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1 2018 年 4 月 Vol.36 No.4 April 2018 Chinese Journal of Chromatography 356 ~ 361 研究论文 DOI: / SP.J 全自动固相萃取超高效液相色谱串联质谱法测定婴幼儿湿疹类产品中 42 种糖皮质激素潘小红, 殷帅, 刘玉玲, 龙凌云, 赵薇, 孟庆玉 ( 湖南省食品药品检验研究院, 湖南长沙 ) 摘要 : 建立了全自动固相萃取超高效液相色谱串联质谱检测婴幼儿湿疹类产品中 42 种糖皮质激素的方法样品用饱和氯化钠溶液分散后加乙腈涡旋提取, 经亚铁氰化钾和醋酸锌沉淀大分子基质, 然后用 HLB 固相萃取柱净化, 待测液用 Dikma Endeavorsil TM C18 色谱柱 (100 mm 2 1 mm, 1 7 μm) 分离, 以 0 1% (v / v) 甲酸水溶液乙腈为流动相进行梯度洗脱在电喷雾正离子模式下以动态多反应监测方式测定, 外标法定量 42 种待测物在各自的范围内呈良好的线性关系, 相关系数均大于 0 998; 在 3 个添加水平下,42 种待测物的平均回收率为 78 7% ~ 101 5%, RSD 为 2 0% ~ 8 8% (n = 6); 方法的检出限 ( LOD, S / N 3) 和定量限 ( LOQ, S / N 10) 分别为 ~ mg / kg 和 ~ mg / kg 该法简便快速, 灵敏可靠, 适用于婴幼儿湿疹类产品糖皮质激素的检测关键词 : 超高效液相色谱串联质谱 ; 自动固相萃取 ; 糖皮质激素 ; 婴幼儿湿疹产品中图分类号 :O658 文献标识码 :A 文章编号 : (2018) Determination of 42 glucocorticoids in infant eczema products by auto solid phase extraction ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry PAN Xiaohong, YIN Shuai, LIU Yuling, LONG Lingyun, ZHAO Wei, MENG Qingyu (Hunan Institute for Food and Drug Control, Changsha , China) Abstract: A method was developed for the determination of 42 glucocorticoids in infant eczema products by auto solid phase extraction high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry ( ASPE UHPLC MS / MS). The analytes were extracted by acetonitrile after disper sing in saturated sodium chloride solution. Macromolecules matrix were precipitated by adding potassium and zinc acetate, and then purified by HLB SPE column. The chromatographic sepa rations were performed on a DIKMA Endeavorsil TM C18 column (100 mm 2 1 mm, 1 7 μm). Acetonitrile and 0 1% ( v / v) formic acid aqueous solution were used as the mobile phases. Electrospray ionization ( ESI) source was operated in the positive mode using multiple reaction monitoring ( MRM) scanning mode. The results were quantified by external standard method. The correlation coefficients of linear calibration curves were greater than in the corre sponding mass concentration ranges. The average recoveries at three spiked levels ranged from 78 7% to 101 5%, and the relative standard deviations (RSDs) were 2 0% -8 8% (n = 6). The LODs (S / N 3) and LOQs were mg / kg and mg / kg, respectively. The method is simple, rapid, sensitive, and reliable, and can be used for the detection of glucocorticoids in infant eczema products. Key words: ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UHPLC 收稿日期 : 通讯联系人.Tel:(0731) ,E mail: @ qq.com. 基金项目 : 湖南省自然科学基金 (2016JJ6079). Foundation item: Natural Science Foundation of Hunan Province ( No. 2016JJ6079).

2 第 4 期潘小红, 等 : 全自动固相萃取超高效液相色谱串联质谱法测定婴幼儿湿疹类产品中 42 种糖皮质激素 357 MS MS); auto solid phase extraction (ASPE); glucocorticoid; infant eczema products 婴幼儿湿疹, 又称奶癣, 是一种十分常见的过敏性炎症性皮肤病, 多发于头面颈部, 患处瘙痒剧烈, 病情易反复发作 [1], 其中 6 ~ 12 个月婴儿的湿疹发生率约为 75 7%, 且发病率呈逐年上升趋势 [2], 严重影响了患儿的生活质量和健康成长 [3] 另外, 婴幼儿湿疹往往是儿童过敏性 ( 变应性 ) 疾病的早期 [4,5] 表现, 有报道表明大约 80% 的婴儿湿疹患者在其皮肤病症状消退后又发生了呼吸道变态反应, 如哮喘过敏性鼻炎过敏性结膜炎等其他过敏性疾病, 而且湿疹发病的月龄越早, 哮喘的发病年龄越小 [6], 如果继发细菌感染, 还会导致全身的中毒感染, 甚至危及生命 [7] 治疗湿疹的传统方法是外用含激素的霜膏剂, 如含糖皮质激素的霜膏剂 [8], 长期不正确使用或滥用含激素的产品会产生副作用, 如柯兴综合征免疫抑制皮肤干燥及刺痛感等 [9] 化妆品安全技术规范 (2015 版 ) [10] [11] 及欧盟化妆品指令均明确规 [12-15] 定糖皮质激素为禁用物质有文献报道了化妆品中糖皮质激素的测定方法, 现行化妆品中四十一种糖皮质激素的测定 [16] 亦规定了化妆品中糖皮质激素的测定方法, 但这些方法均未针对婴幼儿湿疹产品婴儿皮肤功能不成熟 [17], 更容易产生如湿疹尿布疹特应性皮炎等各种皮肤问题 [18,19], 未知情况下大量使用含糖皮质激素的产品会导致婴儿皮肤产生药物依赖性和反跳性皮炎 [20] 本实验室以市面上卫生许可证为消字号和卫妆准字号的婴幼儿湿疹产品为研究对象, 建立了全自动固相萃取超高效液相色谱串联质谱 ( ASPE UHPLC MS / MS) 测定婴幼儿湿疹膏中 42 种糖皮质激素的检测方法, 以期为婴幼儿湿疹产品中糖皮质激素的检测提供一定的数据支撑 1 实验部分 1.1 仪器试剂与材料 Prominence LC 30A 超高效液相色谱仪 ( 日本岛津公司 ); AB SCIEX Triple Quad TM 5500 质谱仪, 带 ESI 源 ( 美国 Allen Bradley 公司 ); GX 274 ASPEC 全自动固相萃取仪 ( 美国吉尔森公司 ); AUW220D 电子分析天平 ( 日本岛津公司 ); Milli Q 纯水仪 ( 美国 Millipore 公司 ) 42 种糖皮质激素标准品分别购自中国食品药品检定研究院德国 Dr. Ehrenstorfer 公司美国药典委员会和加拿大 TRC 公司, 纯度均大于 97% 甲醇和乙腈 ( 德国 Merck 公司 ); 乙酸锌和亚铁氰化钾 ( 国药集团公司 ); Oasis HLB 固相萃取小柱 ( 60 mg / 3 ml)( 美国 Waters 公司 ) 所用水均为 Milli Q 纯水仪制备的超纯水样品均为市售 1.2 标准溶液的配制分别精密称取上述标准品各 10 mg, 置于 10 ml 容量瓶中, 用甲醇溶解并定容至刻度, 配制质量浓度为 mg / L 的单标准储备液 ; 分别精密移取上述溶液 1 ml, 置于 50 ml 容量瓶中, 用甲醇稀释至刻度, 摇匀, 配制成质量浓度为 20 mg / L 的混合标准储备液 ; 精密吸取一定体积的混合标准储备液, 用 50% ( v / v) 甲醇水溶液配制成质量浓度为 5 ~ μg / L 的系列混合标准溶液 1.3 样品的制备称取试样约 0 2 g( 精确至 0 01 g), 置于 10 ml 具塞塑料离心管中, 加入 3 ml 饱和氯化钠溶液, 于涡旋混合器上混合, 使样品分散, 准确加入 2 ml 乙腈, 充分涡旋提取 2 min, 以 r / min 离心 10 min, 吸出上层清液, 置于另一 50 ml 具塞塑料离心管中, 下层氯化钠溶液用 2 ml 乙腈重复提取一次, 合并两次的乙腈提取液, 加入 30 ml 水, 混匀, 然后加入 0 2 ml 100 g / L 亚铁氰化钾水溶液 ( 称取 115 g 三水合亚铁氰化钾用水溶解定容至 ml), 混匀, 再加入 0 2 ml 200 g / L 乙酸锌水溶液 ( 称取 239 g 二水合乙酸锌用水溶解定容至 ml), 混匀, 用水定容至 40 ml, 以 r / min 离心 10 min, 过滤, 滤液待净化 1.4 样品的净化预先依次用 5 ml 甲醇 10 ml 水依次活化固相萃取小柱, 再用 10 ml 10% ( v / v) 乙腈水溶液清洗小柱, 精密量取 1 3 节滤液 5 0 ml 进行上样, 用 4 ml 甲醇洗脱, 收集洗脱液, 加入 4 ml 超纯水, 经 0 22 μm 有机滤膜过滤, 待上机分析 1.5 色谱条件色谱柱 :Dikma Endeavorsil TM C18 柱 (100 mm 2 1 mm, 1 7 μm ); 柱温 : 30 ; 流速 : 0 25 ml / min; 流动相 A: 0 1% ( v / v) 甲酸水溶液 ; 流动相 B: 乙腈梯度洗脱程序 :0 ~ 3 0 min, 20% B ~ 32% B; 3 0 ~ 12 0 min, 32% B ~ 75% B; 12 0 ~ 14 0

3 358 色谱第 36 卷 min, 75% B; 14 0 ~ 14 5 min, 75% B ~ 95% B; 17 0 ~ 18 0 min, 95% B ~ 20% B; 18 0 ~ 20 0 min, 20% B 进样量 :5 μl 1.6 质谱条件离子源 : 电喷雾电离源, 正离子模式 ( ESI + ); 毛细管电压 :3 kv; 锥孔电压 :30 V; 萃取锥孔电压 :3 V; 聚焦电压 :0 1 V; 脱溶剂温度 :500 ; 鞘气流速 : 500 L / h 42 种糖皮质激素的其他质谱参数见表 1 2 结果与讨论 2.1 超高效液相色谱串联质谱条件的优化根据待测物的性质, 考察了 Dikma Endeavor sil TM C18 ( 100 mm 2 1 mm, 1 7 μm) ACQU ITYTM UPLC HSS T3(50 mm 1 8 mm, 1 7 μm) 表 1 42 种糖皮质激素的质谱参数 Table 1 MS parameters of the 42 glucocorticoids No. Compound Parent ion (m / z) Product ions (m / z) DP / V CE / ev 1 triamcinolone ( 曲安西龙 ) , , 17 2 prednisolone ( 泼尼松龙 ) , , 14 3 hydrocortisone ( 氢化可的松 ) , , 48 4 prednisone ( 泼尼松 ) , , 17 5 cortisone ( 可的松 ) , , 33 6 methylprednisolone ( 甲基泼尼松龙 ) , , 30 7 betamethasone ( 倍他米松 ) , , 32 8 dexamethasone ( 地塞米松 ) , , 30 9 flumethasone ( 氟米松 ) , , beclomethasone ( 倍氯米松 ) , , triamcinolone acetonide ( 曲安奈德 ) , , flurandrenolide ( 氟氢缩松 ) , , triamcinolone diacetate ( 曲安西龙双醋酸酯 ) , , methylprednisolone acetate ( 泼尼松龙醋酸酯 ) , , fluoromethalone ( 氟米龙 ) , , hydrocortisone acetate ( 氢化可的松醋酸酯 ) , , deflazacort ( 地夫可特 ) , , hydrocortisone acetate ( 氟氢可的松醋酸酯 ) , , prednisone acetate ( 泼尼松醋酸酯 ) , , cortisone acetate ( 可的松醋酸酯 ) , , methylprednisolone acetate ( 甲基泼尼松龙醋酸酯 ) , , betamethasone acetate ( 倍他米松醋酸酯 ) , , budesonide ( 布地奈德 ) , , hydrocortisone butyrate ( 氢化可的松丁酸酯 ) , , dexamethasone acetate ( 地塞米松醋酸酯 ) , , fluorometholone acetate ( 氟米龙醋酸酯 ) , , hydrocortisone valerate ( 氢化可的松戊酸酯 ) , , triamcinolone acetonide acetate ( 曲安奈德醋酸酯 ) , , fluocinolone acetonide ( 氟轻松醋酸酯 ) , , diflorasone diacetate ( 二氟拉松双醋酸酯 ) , , betamethasone valerate ( 倍他米松戊酸酯 ) , , prednicarbate ( 泼尼卡酯 ) , , halcinonide ( 哈西奈德 ) , , alclometasone dipropionate ( 阿氯米松双丙酸酯 ) , , amcinonide ( 安西奈德 ) , , clobetasol propionate ( 氯倍他索丙酸酯 ) , , fluticasone propionate ( 氟替卡松丙酸酯 ) , , mometasone furoate ( 莫米他松糠酸酯 ) , , betamethasone dipropionate ( 他米松双丙酸酯 ) , , beclomethasone double acrylate ( 倍氯米松双丙酸酯 ) , , clobetasone butyrate ( 氯倍他松丁酸酯 ) , , fluocinolone ( 氟轻松 ) , , 53 DP: declustering potential; CE: collision energy; quantitative ion.

4 第 4 期潘小红, 等 : 全自动固相萃取超高效液相色谱串联质谱法测定婴幼儿湿疹类产品中 42 种糖皮质激素 359 Agilent EC C18 ( 150 mm 2 1 mm, 2 7 μm ) Halo TM C18(100 mm 2 1 mm, 2 7 μm) 和 ACQU ITYTM UPLC BEH C18 ( 100 mm 2 1 mm, 1 7 μm)5 种色谱柱的分离效果 ; 比较了水乙腈水甲醇 0 1% (v / v) 甲酸水溶液甲醇 0 1% ( v / v) 甲酸水溶液乙腈 4 种流动相对分离效果的影响结果表明, 采用 1 7 μm Dikma Endeavorsil TM C18 柱, 以 0 1% (v / v) 甲酸水溶液乙腈为流动相进行梯度洗脱时 42 种糖皮质激素的响应值和峰形均较好, 可获得较好的峰形和分离在电喷雾离子源下, 采用正离子和负离子模式分别对质量浓度为 400 μg / L 的 42 种糖皮质激素混合标准溶液进行全扫描分析发现 42 种糖皮质激素均在正离子模式下获得 [M+H] + 母离子在此基础上, 分别优化各糖皮质激素的锥孔电压及碰撞能量, 使其母离子子离子的响应值达到最大, 选取待测物质谱响应最佳的两对离子对及其他质谱参数, 优化后的质谱条件见表 1 42 种糖皮质激素在优化后的色谱质谱条件下分离效果较好, 灵敏度较高 42 种糖皮质激素混合标准溶液 (400 μg / L) 的总离子流色谱图见图提取条件的优化在高效液相色谱串联质谱分析中, 基质效应会对分析方法的灵敏度精密度以及准确度造成影响, 改进前处理方法纯化样品是消除基质干扰的有效手段 [21] 本实验比较了以水饱和氯化钠为分散图 1 42 种糖皮质激素混合标准溶液 (400 μg / L) 的总离子流色谱图 Fig. 1 Total ion current ( TIC) chromatogram of the 42 glucocorticoid in a mixed standard solution (400 μg / L) 剂, 以乙腈甲醇为提取剂和洗脱液时,42 种糖皮质激素的回收率结果表明, 以饱和氯化钠为分散剂, 以甲醇为洗脱液时,42 种糖皮质激素的回收率最高 ; 另外, 以乙腈为提取剂时比甲醇更利于分层, 不易乳化因此本实验采用以饱和氯化钠为分散剂, 乙腈为提取剂, 甲醇为洗脱液 2.3 标准曲线和线性范围配制 42 种糖皮质激素的系列混合标准溶液, 以响应值为纵坐标 (y) 相应的质量浓度为横坐标 (x, μg / L) 绘制标准曲线结果表明,42 种糖皮质激素在 5 ~ μg / L 的范围内线性关系良好, 相关系数 (r) 均大于 0 998, 结果见表 2 表 2 42 种糖皮质激素的线性方程相关系数回收率精密度和检出限 Table 2 Linear equations, correlation coefficients ( r), recoveries, precisions, limits of detection ( LODs) and limits of quantification ( LOQs) of the 42 glucocorticoids No. Compound Linear equation r Recovery RSD LOD / LOQ / 1 triamcinolone y = x prednisolone y = x hydrocortisone y = x prednisone y = x cortisone y = x methylprednisolone y = x betamethasone y = x dexamethasone y = x flumethasone y = x beclomethasone y = x triamcinolone acetonide y = x flurandrenolide y = x triamcinolone diacetate y = x methylprednisolone acetate y = x fluoromethalone y = x hydrocortisone acetate y = x

5 360 色谱第 36 卷表 2 ( 续 ) Table 2 ( Continued) No. Compound Linear equation r Recovery RSD LOD / LOQ / 17 deflazacort y = x hydrocortisone acetate y = x prednisone acetate y = x cortisone acetate y = x methylprednisolone acetate y = x betamethasone acetate y = x budesonide y = x hydrocortisone butyrate y = x dexamethasone acetate y = x fluorometholone acetate y = x hydrocortisone valerate y = x triamcinolone acetonide acetate y = x fluocinolone acetonide y = x diflorasone diacetate y = x betamethasone valerate y = x prednicarbate y = x halcinonide y = x alclometasone dipropionate y = x amcinonide y = x clobetasol propionate y = x fluticasone propionate y = x mometasone furoate y = x betamethasone dipropionate y = x beclomethasone double acrylate y = x clobetasone butyrate y = x fluocinolone y = x y: peak area; x: mass concentration, μg / L. 2.4 检出限和定量限用 50% (v / v) 甲醇水溶液逐步稀释 42 种糖皮质激素的混合标准品溶液, 在 1 5 节和 1 6 节条件下进行测定, 以大于 3 倍和 10 倍信噪比时对应的质量浓度计算检出限 ( LOD) 和定量限 ( LOQ) 42 种糖皮质激素的 LOD 均小于 0 03 mg / kg, LOQ 均小于 0 1 mg / kg 2.5 回收率和精密度精密称取试样 0 2 g, 分别加入质量浓度为 20 mg / L 的 42 种糖皮质激素混合标准溶液 ml, 每个添加水平重复测定 6 次, 其加标回收率为 78 7% ~ 101 5%, RSD 为 2 0% ~ 8 8% ( 见表 2), 表明方法具有良好的准确度和精密度 2.6 实际样品分析根据建立的方法, 对市面上声称纯草本用于婴幼儿湿疹护理的 5 批 ( 包括 2 批卫生许可证的卫妆准字号和 3 批消准字号 ) 样品进行 42 种糖皮质激素的测定结果表明,2 批样品中检出醋酸泼尼松, 含量分别为 675 mg / kg 和 844 mg / kg; 1 批样品中检出地塞米松醋酸酯和氟米松, 含量分别为 264 mg / kg 和 1 2 mg / kg 3 结论本实验建立了全自动固相萃取超高效液相色谱串联质谱测定婴幼儿湿疹膏中 42 种糖皮质激素的方法, 实现了样品分析的快速性和高效性, 可满足婴幼儿湿疹膏中糖皮质激素的测定该法为以中草药为主要原料的治疗婴幼儿湿疹类产品的检测及监管提供了技术支撑参考文献 : [1] Wu G R, Liang Q S, Xu F B, et al. China Medical Engineer ing, 2012, 20(5): 14 吴谷茸, 梁庆生, 徐冯波, 等. 中国医学工程, 2012, 20(5): 14 [2] Wahn U. Allergy, 2000, 55: 591 [3] Halken S, Host A. Allergy, 2000, 55: 793 [4] Wen Z M. Diagnosis and Treatment of Allergic Diseases ( from Infant to Adult). Beijing: Chinese Medical Science and Technology Press, 1998: 249

6 第 4 期潘小红, 等 : 全自动固相萃取超高效液相色谱串联质谱法测定婴幼儿湿疹类产品中 42 种糖皮质激素 361 文昭明. 变态反应疾病的诊治 ( 从婴儿到成人 ). 北京 : 中国医药科技出版社, 1998: 249 [5] Meng M L, Bin B P. Clinical Journal of Chinese Medicine, 2011, 3(1): 55 蒙美禄, 宾博平. 中医临床研究, 2011, 3(1): 55 [6] Dai J X, Bao Y X, Han L S. Infantile Asthma. Shanghai: Shanghai Science and Technology Education Press, 2006: 11 戴家熊, 鲍一笑, 韩连书. 婴儿哮喘. 上海 : 上海科技教育出版社, 2006: 11 [7] Sausenthaler S, Rzehak P, Chen C M, et al. J Investig Aller gol Clin Immunol, 2009, 19(6): 481 [8] Zhang C. Journal of Community Medicine, 2013, 11(6): 54 张翠. 社区医学杂志, 2013, 11(6): 54 [9] Yan H Y. Capital Medicine, 2010(8): 16 鄢红瑜. 首都医药, 2010(8): 16 [10] China Food and Drug Administration. No. 268 Bulletin of China Food and Drug Administration on Safety and Techni cal Standards for Cosmetics ( 2015 Edition). ( ) [ ]. http: // www. sda. gov. cn / WS01 / CL0087 / html 国家食品药品监督管理总局. 国家食品药品监督管理总局关于发布化妆品安全技术规范 (2015 年版 ) 的公告 ( 2015 年第 268 号 ). ( ) [ ]. http: // cn / WS01 / CL0087 / html [11] 76 / 768 / EEC [12] Wang W P, Zhang M Y, Lin J, et al. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2013, 33(5): 837 王伟萍, 张明玥, 蔺娟, 等. 药物分析杂志, 2013, 33( 5): 837 [13] Li Q, Zhang X G, Ma J M, et al. Journal of Instrumental Analysis, 2016, 35(2): 179 李强, 张晓光, 马俊美, 等. 分析测试学报, 2016, 35( 2): 179 [14] Luo H T, Huang X L, Wu H Q, et al. Journal of Instrumen tal Analysis, 2016, 35(2): 119 罗辉泰, 黄晓兰, 吴惠勤, 等. 分析测试学报, 2016, 35(2): 119 [15] Luo H T, Huang X L, Wu H Q, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2017, 35(8): 816 罗辉泰, 黄晓兰, 吴惠勤, 等. 色谱, 2017, 35(8): 816 [16] GB / T [17] Qiu B Y, Gao Z H. Modern Cosmetics Science and Technol ogy. Beijing: China Light Industry Press, 2016: 2065 邱炳毅, 高志红. 现代化妆品科学与技术. 北京 : 中国轻工业出版社, 2016: 2065 [18] Yu J H. Qinghai Medical Journal, 2012, 42(7): 55 余金华. 青海医药杂志, 2012, 42(7): 55 [19] Gao Y, Lu N, Zhi L L, et al. Chinese Journal Aesthetic Medicine, 2015, 24(3): 77 高莹, 鲁楠, 职蕾蕾, 等. 中国美容医学, 2015, 24(3): 77 [20] Zuo X Y. The Medical Journal of the Present Clinical, 2015, 28(6): 1821 左晓玥. 当代临床医刊, 2015, 28(6): 1821 [21] Xiang P, Shen M, Zhuo X Y. Journal of Instrumental Analy sis, 2009, 28(6): 753 向平, 沈敏, 卓先义. 分析测试学报, 2009, 28(6): 753

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.