #* "$ -"#"/0+"#")!$*&% -""( + *&) +"-+%/0+"#")!$*- "#"" '11*1'* "$&% - "( "+# &%-+""-+")!$*" -"#"&-"" 1*1'* "$-"#")!$*#"( " % #&1 %-"#"( #& 1*1'*$"%-#""")!$*+,# "#"( /0&1%+1*1'* "$ -"& 1%"-+1*1'* "$-"#"&.+# 收稿日期 ++ 修回日期 ++ 基金项目河南省科技攻关计划项目 '& $"( $##"# ##'& 通讯作者刘汝银 &+ 2 & 优先出版 ---&#,&,#"&&&&&&++

2 % 西安交通大学学报医学版第卷 -"%-&%#" 1*1'* " $ ( &1+ % -"#"&1"-+ % -#"& %")!$*#+,#( & -# %& *+, - (# # #+,#% 椎间盘退变 '"$7;$7$746':!$$"$74'" 2 是中老年人的常见病及多发病其病因主要是因为纤维环和髓核的含水量蛋白多糖和胶原等逐渐减少弹性和韧性降低张力下降椎间隙变窄等常见的治疗方法是手术治疗和非手术治疗然而都不能从根本上修复椎间盘退变的病理状态将骨髓间充质干细胞注入到山羊髓核中发现 + 可以阻止椎间盘退化其可能的机制是分化成为髓核样细胞而增加了髓核细胞的数量 % 研究显示用于治疗 2 具有很大的临床应用潜力我们在前期研究中发现 ()* 转化生长因子 + 诱导的向髓核样细胞分化过程中 &'% 高表达本研究旨在探讨 &'% 在向髓核样细胞分化中的作用及其机制材料与方法实验动物清洁级月龄大鼠只雄性体质量由郑州大学提供大鼠饲养与实验过程严格按照河南省中医院动物伦理学委员会要求. 主要试剂培养基赛默飞世尔科技有限公司 (7'6 裂解液赛默飞世尔科技有限公司 17'&$!7'( ($4$"'(444 双荧光素酶检测试剂盒碧云天生物技术 ()*,&7$:! 兔抗大鼠型胶原多克隆抗体兔抗大鼠蛋白多糖多克隆抗体.0 兔抗大鼠多克隆抗体辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 2) +4!'" 兔抗大鼠单克隆抗体所有的抗体均购于,!4& 公司 / 方法 / 的分离培养将月龄大鼠用 &// 水醛进行腹腔麻醉在无菌条件下分离出大鼠双下肢胫股骨剪断两端暴露髓腔用 &/ 注射器吸取含 &//* 的低糖培养基反复冲洗骨髓腔冲洗次收集冲洗液轻轻吹打制成单细胞悬液 7&'" 离心 &'" 去上清用含 &//* 的低糖重悬按细胞密度!& 接种于培养皿中 &//. 孵育箱中培养待细胞生长达到以上用胰酶消化传代培养至第代便可进行下列实验 /.()* 处理将第代以 %!& 的密度接种于孔板的孔中待细胞生长至时加入 /()* 诱导 % 对照组正常培养 % 用于后续实验 // 细胞转染将细胞分为 % 组 <&'% &'&'!&'%'"''7&'% &'&'!- 阴性对照和 &'%'"''7- 阴性对照采用 /'+ 8$!4&'"$ ( 将每组转染入 ()* 诱导的 + 细胞或转染入细胞用于后续实验 / 5$:$7" 6'" 采用 21,6:': #8$7 将裂解离心后吸出上清液体采用, 蛋白试剂盒进行蛋白浓度测定将蛋白样品进行 /+1,) 电泳后转至 1=* 膜上牛奶封闭加一抗 % 孵育过夜后经 (( 冲洗次每次 &'" 加二抗室温孵育经 (( 冲洗次每次 &'" 后经在暗室中曝光以 +4!'" 作为内参结果采用软件 '&4$> 计算统计 /0 双荧光素酶报告基因检测将按照!& 接种于孔板中待细胞生长至采用 /'8$!4&'"$ ( 将扩增的 +?(+ 5( 和 +?(+( 分别转入重组质粒 :'!$!3+ 中成功构建重组质粒 :'!$!3++ +?(+5( 和 :'!$!3+++?(+( 分别与 &'% 共转入中形成 &'%@ +?(+5( 组与 +? (+( 组结果采用发光化学仪检测萤火虫和海肾荧光比值 / 基因过表达载体的构建及转染根据 )$"4"3 中基因序列采用.6' 软件设计引物并交由上海生工生工生物工程股份有限公司中国合成 *?+,)()(,),())(+ )()()(),,)),+??+)(,+ ))())((,,,()(()),,()()))() +? 将测序正确的基因克隆到 )*1+- 载体中构建 )*1+-+ 表达载体采用 /'8$!4&'"$ ( 将 )*1+-+ 转入

3 期岳宗进刘汝银于露等 &'% 通过靶向促进骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化以空载 )*1+- 作为对照 /1:'+-, 介导的基因沉默根据 )$"4"3 中基因序列应用网站 :'2- 设计对 :'-,/,( 对比序列同源性靶向基因的 :'-, 序列由上海生工合成其序列如下 *?+),,),)),,,,((+??+,,,),)))((+? 无关序列 :!74& 6$*?+),,))+,)((+??+,)),,))),)+,,((+? 利用 /'8$!4&'"$ ( 分别将 :'+ -,+ 和 :!74& 6$ 转染到中 / 实时定量 (+1(7'6 法提取中总 -, 采用 17'&$!7'( ( $4$" ' (444 日本进行逆转录和实时定量 1 过程实时定量 (+1 引物由上海生工合成序列如下 *?+,),))(),(,)(,+??+))((),()(),),),(),)+?.0 *?+),(()),)()),+??+,)(,+ ()),,+?./ *?+)),,(,)+,))((,)(,,+??+),(,,,)(+ ((),((+?,,-*?+((,)(+ )),))(),(+??+()(,,()),,,),(+ )(((+? +4!'" *?+()((,,,())+ ),),,+??+))))()((),,))((+,,,+? 通过实时定量 1 检测不同基因的 &-, 表达情况 &'% 逆转录引物?+)()+ (,(,)(),)))(),))(,((),(+ )),(,),,,,+? 和实时定量 1 引物 *?+))))(),),,(),,((,+??+)(),)))(),))(+? 均由生工合成实时定量采用 &'-, 荧光定量 1 试剂盒生工生物工程股份有限公司 A 方法分析 &-, 相对表达量进行统计学分析统计学处理统计软件采用 1 版本实验数据以均数 B 标准差 B 表示组间比较采用检验以为差异有统计学意义. 结果. 在 ( 诱导 ) 向髓核样细胞分化中高表达研究显示髓核细胞具有,,-./ 的表性特征且.0 基因被认为能促进,,- 和./ 合成因此,,-./ 和.0 在向髓核样细胞分化中被认为是髓核样细胞的标志在本研究中细胞经 ()* 诱导后,,-./ 和.0 的蛋白表达量增加与对照组比较差异具有统计学意义图,<% (+1 结果显示经 ()* 诱导后中,,-./ 和.0 的 &-, 表达升高与对照组比较差异具有统计学意义图 < 另外 ()* 诱导向髓核样细胞分化过程中 &'% 表达水平升高与对照组比较具有统计学意义图 < 图在 ( 诱导 ) 向髓核样细胞分化中高表达 *' 9'$7$::'"8&'%'"$7!$::8$'8$7$"'4'"8:'"#6:#:+6'3$!$6:'"#!$ ()*,5$:$7" 6'" 检测 ()* 诱导向髓核样细胞分化后,,-./ 和.0 的蛋白表达图, 的量化图 (+ 1 检测 ()* 诱导向髓核样细胞分化后,,-./ 和.0 的 &-, 表达 (+1 检测 ()* 诱导向髓核样细胞分化后 &'% 的表达水平 "76 组细胞不做处理 ()* 组细胞中加入 /()* 与对照组比较 <.. 促进 ) 向髓核样细胞分化以向中加入 ()* 作为对照转染 &'%&'&+ '! 后,,-./ 和.0 的表达水平升高与对照组比较差异具有统计学意义 < 相反转染 &'%'"''7 后,,-./ 和.0 表达水平下降与对照组比较差异具有统计学意义图,<%%./ 是的靶基因 (47$:!4" 软件预测及文献查阅发现的?( 区是 &'% 的潜在结合位点图, 双荧光素酶报告系统显示图与 &;$!7 组比较 &'% 与野生型 +?( 共转染后检

4 西安交通大学学报医学版第卷测到双荧光素酶活性的下降具有统计学意义 < &'% 与突变型 +?( 共转染后检测到双荧光素酶活性与 &;$!7 组比较差异无统计学意义说明 &'% 与 +?( 结合抑制基因表达为了进一步确认 &'% 对基因表达的影响分别转染 &'%&'&'! 和 '"''7 至中 5$:$7" 6'" 检测蛋白表达水平结果显示转染 &'&'!- 和 '"''7 - 的蛋白表达水平与未处理组相比差异无统计学意义转染 &'% &'&'! 后表达水平低于未处理组且差异具有统计学意义 < 转染 &'%'"''7 后表达水平高于未处理组且差异具有统计学意义图 < % 图. 促进 ) 向髓核样细胞分化 *'&'%7&$$'8$7$"'4'"8'""#!6$#:#6:#:+6'3$!$6:,5$:$7" 6'" 检测 &'%&'&'! 或 '"''7 及其对应 - 转染 ()* 诱导的后,,-./ 和.0 的蛋白表达水平 (+1 检测 &'%&'&'! 或 '"''7 及其对应 - 转染 ()* 诱导的后,,-./ 和.0 的 &-, 表达水平与对照组比较 < 图 / 是的靶基因 *'($47$$"$8&'%4:,&'% 与 -! 的?( 区野生型和突变型位点的序列对比图双荧光素酶报告系统显示是 &'% 的靶基因与 &;$!7 组比较 &'% &'&'! 或 '"''7 转染对 -! 蛋白表达水平的影响与对照组比较 <. 通过靶向促进骨髓间充质干细胞向髓核样细胞的分化 '+-, 介导基因沉默后蛋白表达水平的下调具统计学意义图 %,< 过表达后蛋白表达水平的上调具有统计学意义图 %,< 图 % 和显示转染 &'% &'&'! 后,,-./ 和.0 的蛋白表达水平与对照组相比升高且差异具有统计学意义 < 转染过表达载体后,,-./ 和.0 的蛋白表达水平下调且具有统计学意义 < 当 &'%&'&'! 与过表达载体共转细胞后,,-./.0 的蛋白表达水平与对照组相比差异无统计学意义但低于 &'%&'&'! 单独转染组且差异具有统计学意义图 %%< (+1 检测结果显示,,-./.0 的 &+ -, 表达水平与蛋白表达水平变化趋势一致图 %

5 期岳宗进刘汝银于露等 &'% 通过靶向促进骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化图通过靶向促进骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化 *'%&'%7&$$'8$7$"'4'"8'""#!6$#:#6:#:+6'3$!$6: 47$'",5$:$7" 6'" 验证的沉默与过表达载体构建成功过表达减少了 &'% &'&'! 转染对,,-./.0 的蛋白表达的影响图的量化图过表达减少了 &'%&'&'! 转染对,,-./.0 的 &-, 表达的影响与对照组比较与 '&'! 组比较 <.0 负向调控的表达与对照组相比!74& 6$ 组和 &;$!7 组 &'% 的表达差异无统计学意义 :'+-, 介导沉默后 &'% 的表达水平与对照组比较上调且差异具有统计学意义 < 相反过表达后与对照组相比 &'% 的表达水平的下调具有统计学意义图 <% 图 0 负向调控的表达 *' "$4';$6 7$#64$ $ $7$::'" 8 &'% 与对照组比较 < / 讨论 2 是骨科常见病也是腰痛产生的源头髓核组织失水纤维化蛋白多糖和胶原逐渐减少是 2 的主要原因目前认为髓核细胞移植为椎间盘治疗提供了前景然而研究显示髓核细胞生长缓慢不好培养因其可多向分化增殖能力强及可在一定条件下如 ()* 被诱导成为髓核样细胞成为研究热点有研究显示在斑马鱼的胚胎发育中 &'% 特异性的表达在软骨细胞中因髓核细胞具有软骨细胞的表性特征,,-./ 又被称为类软骨细胞.0 基因被认为能促进,,- 和./ 合成延缓 2 发展在本研究中 ()* 诱导向髓核样细胞分化过程中 &'% 的表达量升高我们推测 &'% 的表达可能与,,-./ 和.0 的增加相关因此在 ()* 诱导向髓核样细胞分化过程中我们检测了上调或下调 &'% 对,,-./ 和.0 表达水平的影响结果证实在 ()* 诱导的中转染 &'% 增加了,,-./ 和.0 的表达水平与本研究相似在软骨细胞中转染 &'%4 抑制了 2/+ 介导的,,- 和./ 表达的减少并且有研究显示髓核细胞中转染 &'%4 可以减少 2/+ 诱导的椎间盘退变和炎症的形成当在患有椎间盘小鼠体内敲除 &'%4 后 2/+ 诱导的蛋白 % 多糖的退化加剧因此 &'% 促进向髓核样细胞分化我们进一步检测了 &'% 的靶基因发现是 &'% 的靶基因并且 &'% 抑制的表达.2)/ 等发现沉默促进了向髓核样细胞分化并且的过表达显著地抑制了 &'% &'&'! 转染引起的,,-./ 和.0 表达的增加实验结果证明 &'% 通过靶向促进骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化另外本研究观察到的过表达抑制 &'% 的表达而 :'+-, 介导沉默促进了 &'% 的表达说明负向调控 &'% 的表达但通过何种机制调控 &'% 的表达有待进一步研究

6 西安交通大学学报医学版第卷综上所述本研究证实了 &'% 与形成反馈环路促进 ()* 诱导向髓核样细胞分化参考文献鲁玉来 & 腰椎间盘突出症 & 中国矫形外科杂志 +%& $1314.1'.$$'/)&$# + ("#(#"&' %%+& /$!%'')$)&4+ #"$+@ # ##"+ # "( "#&'$%+%& % 王锋王运涛吴小涛 & 髓核细胞修复椎间盘退行性变的研究进展 & 中国修复重建外科杂志 %+& 王春生张维斌 & 髓核细胞移植抑制椎间盘退变 & 中国组织工程研究 +%%& 呼和韩成龙姜超等 & 转化生长因子对骨髓干细胞分化类髓核细胞的影响 & 中国组织工程研究 + & '44 $*1*343&# "#+""# ##+,#&$%% %+%& *4'$' 544$).!%&""#+ #2 #(" ("# "&* $ *%+& )61'. 771'/&'""" ((## #1 (# #&8$#+!"+& 1' *41'/ *7 *&.+ -#(+"#" # # #+,#"" # #"+ &*!)+& 64'.$ 3$!1' 6!4$31 &!#'18((#"& $##+& /) '' 4'/1!1&$ ##"#"#"#+ 8-""#"&$ +& 4/4)$' /34!$&!#'1+%," +" &/ %%+%& %/ $4 1!4'&!#'1+%+ "#4+"" + ("#&/+&!4/!$1 551'/ 5&/0+"# #+,'#,#,"-(( (- # #&*)4 +& 编辑卓选鹏上接第 % 页 ## "#& %*'/734!$3'/$&*#"#++ 3!"$#+%& ##"## " 0!1'.$*0!1'.$0/1.& +-+ &$ )####&*+ %%+&!" )# )" + 44)1'. 1$))4'$!&1"#"+ %& ""#"#2# *1$' /63645 '&*#("# $%%$$+%$& #&)$1+& )1)1 0$161'4!1$&"+ 1%4'!.1)))$34.&*#+ #"##"# + ##-&$% "# &$+ %+%& & 编辑邱芬 61'/ *$*1'/*1'/ $&"#

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽