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1 第 16 卷第 2 期 2018 年 3 月生物加工过程 Chinese Journal of Bioprocess Engineering Vol 16 No 2 Mar doi: / j issn 多枝状胶体金免疫层析试纸条定量检测猪尿中沙丁胺醇吴雨豪 1, 刘文娟 2, 武燕华 2, 周耀锋 1 1, 熊勇华 (1 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室, 江西南昌 ; 2 江西中德生物工程有限公司, 江西南昌 ) 摘要 : 以 65 nm 多枝状胶体金 ( 金纳米花,AuNFs) 为新型探针, 建立了检测猪尿中沙丁胺醇 (SAL) 的免疫层析新方法采用吸附方法将抗 SAL 单克隆抗体标记在 AuNFs 上制备检测探针, 以牛血清白蛋白 SAL 偶联物及羊抗鼠二抗喷涂在硝酸纤维素膜上形成试纸条检测线 (T 线 ) 和质控线 (C 线 ), 建立了基于 T / C 比值法定量检测猪尿中沙丁胺醇的新方法 AuNFs 免疫层析试纸条检测 SAL 的定量线性范围为 0 05 ~ 1 0 ng / ml( y = ln x , R 2 = 0 995), 半数抑制浓度 (IC 50 ) 为 ng / ml(n = 5), 检测猪尿中 SAL 的最低检测限为 ng / ml 单个样品定量检测时间 12 min 加标回收实验显示, 试纸条批内加标回收率为 % ~ %, 批间加标回收率为 98 86% ~ %, 批内批间实验相对标准偏差 (RSD) 均小于 10% 将 AuNFs 免疫层析试纸条与商业化酶联免疫试剂盒同时检测 50 个 SAL 加标的猪尿样品, 两种方法检测结果具有良好的相关性 (R 2 = 0 955) 关键词 : 多枝状胶体金 ; 免疫层析试纸条 ; 沙丁胺醇 ; 定量检测 ; 食品安全中图分类号 :R155 5 文献标识码 :A 文章编号 : (2018) Multi branched gold nanoparticles based immunochromatographic strip for quantitative detection of salbutamol in swine urine WU Yuhao 1,LIU Wenjun 2,WU Yanhua 2,ZHOU Yaofeng 1,XIONG Yonghua 1 (1. State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang ,China; 2. Jiangxi Zodolabs Biotechnology Co.,Ltd,Nanchang ,China) Abstract:Multi branched gold nanoflowers( AuNFs) with average size of 65 nm were use as the probes to construct a novel immunochromatographic strip for quantitative detection of salbutamol( SAL) in swine urine.anti SAL monoclonal antibodies were used to label AuNFs through physical adsorption. SAL BSA and anti mouse IgG were sprayed on nitrocellulose membrane as test line and control line,respectively. The T / C ratio based quantitative method was developed for SAL detection after 12 min running strip time. The AuNFs based strip showed a good dynamic linear range from 0 05 to 1 0 ng / ml with half maximal inhibitory concentration at ng / ml( n = 5). The regression equation for SAL quantitative detection can be presented as y = -21 4ln x (R 2 = 0 995).The average recoveries of intra and inter assays ranged from 98 86% to % with the relative standard deviation less than of 10%. The proposed AuNFs based strip and commercial SAL ELISA kit were used to detect 50 of SAL spiked swine urine samples.the two methods have a good agreement (R 2 = 0 955). 收稿日期 : 修回日期 : 基金项目 : 国家重点基础研究发展计划 (973 计划 )(2013CB127804) 作者简介 : 吴雨豪 (1996 ), 男, 江西新余人, 本科生, 研究方向 : 食品质量与安全控制 ; 熊勇华 ( 联系人 ), 研究员,E mail:yhxiongchen@ 163.com 引文格式 : 吴雨豪, 刘文娟, 武燕华, 等. 多枝状胶体金免疫层析试纸条定量检测猪尿中沙丁胺醇 [J]. 生物加工过程,2018,16(2): WU Yuhao,LIU Wenjun,WU Yanhua,et al.multi branched gold nanoparticles based immunochromatographic strip for quantitative detection of salbutamol in swine urine[ J].Chin J Bioprocess Eng,2018,16(2):74-79.

2 第 2 期吴雨豪等 : 多枝状胶体金免疫层析试纸条定量检测猪尿中沙丁胺醇 75 Keywords: multi branched gold nanoflowers; immunochromatographic strip; salbutamol; quantitative detection;food safety 沙丁胺醇 (salbutamol,sal) 是一种人工合成的肾上 β 受体激动剂, 可加速动物生长改善脂肪型动物肉与脂肪的比例 [1-3], 因此常被用作盐酸克伦特罗的替代品添加于动物饲料中 [4-6] 沙丁胺醇在动物体内的残留具有与盐酸克伦特罗相同的危害性 [7-9] 人食用含有沙丁胺醇的动物组织后会出现肌肉颤动肌痛头痛甚至恶心及呕吐等中毒症状 [10-13] 目前, 世界上许多国家禁止使用沙丁胺醇作为饲料添加剂, 并且建立了严格的饲料和家畜尿血和肝中沙丁胺醇监控方法 [14-15] 沙丁胺醇常用的检测方法包括仪器确证法以及免疫学筛查法两大类 [16], 仪器法因需借助昂贵的仪器设备以及熟练的操作人员, 因此在基层单位的使用受到极大的限制 [17], 而以胶体金为标记探针的免疫层析试纸条方法因具有检测速度快操作简单价格便宜及适合现场检测等优势, 在基层单位得到了广泛推广和应用 [18] 但是现有的胶体金免疫层析试纸条检测沙丁胺醇的灵敏度通常介于 3 ~ 5 ng / ml, 且无法实现定量检测, 因此无法满足国家限量标准的要求 [19] 提高标记探针的检测灵敏度是提高免疫层析方法检测灵敏度的一种常用手段, 现有胶体金免疫层析试纸条通常采用 20 ~ 40 nm 球状胶体金为显色探针 [20] 多枝状的胶体金 ( 金纳米花 ) 由于表面等离子体共振效应, 在相同的粒径下具有比球形胶体金更高的摩尔消光系数 [21] ; 同时, 本实验室成员前期研究发现大粒径胶体金可有效地提高竞争免疫层析方法的检测灵敏度 [22] 因此, 本实验中, 笔者采用种子生长法合成了粒径为 65 nm 的多枝状胶体金 ( 金纳米花,AuNFs), 并以此为新型探针来建立检测猪尿样中沙丁胺醇的免疫层析试纸条新方法, 以期达到快速定量检测沙丁胺醇的目的 1 材料与方法 1 1 仪器与试剂 XYZ3000 型点膜仪自动切条仪, 金标生物科技公司 ; 电热恒温鼓风干燥箱紫外可见光分光光度计, 上海福玛实验设备有限公司 ;JEOL JEM 2100 型高分辨率透射电镜, 日本电子株式会社硝酸纤维素膜 (NC 膜 ) 样品垫吸水纸及 PVC 底板, 美国 Millipore 公司 ; 金标探针复溶液 SAL 标准品鼠抗 SAL 单克隆抗体 BSA SAL 检测抗原羊抗鼠二抗沙丁胺醇 ELISA 试剂盒, 中德无锡伯尔生物技术有限公司 ; 牛血清白蛋白 PEG20000 柠檬酸三钠对苯二酚氯金酸,Sigma 公司 1 2 胶体金种子溶液的制备金种子的合成参照文献 [23] 报道的方法实施将 100 ml 氯金酸溶液 (0 1 mg / ml) 加热至沸腾, 在快速搅拌的条件下迅速加入 2 7 ml 柠檬酸三钠溶液 (10 mg / ml), 继续加热搅拌 10 min 后, 室温下冷却即可获得酒红色的金种子溶液 1 3 AuNFs 的合成 AuNFs 采用对苯二酚还原法合成 [24], 具体步骤如下 : 将 100 ml 超纯水加热至 50, 然后依次加入 2 67 ml 金种子溶液, 1 2 ml 氯金酸溶液 ( 10 mg / ml) 以及 2 64 ml 柠檬酸三钠溶液 ( 10 mg / ml), 温度维持在 50, 然后迅速加入 24 ml 对苯二酚缓冲液 (30 mmol / L), 溶液搅拌冷却至室温 4 000g 离心 AuNFs 溶液 15 min, 弃上清, 沉淀重悬于 100 ml 柠檬酸三钠 (0 2 mg / ml) 溶液, 并置于 4 保存备用 1 4 AuNFs 探针 (AuNF Abs) 的制备取 5 ml AuNFs 溶液于洁净小烧杯中, 置于磁力搅拌器缓慢匀速搅拌,0 1 mol / L K 2 CO 3 调节溶液 ph 至 6 5, 加入鼠抗 SAL 单克隆抗体, 室温搅拌反应 60 min 后加入 500 μl PEG20000 溶液 ( 10 mg / ml) 反应 30 min, 然后加入 500 μl BSA 溶液 (100 mg / ml) 继续反应 30 min 标记了抗体的 AuNFs 探针,5 000g 离心 15 min, 沉淀用 1 ml 复溶液重悬,4 保存待用 1 5 制备 AuNFs 试纸条及试纸条免疫动力学分析将 BSA SAL 检测抗原 (0 8 mg / ml) 和羊抗鼠二抗 (1 5 mg / ml) 分别喷涂于 NC 膜上为试纸条检测线 (T 线 ) 与质控线 (C 线 ), 并置于 37 恒温干燥 12 h 将预处理好的 NC 膜样品垫以及吸水纸依次整齐粘贴在 PVC 底板上, 切成 4 mm 宽的试纸条, 装入自封袋, 并放置于干燥箱中保存待用将含 SAL 质量浓度分别为以及 0 5 ng / ml 的猪尿样品 98 μl 与 2 μl AuNF Abs 孵育 5 min, 然后分别加至试纸条加样孔, 胶体金读卡仪每隔 30 s 读取试纸

76 生物加工过程第 16 卷条 T / C 比值 (T 线与 C 线荧光强度比值 ), 连续监控 25 min, 每个浓度重复 3 次试验以反应时间为横坐标,T / C 比值为纵坐标绘制试纸条免疫动力学曲线, 确定试纸条定量检测的最佳时间 1 6 定量检测 SAL 的标准曲线将 SAL 标准品分别添加至经液相色谱质谱 (LC MS) 方法确定为 SAL 阴性的猪尿样品中, 配制 SAL

3 76 生物加工过程第 16 卷条 T / C 比值 (T 线与 C 线荧光强度比值 ), 连续监控 25 min, 每个浓度重复 3 次试验以反应时间为横坐标,T / C 比值为纵坐标绘制试纸条免疫动力学曲线, 确定试纸条定量检测的最佳时间 1 6 定量检测 SAL 的标准曲线将 SAL 标准品分别添加至经液相色谱质谱 (LC MS) 方法确定为 SAL 阴性的猪尿样品中, 配制 SAL 质量浓度为 0 ~ 3 ng / ml 的 SAL 标准溶液取以上 SAL 标准溶液 98 μl 与 2 μl AuNFs 探针混合孵育 5 min, 加入试纸条点样孔, 室温反应 12 min 胶体金试纸条读取仪读取试纸条 T / C 比值, 每个标准溶液重复检测 3 次当 SAL 浓度为 0 时, 试纸条 T / C 比值定义为 B 0, 以 SAL 浓度对数为横坐标, (B / B 0 ) 100 为纵坐标, 绘制检测猪尿中 SAL 含量的定量标准曲线 1 7 AuNFs 免疫层析试纸条性能评价 AuNFs 免疫层析试纸条检测 SAL 的特异性评价方法如下 : 将加标克伦特罗莱克多巴胺氯丙那林班布特罗妥布特罗溴布特罗喷布特罗特布他林以及马布特罗的猪尿样品 (1 ng / ml),sal 阴性以及阳性 (0 5 ng / ml) 猪尿样品加至试纸条加样孔, 读取仪读取试纸条 T / C 比值以评价 AuNFs 免疫层析试纸条与以上 9 种 SAL 结构类似物的交叉反应率 AuNFs 试纸条检测猪尿中 SAL 的准确性以及精密度通过批内以及批间加标回收实验进行评价, 具体方案如下 : 取 SAL 阴性猪尿样品, 分别添加 SAL 至终质量浓度为以及 0 5 ng / ml, 每个样品重复检测 5 次, 计算 SAL 加标回收率及相对标准偏差 ( RSD), 以评价试纸条的批内稳定性 ; 随后每隔 5 d 连续检测 3 次, 计算加标样品的回收率与相对标准偏差以评价试纸条的批间稳定性图 1 AuNFs 以及 AuNF Abs 紫外吸收图谱 Fig 1 UV vis spectra of AuNFs and AuNF Abs 图 2 AuNFs 透射电镜 Fig 2 TEM image of AuNFs 2 2 AuNFs 免疫层析试纸条定量检测 SAL 的原理图 3 为 AuNFs 试纸条定量检测 SAL 的原理图由图 3 可知 : 当样品中不含 SAL 时,AuNFs Abs 泳动至 NC 膜 T 线区域,AuNFs 表面结合抗体与 T 线抗原结合, 未被结合的 AuNFs 探针进一步被 C 线的二抗捕获, 试纸条 T C 线分别显示蓝色条带 ; 当样品中含有 SAL 时, 标记在 AuNFs 表面的抗 SAL 单克隆抗体首先与样品溶液中 SAL 特异性结合形成免疫复合物, 从而抑制了 AuNFs 探针与 T 线抗原结 2 结果与讨论 2 1 AuNFs 的表征采用金种子生长法合成获得了蓝色的 AuNFs 溶液考察 AuNFs 形态以及 AuNF Abs 紫外吸收图谱, 结果见图 1~2 由图 1~ 2 可知 : 金纳米颗粒表面形貌呈现明显的多枝状分布, 但颗粒的粒径分布均匀, 平均粒径为 65 nm 动态光散射结果显示 AuNFs 平均水化粒径为 68 nm 紫外可见光光谱分析表明 AuNFs 溶液等离子共振的最大吸收峰为 612 nm, 而 AuNF Abs 等离子共振吸收峰红移至 620 nm( 图 1), 表明抗体成功地标记至 AuNFs 表面 A 为阳性,B 为阴性图 3 AuNFs 免疫层析试纸条定量检测 SAL 的原理 Fig 3 Schematic diagram of AuNFs based strip for SAL detection

4 第 2 期吴雨豪等 : 多枝状胶体金免疫层析试纸条定量检测猪尿中沙丁胺醇 77 合,T 线颜色变弱, 未被 T 线捕获的 AuNFs Abs 被 C 线区域二抗捕获,C 线颜色增强, 此时试纸条 T / C 比值与溶液 SAL 浓度对数呈反比若试纸条 C 线不显色, 表明试纸条失效 2 3 AuNFs 最佳标记 ph 的优化胶体金溶液的 ph 极大地影响着抗体标记效率以及抗体活性为了获得最佳标记效率以及金标探针最佳活性, 用 0 1 mol / L 的 K 2 CO 3 分别将 AuNFs 溶液 ph 调节至以及 8 0, 然后加入抗体制备 AuNF Abs 探针将获得的 AuNF Abs 与阴性猪尿样品混合, 试纸条检测 AuNF Abs 通过读取仪记录试纸条 T C 线吸光值以及 T / C 比值评价抗体偶联过程中溶液 ph 对抗体偶联效率的影响, 结果见图 4 由图 4 可知 : 当溶液 ph 为 6 5 时, 试纸条 T 线显色最强,T / C 比值亦最高, 因此, 抗体标记 AuNFs 的最佳 ph 为 6 5 图 4 溶液 ph 对抗体标记效率的影响 Fig 4 Effects of solution ph on labeling efficiency of antibodies on the surface of AuNFs 2 4 优化 AuNFs 试纸条制备工艺在试纸条制备过程中, 抗体标记数量 AuNF Abs 用量以及 T 线喷涂 BSA SAL 浓度是影响试纸条检测灵敏度的主要因素为了获得检测 SAL 最高灵敏度, 采用三因素三水平正交试验对以上三因素进行了优化, 其中试纸条 C 线二抗喷涂质量浓度为 1 5 mg / ml, 结果见表 1 由表 1 可知 : 当 T 线喷涂 BSA SAL 偶联物质量浓度为 0 6 mg / ml 抗体标记质量浓度为 2 μg / ml AuNF Abs 用量 0 75 μl 时, 试纸条检测 SAL(0 25 ng / ml) 加标尿样, 竞争抑制率最高 (76 02%), 但该条件下试纸条检测 SAL 阴性尿样 T 线显色偏弱, 吸光值仅为 248 6; 而当 T 线喷涂 BSA SAL 偶联物质量浓度为 0 8 mg / ml 抗体标记质量浓度为 1 25 μg / ml AuNF Abs 用量 2 μl 时 ( 第 8 组 ), 试纸条 T C 线显示明显的蓝色条带, 吸光值分别达到及 418 4, 竞争抑制率亦达到 73 13%, 因此选择该条件为最佳实验条件 2 5 确定 AuNFs 试纸条定量检测 SAL 的判读时间免疫层析试纸条 T C 线的颜色累积是抗原抗体免疫动力学反应的结果试纸条 T 线显色深浅不仅与待测物浓度有关, 而且与检测环境温度试纸条的加工差异以及样品基质效应等均有关, 而 T / C 比值法可有效地消除以上内在因素的干扰, 减少试纸条定量检测误差率为了获得试纸条定量分析最佳时间, 本实验记录了不同 SAL 检测浓度下, 试纸条 T / C 比值与免疫反应时间的动力学变化过程, 以 T / C 比值达到稳定的时间确认为试纸条最佳判定时间, 结果见图 5 由图 5 可知 : 当样品中 SAL 浓度为 0 时, 试纸条 T / C 比值在加样后 12 min 趋于稳定 ; 而当样品中含有 SAL 时, 试纸条 T / C 比值在 5 min 之内即可趋于稳定, 因此 AuNFs 试纸条检测 SAL 的最佳定量时间确定为加样后 12 min 编号表 1 正交试验优化 T 线 BSA SAL 全抗原浓度 AuNFs 探针用量及 AuNFs 抗体标记浓度 ρ(sal BSA) / (mg ml -1 ) Table 1 AuNF Abs 用量 / μl Optimization of the parameters of the AuNF based strip 抗体标记量 / (μg ml -1 ) T 线吸光值 C 线吸光值 T / C 比值竞争抑制率 / % ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 注 : 竞争抑制率是基于 0 25 ng / ml 阳性添加实验所得

5 78 生物加工过程第 16 卷图 5 AuNFs 试纸条检测 SAL 的 T / C 免疫动力学曲线 Fig 5 Kinetic reaction curves of T / C ratio against immunoreaction time based on AuNF based strip for SAL detection 2 6 定量检测 SAL 的标准曲线图 6 为 AuNFs 免疫层析试纸条检测猪尿中 SAL 的标准曲线由图 6 可看出, 随着猪尿中 SAL 浓度的增高, 试纸条 B / B 0 值逐渐降低当 SAL 质量浓度在 0 05 ~ 1 0 ng / ml 时, 试纸条 B / B 0 值与 SAL 浓度对数具有较好的线性关系 ( R 2 = 0 995), 其线性回归方程为 y = -21 4ln x , 半数抑制率浓度 (IC 50 ) 达到 ng / ml(n = 5) 的加标回收率及相对标准偏差 ( RSD) 评价试纸条定量检测 SAL 的准确性与精密度, 结果见表 2 由表 2 可知, 试纸条检测不同浓度 SAL 的批内回收率为 % ~ %, 批间回收率为 98 86% ~ 110 5%,RSD 均小于 10%, 表明 AuNFs 免疫层析试纸条定量检测猪尿中 SAL 具有良好的回收率及准确度为了进一步评价 AuNFs 试纸条的实用性, 用 AuNFs 试纸条检测了 20 份经 LC / MS / MS 确证为 SAL 阴性的猪尿样品,AuNFs 试纸条检测实际猪尿样品的最低检测灵敏度定义为 ng / ml( 检测结果的平均值加上 3 倍的标准偏差 ); 同时将该试纸条与商业化的 ELISA 试剂盒同时检测 50 份猪尿样品中的 SAL 含量, 两种方法检测结果进行相关性评估, 结果见图 8 由图 8 可知,AuNFs 试纸条与商业化的 ELISA 试剂盒检测结果相关性方程为 y = x (R 2 = ), 以上结果表明两种方法具有较好的一致性图 6 AuNFs 试纸条定量检测 SAL 标准曲线 Fig 6 Calibration curve of AuNF based strip for SAL quantitative detection 2 7 AuNFs 试纸条检测性能的评价检测 9 种与沙丁胺醇结构类似的 β 肾上腺素兴奋剂加标尿样 ( 包括克伦特罗莱克多巴胺氯丙那林班布特罗妥布特罗溴布特罗喷布特罗特布他林以及马布特罗 ), 评价 AuNFs 免疫层析试纸条的特异性, 结果见图 7 从图 7 结果可知 : 笔者制备的 AuNFs 免疫层析试纸条与以上 9 种 β 肾上腺素无明显交叉反应, 表明该试纸条具有良好的特异性在不含 SAL 的猪尿样品中添加高 ( 0 5 ng / ml) 中(0 15 ng / ml) 低(0 05 ng / ml) 质量浓度的 SAL,AuNFs 试纸条检测, 以试纸条批间批内 Fig 7 图 7 AuNF 试纸条的特异性评价 Specificity experiment of AuNF based strip 表 2 Table 2 试纸条精密度与稳定性实验结果 Precision and stability of the test strip for SAL spiked samples SAL 添加水平 / (ng 平均水平 / 回收率 / ml -1 ) (ng ml -1 ) % 批内 (n = 5) 批间 (n = 5) RSD / % 平均水平 / 回收率 / RSD / (ng ml -1 ) % % 结论本研究以 65 nmaunfs 为新型探针, 成功地建立了免疫层析法快速定量检测猪尿中 SAL 的新方法, 该方法检测 SAL 的 IC 50 值达到 ng / ml, 检

6 第 2 期吴雨豪等 : 多枝状胶体金免疫层析试纸条定量检测猪尿中沙丁胺醇 79 图 8 AuNFs 试纸条及 ELISA 试剂盒检测猪尿中 SAL 的方法学比较 Fig 8 Methodology comparison of AuNFs based strip ( y axis) and ELISA( x axis) for the detection of 50 SAL spiked swine urine samples 测猪尿样品的最低检测限为 ng / ml 相比于实验室常用的 ELISA 检测方法, 该方法仅需一台便携式读取仪,17 min 内即可实现猪尿中 SAL 的高灵敏定量检测, 且不需复杂的操作以及专业的操作人员, 适于 SAL 的现场快速筛查检测参考文献 : [ 1 ] 栗艳. 瘦肉精的危害及防治 [ J]. 中国畜牧兽医文摘,2011, 27(4):175. [ 2 ] CHAI C,LIU G,LI F,et al.towards the development of a portable sensor based on a molecularly imprinted membrane for the rapid determination of salbutamol in pig urine [ J]. Anal Chim Acta, 2010,675(2): [ 3 ] 王凤美, 何京橙, 张鸿伟, 等. 超高效液相色谱串联质谱法检测动物血浆中克伦特罗莱克多巴胺沙丁胺醇 [ J]. 食品安全质量检测学报,2015,6(12): [ 4 ] 陈新谦, 金有豫, 汤光. 新编药物学 [M].16 版. 北京 : 人民卫生出版社,2007:436. [ 5 ] ADAM A, ONG H, SONDAG D, et al. Radioimmunoassay for albuterol using a monoclonal antibody: application for direct quantification in horse urine[ J]. J Immunoassay,1990,11( 3): [ 6 ] CARTER W J, LYNCH M E. Comparison of the effects of salbutamol and clenbuterol on skeletal muscle mass and carcass composition in senescent rats [ J]. Metabolism, 1994, 43 ( 9 ): [ 7 ] 刘宣兵, 庞玉芳, 侯玉泽, 等. 沙丁胺醇的毒副作用及其残留检测 [J]. 上海畜牧兽医通讯,2008(4): [ 8 ] GABIOLA C,CALONGE GARCÍA M A,PORTILLO M P,et al. Validation of a method for the determination of salbutamol in animal urine by gas chromatography mass spectrometry and its application to treated lamb samples [ J ]. J Microcolumn Sep, 1996,8(5): [ 9 ] 吴时清, 陈茹, 林志雄, 等. 应用竞争酶联免疫吸附技术检测港澳活猪中克伦特罗残留 [ J]. 检验检疫科学,1999,9( 4): [10] 邱阳生, 杨根海, 何方洋.β 兴奋剂沙丁胺醇及其检测技术研究进展 [J]. 动物医学进展,2002,23(4): [11] 毕玉香. 瘦肉精的残留危害及监控对策 [ J]. 畜牧兽医科技信息,2009,4(6):136. [12] 戴华, 袁智能, 黄志强, 等. 饲料中盐酸克伦特罗沙丁胺醇高效液相色谱测定 [J]. 分析测试学报,2003,22(3): [13] 管健, 王立媛, 吴平谷, 等. 同位素作内标气质联机测定动物源食品中 4 种 β2 兴奋剂的含量 [ J]. 中国卫生检验杂志, 2007,17(12): [14] 韩京朋, 吴小平, 邱检萍, 等. 动物尿液中沙丁胺醇残留检测试纸条的研制 [J]. 黑龙江畜牧兽医,2014(4): [15] MAZHARS H R A,CHRYSTYN H.New HPLC assay for urinary salbutamol concentrations in samples collected post inhalation [ J].J Pharm Biomed Anal,2009,50(2): [16] 郭伟, 杨丽君, 时文春, 等. 高效液相色谱串联质谱测定猪肉中 3 种 β 受体激动剂残留量 [ J]. 分析试验室,2010,29(4): [17] YEE K C, LOWE E, JACOBSON G. Determination of albuterol enantiomers in animal tissue matrices by LC MS / MS:application in therapeutic myoanabolic studies[ J].Chromatographia,2011,74 (3 / 4): [18] 吴巧丽, 叶春生. 胶体金免疫层析技术快速检测沙丁胺醇残留 [J]. 现代食品科技,2012(11): [19] 刘冰, 王玲玲, 童贝, 等. 沙丁胺醇免疫层析试纸条的应用研究 [J]. 食品研究与开发,2016,37(18): [20] CUI X, XING Q, XIONG Y, et al. Establishing of a method combined immunomagnetic separation with colloidal gold lateral flow assay and its application in rapid detection of Escherichia coli O157:H7[ J].Chin J Anal Chem,2013,41(12): [21] JI Y, REN M, LI Y, et al. Detection of aflatoxin B 1 with immunochromatographic test strips: enhanced signal sensitivity using gold nanoflowers[ J].Talanta,2015,142: [22] LI J,DUAN H,XU P,et al.effect of different sized spherical gold nanoparticles grown layer by layer on the sensitivity of an immunochromatographic assay [ J ]. RSC Adv, 2016, 6 ( 31 ): [23] LI C, LUO W, XU H, et al. Development of an immunochromatographic assay for rapid and quantitative detection of clenbuterol in swine urine [ J]. Food Control,2013, 34 ( 2): [24] XU P,LI J, HUANG X, et al. Effect of the tip length of multi branched AuNFs on the detection performance of immunochromatographic assays[ J].Anal Methods,2016,8( 16): ( 责任编辑荀志金 )

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.