标题

Size: px

Start display at page:

Download "标题"

综晁樊
5 years ago
Views:

1 2017 年 8 月 Vol.35 No.8 August 2017 Chinese Journal of Chromatography 816 ~ 825 研究论文 DOI: / SP.J 分散固相萃取液相色谱串联质谱法同时快速测定化妆品中 81 种糖皮质激素罗辉泰, 黄晓兰, 吴惠勤, 张秋炎, 朱志鑫, 黄芳, 林晓珊, 马叶芬, 邓欣 ( 中国广州分析测试中心, 广东省化学危害应急检测技术重点实验室, 广东广州 ) 摘要 : 建立了分散固相萃取液相色谱串联质谱同时快速测定化妆品中 81 种非法添加糖皮质激素 ( GCs) 的分析方法样品用水分散后加乙腈超声提取, 经十八烷基键合硅胶 (C 18 ) 和 N 丙基乙二胺 (PSA) 净化, 待测物选用具有多重色谱保留模式的 Poroshell 120 PFP 色谱柱 (100 mm 2 1 mm, 2 7 μm) 分离, 以 0 2% (v / v) 乙酸水溶液乙腈为流动相梯度洗脱, 在电喷雾正离子模式下以动态多反应监测方式测定, 内标法定量 81 种待测物在各自的浓度范围内线性关系良好, 相关系数均大于 0 99, 在 3 个不同的添加水平下, 平均回收率为 68 8% ~ 105 3%, RSD 为 2 9% ~ 13 1% (n = 6), 方法的检出限 ( S / N 3) 和定量限 ( S / N 10) 分别为 ~ μg / g 和 ~ μg / g 筛查了 137 个化妆品样品, 发现 16 个阳性样品, 含量为 16 9~ 158 μg / g 结果表明, 该法简便快速, 灵敏可靠, 适用于化妆品中 81 种 GCs 的同时快速定性定量筛查分析关键词 : 液相色谱串联质谱 ; 分散固相萃取 ; 同位素稀释 ; 非法添加 ; 糖皮质激素 ; 化妆品中图分类号 :O658 文献标识码 :A 文章编号 : (2017) Simultaneous rapid determination of 81 glucocorticoids in cosmetics by dispersive solid phase extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry LUO Huitai, HUANG Xiaolan, WU Huiqin, ZHANG Qiuyan, ZHU Zhixin, HUANG Fang, LIN Xiaoshan, MA Yefen, DENG Xin (Guangdong Provincial Key Laboratory of Emergency Test for Dangerous Chemicals, China National Analytical Center (Guangzhou), Guangzhou , China) Abstract: A novel method was developed for the simultaneous rapid determination of 81 ille gally added glucocorticoids ( GCs) in cosmetics using dispersive solid phase extraction ( d SPE) and liquid chromatography tandem mass spectrometry ( LC MS / MS). The analytes were extracted by acetonitrile after dispersing with water, and then purified using the C 18 and primary secondary amine ( PSA). The chromatographic separations were performed on a Poroshell 120 PFP column (100 mm 2 1 mm, 2 7 μm) under multiple chromatographic retention modes. Acetonitrile and 0 2% (v / v) acetic acid aqueous solution were used as mobile phases with gra dient elution, and all the 10 groups of isomers were baseline separated. The qualitative identifi cation and quantitative analysis of the 81 GCs were operated in the electrospray ionization posi tive mode using dynamic multiple reaction monitoring ( DMRM). The 81 GCs finally were quan tified by internal standard method. The correlation coefficients of linear calibration curves were greater than 0 99 in the corresponding mass concentration ranges. The average recoveries of the 81 GCs at three spiked levels ranged from 68 8% to 105 3% with relative standard deviations 收稿日期 : 通讯联系人.Tel:(020) ,E mail:wenhxl@ 126.com. 基金项目 : 广东省省级科技计划项目 (2014A ,2014B ). Foundation item: Science and Technology Plan Project of Guangdong Province of China ( Nos. 2014A , 2014B ).

2 第 8 期罗辉泰, 等 : 分散固相萃取液相色谱串联质谱法同时快速测定化妆品中 81 种糖皮质激素 817 ( RSDs) of 2 9% -13 1% (n = 6). The LODs (S / N 3) and LOQs (S / N 10) were μg / g and μg / g, respectively. A number of 137 cosmetic samples submitted by customers were screened. Sixteen positive samples were found, and the contents of GCs were from 16 9 μg / g to 158 μg / g. The results showed that the new method is simple, rapid, sensi tive and reliable, and it is suitable for qualitative and quantitative screening analysis of the 81 GCs in cosmetics simultaneously. Key words: liquid chromatography tandem mass spectrometry ( LC MS / MS); dispersive solid phase extraction (d SPE); isotope dilution; illegally added; glucocorticoids (GCs); cosmetics 糖皮质激素 (glucocorticoids, GCs) 是一类母核为环戊烷骈多氢菲结构的甾体激素, 具有抗炎抗过敏抗休克和免疫抑制等药理作用 [1], 是临床皮肤科领域应用最广泛的外用药物之一但长期使用 GCs 会引起激素依赖性皮炎皮肤萎缩和其他毒副作用 [2], 对人体造成严重危害 2015 年版的化妆品安全技术规范 [3] 将 GCs 列为化妆品禁用组分, 欧盟 [4] 东盟 [5] 日本 [6] [7] 韩国等国家和地区的化妆品法规亦有此规定但因 GCs 对皮肤具有显著的消炎祛痘美白护肤功效, 部分商家依然将其非法添加到化妆品中, 以谋取不当利益类似的不法行为在各级食品药品监督管理部门组织开展的化妆品监督抽检中多次被发现 [8-10], 由此导致的化妆品安全事件也屡见报道更为严重的是, 在日常检测工作中发现, [11,12] 为规避监管, 非法添加法定检验方法监测范围之外的其他 GCs 成为新趋势因此, 建立样品前处理方法更简便品种更齐全的检测方法尤为迫切, 对保障消费者安全具有重要的现实意义近年来检测化妆品中 GCs 的方法主要有液相色谱法 [13] 液相色谱串联质谱法 (LC MS / MS) [14-16] 和液相色谱高分辨质谱法 (LC HRMS) [17,18] 由于质谱法具有选择性好灵敏度高抗干扰能力强等特点, 目前已成为最主要的检测手段尽管高分辨质谱较串联质谱具有更强的定性能力, 但仪器成本高普及率低因此, 对于大多数检测机构而言, LC [11,12,14] MS / MS 更为适用此外, 已报道的方法大多采用固相萃取 ( SPE) 净化样品, 方法耗时, 成本高, 且难以实现大批量样品的同时处理 [14] 本课题组在前期研究的基础上, 针对现有方法普遍存在的样品前处理耗时成本高分离效果较差定量结果受基质影响大等问题, 采用兼具疏水 π π 偶极偶极等多重色谱作用模式的五氟苯基 (PFP) 色谱柱, 通过优化样品前处理和色谱质谱条件, 建立了分散固相萃取 ( d SPE) 液相色谱串联质谱同时快速测定化妆品中 81 种 GCs 的分析方法, 实现了 10 组同分异构体的基线分离, 是目前可同时测定化妆品中 GCs 种类最多的高通量方法, 涉及法定检测方法规定的所有 42 种 GCs 及可能被非法添加至化妆品中的其他 39 种 GCs, 可为化妆品中 GCs 的高通量分析提供技术支持, 能极大地提高化妆品安全风险的监控水平 1 实验部分 1.1 仪器试剂与材料 1200 SL Series RRLC 6410B Triple Quard MS 液相色谱串联四极杆质谱仪 ( 美国 Agilent 公司 ); AS 3120 超声波发生器 ( 天津奥特赛恩斯仪器有限公司 ); H1850 离心机 ( 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司 ); XW 80A 快速混匀器 ( 海门市麒麟医用仪器厂 ); DC12H 水浴式氮吹浓缩仪 ( 上海安谱科学仪器有限公司 ) 氯化钠 (NaCl) 亚铁氰化钾三水合物和乙酸锌二水合物 ( 分析纯, 广州化学试剂厂 ); 无水硫酸镁 (MgSO 4, 分析纯, 上海晶纯生化科技股份有限公司 ); 乙腈甲醇和乙酸 ( 色谱纯, 美国 Thermo Fisher Sci entific 公司 ); 十八烷基键合硅胶颗粒 ( Bondesil C 18 ) N 丙基乙二胺颗粒 ( Bondesil PSA) 均为 40 μm( 美国 Agilent 公司 ) 实验用水为二次蒸馏水 81 种 GCs 标准品 : 曲安西龙 ( TL) 泼尼松龙 (PL) 氢化可的松 ( HC) 泼尼松 ( PN) 可的松 (CS) 倍他米松( BM) 地塞米松( DM) 曲安奈德 (TAN) 泼尼松龙醋酸酯(PLA) 氟米龙(FML) 氢化可的松醋酸酯 (HCA) 地夫可特(DC) 氟氢可的松醋酸酯 (FCSA) 泼尼松醋酸酯(PNA) 可的松醋酸酯 (CSA) 布地奈德( BDN) 氢化可的松丁酸酯 (HCB) 地塞米松醋酸酯 ( DMA) 氟米龙醋酸酯 (FMLA) 曲安奈德醋酸酯(TANA) 氟轻松醋酸酯 ( FCD ) 哈西奈德 ( HCN ) 氯倍他索丙酸酯 (CLBP) 倍他米松双丙酸酯( BMDP) 和倍氯米松双丙酸酯 ( BCDP) ( 纯度 >95 0%, 中国食品药品检定研究院 ); 氟氢缩松 ( FDT) 曲安西龙双醋酸酯 (TLDA) 氢化可的松戊酸酯(HCV) 阿氯米松双丙

3 818 色谱第 35 卷酸酯 ( ACDP) 瑞美松龙( RMX) 倍他米松苯甲酸酯 (BMB) 氢化可的松环戊丙酸酯( HCC) 和氯可托龙特戊酸酯 ( CCLP) ( 纯度 > 95 0%, 美国药典委员会 ); 泼尼卡酯 (PNC) 氟替卡松丙酸酯(FTCP) 氟轻松 (FCAN) 泼尼松龙特戊酸酯(PLP) 地塞米松异烟酸酯 ( DMIN) 地塞米松特戊酸酯( DMP) 氟米松特戊酸酯 (FMP) 氟可龙特戊酸酯(FCLP) 氢化可的松琥珀酸酯 ( HCHS ) 和己曲安奈德 (TLHN)( 纯度 >95 0%, 欧洲药品质量管理局 ); 倍氯米松 (BC) 甲基泼尼松龙醋酸酯(MPA) 倍他米松醋酸酯 ( BMA) 双氟拉松双醋酸酯( DFDA) 倍他米松戊酸酯 (BMV) 安西奈德(AN) 莫米他松糠酸酯 ( MMF) 氯倍他松丁酸酯 ( CBB) 地索奈德 (DN) 环索奈德( CCN) 卤美他松( HM) 帕拉米松 (PM) 帕拉米松醋酸酯(PMA) 双氟可龙戊酸酯 (DFV) 异氟泼尼龙(IFP) 去羟米松(DOM) 卤贝他索丙酸酯 ( HBTP) 氟尼缩松( FN) 依碳氯替泼诺 (LE) 氟可龙( FCL) 倍他米松丙酸酯( BMP) 异氟泼尼龙醋酸酯 (IFPA) 甲泼尼松(MPN) 甲泼尼松醋酸酯 ( MPNA) 双氟拉松( DF) 氟氢可的松 (FCS) 16α 羟基泼尼松龙 (HPL) 6α 氟异氟泼尼龙 (FIFP) 甲基泼尼松龙琥珀酸酯( MPHS) 甲基泼尼松龙醋丙酸酯 ( MPAP) 卤贝他索( HBT) 地塞米松戊酸酯 ( DMV) 替可的松特戊酸酯( TCP) 氯泼尼醇 ( CLP ) 和双氟泼尼酯 ( DFP ) ( 纯度 > 98 0%, 加拿大 TRC 公司 ); 16α 羟基泼尼松龙醋酸酯 (HPLA) ( 纯度 95 0%, 美国 Matrix Scientific 公司 ); 甲基泼尼松龙 ( MP) ( 纯度 98 9%, 德国 Dr. Ehrenstorfer 公司 ); 氟米松 ( FM) ( 纯度 99 0%, 挪威 Chiron 公司 ) 7 种 GCs 同位素内标 : 氢化可的松 d2(hc d2) ( 纯度 99 0%, 加拿大 CDN 公司 ); 甲基泼尼松龙 d3( MP d3 ) 氟米松 d3 ( FM d3 ) 地夫可特 d3 (DC d3) 氯倍他索丙酸酯 d5( CLBP d5) 倍他米松双丙酸酯 d10 ( BMDP d10 ) 和环索奈德 d7 (CCN d7)( 纯度 95%, 加拿大 TRC 公司 ) 1.2 标准溶液的配制准确称取适量 GCs 标准品和同位素内标, 用乙腈分别溶解, 配制质量浓度为 mg / L 的单标准储备液, 置于棕色瓶中, 于 -20 保存将 7 种同位素内标的单标准储备液用乙腈稀释成质量浓度为 5 mg / L 的混合内标工作液, 置于棕色瓶中, 于 4 保存根据需要, 吸取各单标准储备液适量, 用 50% (v / v) 乙腈水溶液稀释并配制成所需浓度的混合标准工作液, 其中各同位素内标的质量浓度均为 50 μg / L, 置于棕色瓶中, 于 4 保存 1.3 样品前处理准确称取均匀试样 1 0 g( 精确至 0 01 g) 于 50 ml 聚丙烯离心管中, 准确加入 40 μl 混合内标工作液和 10 ml 水, 充分涡旋分散后, 加入 10 ml 乙腈, 涡旋提取 1 min, 超声提取 10 min 后, 分别加入 106 g / L 的亚铁氰化钾溶液和 219 g / L 的乙酸锌溶液各 0 2 ml, 涡旋混匀 1 min, 加入盐析剂 (1 0 g NaCl+2 0 g MgSO 4 ), 振摇 1 min, 以 r / min 离心 10 min 后, 准确移取上层清液 5 ml 于 15 ml 聚丙烯离心管中, 加入净化剂 (150 mg Bondesil C mg Bondesil PSA mg MgSO 4 ), 涡旋混匀 1 min, 以 r / min 离心 5 min, 将上清液全部转移至带 2 ml 刻度的梨形瓶中, 然后置于 45 水浴中氮吹浓缩至 1 ml, 用水定容至刻度, 涡旋混匀, 过 0 22 μm 滤膜, 待上机分析 1.4 分析条件色谱柱 :Poroshell 120 PFP 色谱柱 (100 mm 2 1 mm, 2 7 μm, 美国 Agilent 公司 ); 柱温 :30 ; 流动相 A: 0 2% ( v / v) 乙酸水溶液 ; 流动相 B: 乙腈 ; 流速 :0 35 ml / min; 进样量 :5 μl 梯度洗脱程序 :0 ~ 5 0 min, 20% B; 5 0 ~ 10 0 min, 20% B ~ 25% B; 10 0 ~ 20 0 min, 25% B ~ 38% B; 20 0 ~ 28 0 min, 38% B ~ 48% B; 28 0 ~ 31 0 min, 48% B ~ 52% B; 31 0 ~ 31 1 min, 52% B ~ 95% B; 31 1 ~ 33 0 min, 95% B; 33 0 ~ 33 1 min, 95% B ~ 20% B; 33 1 ~ 39 0 min, 20% B 离子源 : 电喷雾离子 ( ESI) 源 ; 扫描方式 : 正离子扫描 ; 采集方式 : 动态多反应监测 ( DMRM); 雾化气压力 :276 kpa; 干燥气流量 :11 0 L / min; 干燥气温度 :350 ; 毛细管电压 :4 000 V; 采集时间窗口 (delta retention time): 2 min 其他质谱参数见表 1 2 结果与讨论 2.1 质谱条件的优化在电喷雾离子源的正离子模式和负离子模式下, 分别对质量浓度为 1 0 mg / L 的各待测物单标准溶液进行一级全扫描分析, 获得准分子离子或加合离子在正离子模式下, 除 BC 的基峰离子为 [M+H-H 2 O] +,BM DM BMA DMA 和 IFPA 的基峰离子为 [ M+H-HF] + 外, 其余待测物的基峰离子均为准分子离子 [M+H] + ; 在负离子模式下, 除化合物 HCHS HPL HPLA MPHS 和 TCP 的基峰离子为 [ M-H] -, 其余待测物的基峰离子均为加合离子

4 第 8 期罗辉泰, 等 : 分散固相萃取液相色谱串联质谱法同时快速测定化妆品中 81 种糖皮质激素 819 No. Table 1 表 1 81 种糖皮质激素和 7 种同位素内标的质谱参数 MS parameters of the 81 glucocorticoids ( GCs) and seven isotope internal standards Compound t R / min Parent ion (m / z) Product ions (m / z) Fragmentor / V Collision energies / V Internal standard No. 1 triamcinolone (TL) / / prednisolone (PL) / / hydrocortisone (HC) / / prednisone (PN) / / cortisone (CS) / / methylprednisolone (MP) / / betamethasone (BM) / / dexamethasone (DM) / / flumethasone (FM) / / beclomethasone (BC) / / triamcinolone acetonide (TAN) / / fludroxycortide (FDT) / / triamcinolone diacetate (TLDA) / / prednisolone 21 acetate (PLA) / / fluorometholone (FML) / / hydrocortisone 21 acetate (HCA) / / deflazacort (DC) / / fludrocortisone 21 acetate (FCSA) / / prednisone 21 acetate (PNA) / / cortisone 21 acetate (CSA) / / methylprednisolone 21 acetate (MPA) / / betamethasone 21 acetate (BMA) / / budesonide (BDN) / / hydrocortisone 17 butyrate (HCB) / / dexamethasone 21 acetate (DMA) / / fluorometholone 17 acetate (FMLA) / / hydrocortisone 17 valerate (HCV) / / triamcinolone acetonide 21 acetate (TANA) / / fluocinonide (FCD) / / diflorasone diacetate (DFDA) / / betamethasone 17 valerate (BMV) / / prednicarbate (PNC) / / halcinonide (HCN) / / alclomethasone dipropionate (ACDP) / / amcinonide (AN) / / clobetasol 17 propionate (CLBP) / / fluticasone propionate (FTCP) / / mometasone furoate (MMF) / / betamethasone dipropionate (BMDP) / / beclomethasone dipropionate (BCDP) / / clobetasone 17 butyrate (CBB) / / fluocinolone acetonide (FCAN) / / desonide (DN) / / ciclesonide (CCN) / / halometasone (HM) / / paramethasone (PM) / / paramethasone acetate (PMA) / / diflucortolone valerate (DFV) / / isoflupredone (IFP) / / desoximetasone (DOM) / / halobetasol propionate (HBTP) / / flunisolide (FN) / / loteprednol etabonate (LE) / / fluocortolone (FCL) / / rimexolone (RMX) / / 16 86

5 820 色谱第 35 卷 No. Compound 表 1 ( 续 ) Table 1 ( Continued) t R / min Parent ion (m / z) Product ions (m / z) Fragmentor / V Collision energies / V Internal standard No. 56 betamethasone 17 benzoate (BMB) / / prednisolone 21 pivalate (PLP) / / betamethasone 17 propionate (BMP) / / dexamethasone 21 isonicotinate (DMIN) / / dexamethasone 21 pivalate (DMP) / / flumethasone 21 pivalate (FMP) / / fluocortolone 21 pivalate (FCLP) / / isoflupredone acetate (IFPA) / / hydrocortisone 21 cypionate (HCC) / / hydrocortisone hemisuccinate (HCHS) / / meprednisone (MPN) / / meprednisone acetate (MPNA) / / triamcinolone hexacetonide (TLHN) / / diflorasone (DF) / / fludrocortisone (FCS) / / α hydroxyprednisonlone (HPL) / / α hydroxyprednisonlone acetate (HPLA) / / α fluoro isoflupredone (FIFP) / / methylprednisolone hemisuccinate (MPHS) / / methylprednisolone aceponate (MPAP) / / clocortolone pivalate (CCLP) / / halobetasol (HBT) / / dexamethasone 17 valerate (DMV) / / tixocortol pivalate (TCP) / / cloprednol (CLP) / / difluprednate (DFP) / / methylprednisolone d3 (MP d3) flumethasone d3 (FM d3) deflazacort d3 (DC d3) hydrocortisone d2 (HC d2) clobetasol 17 propionate d5 (CLBP d5) betamethasone dipropionate d10 (BMDP d10) ciclesonide d7 (CCN d7) t R : retention time; quantitation ion. [M+CH 3 COO] -, 且该模式下基峰的相对丰度多数不到正离子模式下的 1 / 2 因此, 实验在正离子模式下进一步优化质谱条件, 同时为了统一, 母离子均选择 [M+H] +, 通过选择离子监测模式分别优化每个化合物的碎裂电压, 获得最佳的母离子响应然后, 对母离子进行子离子全扫描, 按欧盟 2002/ 657/ EC 决议的规定, 选择两个主要特征子离子, 通过优化碰撞能量使其响应最佳优化后的质谱参数见表色谱条件的优化 81 种 GCs 是在环戊烷骈多氢菲基本母核基础上修饰得到的系列化合物, 包括具有相同相对分子质量的 15 组共 43 个化合物, 其中有 10 组共 25 个同分异构体, 部分化合物的母离子和子离子均相同, 仅依据质谱难以准确定性因此, 实现这 15 组化合物的良好分离是准确定性定量分析的前提和关键色谱柱的选择对于分离分析含有众多同分异构体的 GCs 而言, 选择一款具有独特选择性的色谱柱非常必要目前已报道的方法几乎都采用含有 C 18 填料的色谱柱, 分离效果不甚理想, 尤其是对结构极为相似的差向异构体本研究首先尝试采用兼具疏水和 π π 相互作用的 Poroshell 120 Phenyl Hexyl(100 mm 2 1 mm, 2 7 μm) 和 Xselect CSH Phenyl Hexyl (100 mm 2 1 mm, 3 5 μm) 色谱柱进行分离, 尽管对大多数化合物具有良好的分离效果, 但仍较难实现差向异构体如地塞米松与倍他米松的分离 [19] 据文献报道,PFP 柱是键合了五氟苯基官能团的硅胶柱, 除具有传统 C 18 填料的疏水相互作用外, 还可与化合物发生 π π 偶极偶极电荷转移和离子交换等作用, 使其对结构相近的化合物尤其是

6 第 8 期罗辉泰, 等 : 分散固相萃取液相色谱串联质谱法同时快速测定化妆品中 81 种糖皮质激素 821 位置异构体及卤代物具有独特的选择性本研究比较了采用 Poroshell 120 PFP (100 mm 2 1 mm, 2 7 μm) 和 Xselect HSS PFP (100 mm 2 1 mm, 3 5 μm) 色谱柱时的分离效果结果显示, 前者对 GCs 的选择性较好, 最难分离的几组差向异构体如 DM 和 BM DMA 和 BMA 的分离度均有明显改善, 获得色谱峰数量多且峰形佳因此选用 Poroshell 120 PFP 色谱柱 (100 mm 2 1 mm, 2 7 μm) 作为本方法的分析柱流动相的选择由 2 1 节可知, 本实验选择电喷雾正离子模式采集质谱数据, 因此在流动相中加入酸性添加剂可获得更好的质谱响应在选定的色谱柱上, 考察了 3 种常用的流动相体系 (0 2% (v / v) 甲酸水溶液乙腈含 10 mmol / L 甲酸铵的 0 2% ( v / v) 甲酸水溶液乙腈和 0 2% (v / v) 乙酸水溶液乙腈 ) 对目标物分离效果的影响结果表明, 大多数 GCs 在 0 2% (v / v) 乙酸水溶液乙腈的流动相体系下可以获得最佳的质谱响应及良好的色谱峰形经进一步优化梯度洗脱程序, 所有化合物均获得了良好的分离, 且保留时间分布均匀, 并实现了 10 组共 25 个同分异构体的基线分离具有相同相对分子质量的 15 组化合物的分离情况见图前处理条件的优化根据 GCs 的结构特点和极性大小的分布情况, 本实验选取分布在不同保留时间段的 10 种代表性 GCs( TL PN FMLA FCD FTCP CCN HM PM FN 和 DFP) 作为样品前处理条件优化的研究对象 Fig. 1 图 1 具有相同相对分子质量的 15 组化合物的基峰色谱图 Base peak chromatograms ( BPCs) of the 15 groups of compounds with the same relative molecular mass Peak Nos. in Fig. 1 were the same as in Table 1.

7 822 色谱第 35 卷提取条件的优化 [14] 在前期研究中, 已知甲醇和乙腈适合提取化妆品中的 GCs, 但考虑到甲醇的盐析分层效果不如乙腈, 不利于后续采用 d SPE 技术进行净化, 因此本法选用乙腈作为提取溶剂在化妆水乳液膏霜和粉剂等 4 种不同基质化妆品的阴性样品中, 分别添加 50 μg / kg 的待测物, 考察直接加乙腈提取 ( 方法 Ⅰ) 与先加水分散后再加乙腈提取 ( 方法 Ⅱ) 两种提取方式对 4 种不同基质化妆品中 10 种代表性 GCs 提取回收率的影响结果表明, 对于化妆水基质, 两种方法的提取回收率没有显著差别 ; 对于乳液膏霜和粉剂基质, 方法 Ⅱ 的提取回收率明显高于方法 Ⅰ, 这可能是因为水提高了样品的分散程度, 同时乙腈与水互溶, 增加了提取溶剂的渗透性, 所以其提取效果更佳, 而直接加乙腈往往导致沉淀包裹, 阻止溶剂进一步渗透样品因此, 本方法在加入乙腈提取前先用水充分分散样品净化条件的优化常用的 d SPE 吸附剂主要有 C 18 PSA 和石墨化炭黑 (GCB) 等其中 C 18 可以有效去除弱极性杂质, 而 PSA 在脱水剂无水硫酸镁存在的情况下可以有效去除有机酸色素和金属离子 GCB 尽管对色素等干扰物有良好的吸附能力, 但其对甾醇类化合物亦有极强的吸附作用, 而 GCs 的结构与甾醇极为相似因此, 选择 C 18 和 PSA 作为吸附剂, 并与脱水剂无水硫酸镁组成 d SPE 的净化剂为了获得最佳的净化效果, 本研究以添加了 50 μg / kg 10 种代表性 GCs 的膏霜化妆品中待测物的平均回收率为试验指标, 选取 Bondesil C 18 用量 ( mg) Bondesil PSA 用量 ( mg) 和无水硫酸镁用量 ( mg) 共 3 个因素和 3 个水平, 按照 L 9 (3 4 ) 正交表进行试验结果表明, 影响回收率指标因素的主次顺序为 Bondesil C 18 用量 >Bondesil PSA 用量 > 无水硫酸镁用量 ; 最佳的净化剂组成为 150 mg Bondesil C mg Bondesil PSA mg MgSO 4, 此时可获得良好的净化效果和回收率 2.4 基质效应的评价与其他分析手段不同, 质谱分析尤其是电喷雾质谱分析往往会存在基质效应 ( ME) [20], 影响方法的灵敏度精密度和准确度本文采用提取后添加法对基质最复杂的膏霜样品进行了基质效应评价, 按照公式 :ME = (1- 空白基质溶液中待测物的响应值 / 纯溶剂中相应待测物的响应值 ) 100% 计算, 得到 81 种 GCs 的 ME( 见表 2) ME = 0, 表示无基质效应的理想情形 ;ME < 0, 表示存在基质增强效应 ; ME>0, 表示存在基质抑制效应绝对值越大则表示基质效应越明显结果表明, 大多数化合物的 ME 在 ±20% 内, 属于弱基质效应, 且以基质抑制效应为主为了消减基质效应的影响, 采用同位素内标法进行定量, 结合优化后的样品前处理手段和色谱分离条件, 获得了较为满意的方法学数据另外, 同位素内标的使用还有效监控了实验过程, 很好地消除了系统误差, 提高了定量结果的准确性, 避免了假阴性结果的发生表 2 81 种糖皮质激素的线性方程相关系数 (r 2 ) 检出限定量限回收率精密度和基质效应 Table 2 Linear equations, correlation coefficients (r 2 ), LODs, LOQs, recoveries, precisions and matrix effects (MEs) of the 81 GCs No. Linear equation r 2 LOD / (μg / g) LOQ / (μg / g) Recovery (n = 6) / % RSD (n = 6) / % ME / % 1 y = x , 88.9, , 9.8, y = x , 87.5, , 9.0, y = x , 95.3, , 6.9, y = x , 89.3, , 10.1, y = x , 97.3, , 7.6, y = x , 96.3, , 4.3, y = x , 95.2, , 6.6, y = x , 96.3, , 7.8, y = x , 95.5, , 10.1, y = x , 95.4, , 8.7, y = x , 89.4, , 6.7, y = x , 103.3, , 9.6, y = x , 86.3, , 9.3,

8 第 8 期罗辉泰, 等 : 分散固相萃取液相色谱串联质谱法同时快速测定化妆品中 81 种糖皮质激素 823 表 2 ( 续 ) Table 2 ( Continued) No. Linear equation r 2 LOD / (μg / g) LOQ / (μg / g) Recovery (n = 6) / % RSD (n = 6) / % ME / % 14 y = x , 96.8, , 8.4, y = x , 93.5, , 7.2, y = x , 96.3, , 7.3, y = x , 93.2, , 9.3, y = x , 98.3, , 6.2, y = x , 95.3, , 9.5, y = x , 97.3, , 6.7, y = x , 89.4, , 11.8, y = x , 101.3, , 5.4, y = x , 95.5, , 7.8, y = x , 96.4, , 5.7, y = x , 96.7, , 9.0, y = x , 98.3, , 8.2, y = x , 94.9, , 5.0, y = x , 86.9, , 7.8, y = x , 90.8, , 8.2, y = x , 94.8, , 9.1, y = x , 96.5, , 6.3, y = x , 93.9, , 6.9, y = x , 92.4, , 9.3, y = x , 86.8, , 9.3, y = x , 93.2, , 8.3, y = x , 98.6, , 8.2, y = x , 92.3, , 8.9, y = x , 87.4, , 8.3, y = x , 95.2, , 8.9, y = x , 89.8, , 9.2, y = x , 92.3, , 10.3, y = x , 97.5, , 8.2, y = x , 101.2, , 8.2, y = x , 95.9, , 8.9, y = x , 93.4, , 4.6, y = x , 96.4, , 8.2, y = x , 94.3, , 8.4, y = x , 87.6, , 6.9, y = x , 92.3, , 10.3, y = x , 93.2, , 9.3, y = x , 96.3, , 6.5, y = x , 95.3, , 5.6, y = x , 96.3, , 6.3, y = x , 94.2, , 5.3, y = x , 98.3, , 6.3, y = x , 99.3, , 3.5, y = x , 90.4, , 9.5, y = x , 94.3, , 5.6, y = x , 97.6, , 4.3, y = x , 89.3, , 8.5, y = x , 95.3, , 9.6, y = x , 97.4, , 3.5, y = x , 103.1, , 6.7, y = x , 97.3, , 7.8, y = x , 98.4, , 3.6, y = x , 97.9, , 4.5, y = x , 95.3, , 5.3, y = x , 95.3, , 8.4,

9 824 色谱第 35 卷表 2 ( 续 ) Table 2 ( Continued) No. Linear equation r 2 LOD / (μg / g) LOQ / (μg / g) Recovery (n = 6) / % RSD (n = 6) / % ME / % 69 y = x , 96.3, , 5.6, y = x , 97.3, , 6.4, y = x , 89.4, , 9.3, y = x , 95.3, , 5.6, y = x , 92.3, , 8.3, y = x , 95.6, , 8.6, y = x , 94.5, , 8.5, y = x , 95.3, , 7.5, y = x , 93.5, , 10.2, y = x , 96.2, , 5.6, y = x , 97.3, , 3.7, y = x , 96.3, , 8.2, y = x , 98.4, , 5.4, Nos were the same as in Table 1. Values from left to right represented the results of low, medium and high spiked levels. y: peak area ratio of the quantitative ions of analytes to the internal standard; x: mass concentration, μg / L. 2.5 线性关系检出限和定量限在优化的色谱质谱条件下, 对 6 个水平的系列混合标准工作溶液 (2 ~ 200 μg / L) 进行测定 81 种 GCs 均以其定量离子对与相应同位素内标峰面积的比值为纵坐标 (y) 对应的质量浓度为横坐标 (x, μg / L) 绘制标准曲线, 获得回归方程, 线性相关系数为 ~ , 表明待测物在各自的线性范围内呈良好的线性关系取空白样品, 添加一定浓度的混合标准溶液, 以 S / N 3 和 S / N 10 确定 81 种待测物的 LOD 和 LOQ 分别为 ~ μg / g 和 ~ μg / g( 见表 2) 2.6 回收率和精密度取适量空白膏霜化妆品, 在低中高 3 个添加水平 ( 和 0 20 μg / g) 下进行加标回收试验, 每个水平平行测定 6 次, 计算每个待测物的平均回收率和 RSD( 见表 2) 结果显示, 方法的平均回收率为 68 8% ~105 3%, RSD 为 2 9% ~13 1% (n = 6) 2.7 实际样品测定应用本法筛查了客户委托送检的 137 个化妆品样品, 发现阳性样品 16 个, 检出率为 11 7%, 3 个阳性样品被检出包含两种以上的 GCs 检出的化合物分别为 DN ( 6 个 ) FCAN ( 5 个 ) DF ( 3 个 ) CLBP(2 个 ) DM ( 1 个 ) TAN ( 1 个 ) TANA ( 1 个 ) BMV (1 个 ) 和 HPL(1 个 ), 含量介于 16 9 ~ 158 μg / g 之间, 其中化合物 DN DF 和 HPL 均不在 [11,12] 法定检测方法的监测名单中典型阴性和阳性样品的基峰色谱图见图 2 结果表明, 非法添加法定检测方法监测名单之外 GCs 的现象已相当普遍, 而使用本法能准确可靠地发现非法添加物, 可显著提高化妆品安全风险的监控水平图 2 典型 (a) 阴性和 (b) 阳性样品中 GCs 的基峰色谱图 Fig. 2 BPCs of the GCs in typical (a) negative and ( b) positive samples The numbers in Fig. 2 were the same as in Table 1. 3 结论本研究建立了 d SPE LC MS / MS 同时快速测定化妆品中 81 种 GCs 的分析方法本文采用具有多重色谱保留机制的 PFP 色谱柱, 实现了 10 组同分异构体的基线分离与现有方法相比, 该法样品前处理更为简便高效经济, 色谱分离效果更好采用同位素内标法校正, 定量更加准确可靠, 是目前可同时快速测定化妆品中 GCs 种类最全的高通量方法, 适用于化妆水乳液膏霜粉剂等类型的化妆品中非法添加 GCs 的快速定性筛查和准确定量

10 第 8 期罗辉泰, 等 : 分散固相萃取液相色谱串联质谱法同时快速测定化妆品中 81 种糖皮质激素 825 参考文献 : [1] Becker D E. Anesth Prog, 2013, 60(1): 25 [2] Schacke H, Docke W D, Asadullah K. Pharmacol Ther, 2002, 96(1): 23 [3] China Food and Drug Administration. Safety and Technical Standards for Cosmetics ( 2015 Edition ). ( ) [ ]. / directory / web / WS01 / images / MjAxNcTqtdoyNji6xbmruOa4vbz+LnBkZg = =.pdf 国家食品药品监督管理局. 化妆品安全技术规范 (2015 年版 ). ( ) [ ]. http: // www. sda. gov. cn / direc tory / web / WS01 / images / MjAxNcTqtdoyNji6xbmruOa4vbz+ LnBkZg = =.pdf [4] EC No / 2009 [5] Association of Southeast Asian Nations ( ASEAN) Cosmetics Regulation. General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People s Republic of China, transl. Beijing: China Metrology Press, 2010 东盟化妆品法规. 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 译. 北京 : 中国计量出版社, 2010 [6] Japan Cosmetics Regulation. General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the Peo ple s Republic of China, transl. Beijing: China Metrology Press, 2011 日本化妆品法规. 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 译, 北京 : 中国计量出版社, 2011 [7] Korea Cosmetics Regulation. General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the Peo ple s Republic of China, transl. Beijing: Standards Press of China, 2013 韩国化妆品法规. 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 译. 北京 : 中国标准出版社, 2013 [8] China Food and Drug Administration. Bulletin on the 50 Bat ches of Unqualified Facial Mask Cosmetics (No 140 in 2016) by China Food and Drug Administration. ( ) [ ]. / WS01 / CL1753/ html 国家食品药品监督管理总局. 关于 50 批次面膜类化妆品不合格的通告 ( 2016 年第 140 号 ). ( ) [ ]. http: // / WS01 / CL1753 / html [9] China Food and Drug Administration. Bulletin on the 60 Bat ches of Unqualified Anti Freckle Cosmetics ( No. 170 in 2016) by China Food and Drug Administration. ( ) [ ]. http: // www. sda. gov. cn / WS01 / CL1753 / html 国家食品药品监督管理总局. 总局关于 60 批次祛斑类化妆品不合格的通告 ( 2016 年第 170 号 ). ( ) [ ]. http: // / WS01 / CL1753 / html [10] China Food and Drug Administration. Bulletin on the Unqualified Cosmetics ( 1st Issue in 2017) by Guangdong Food and Drug Administration. ( ) [ ]. http: // / WS01 / CL1754 / html 国家食品药品监督管理总局. 广东省食品药品监督管理局不合格化妆品通告 (2017 年第 1 期 ). ( ) [ ]. http: // / WS01 / CL1754 / html [11] GB / T [12] China Food and Drug Administration. Bulletin on the Release of the Method for Determination Fluocinolone Ace tonide in Facial Mask Cosmetics (No.88 in 2016) by China Food and Drug Administration. ( ) [ ]. http: // / WS01 / CL0087 / html 国家食品药品监督管理总局. 总局关于发布面膜类化妆品中氟轻松检测方法的通告 ( 2016 年第 88 号 ). ( ) [ ]. http: // www. sda. gov. cn/ WS01/ CL0087/ html [13] Gaudiano M C, Lucente D, Antoniella E, et al. J Pharm Biomed Anal, 2010, 53(2): 158 [14] Luo H T, Huang X L, Wu H Q, et al. Journal of Instrumen tal Analysis, 2016, 35(2): 119 罗辉泰, 黄晓兰, 吴惠勤, 等. 分析测试学报, 2016, 35(2): 119 [15] Golubovic J B, Otasevic B M, Protic A D, et al. Rapid Commun Mass Spectrom, 2015, 29(24): 2319 [16] Panusa A, Ottaviani M, Picardo M, et al. Analyst, 2004, 129(8): 719 [17] Li Q, Zhang X G, Ma J M, et al. Journal of Instrumental Analysis, 2016, 35(2): 179 李强, 张晓光, 马俊美, 等. 分析测试学报, 2016, 35( 2): 179 [18] Li Z Y, Wang F M, Niu Z Y, et al. Chinese Journal of Chro matography, 2014, 32(5): 477 李兆永, 王凤美, 牛增元, 等. 色谱, 2014, 32(5): 477 [19] Zhang W. J Fluorine Chem, 2008, 129(10): 910 [20] Taylor P J. Clin Biochem, 2005, 38(4): 328

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.