876 临床与病理杂志, 2017, 37(5) Keywords December 2016, tumor tissues of 265 patients with colorectal carcinoma in our hospital wer

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瑾蝴潘
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1 临床与病理杂志 J Clin Pathol Res 2017, 37(5) doi: /j.issn View this article at: 论著结直肠癌患者 BRAF,KRAS,NRAS 和 PIK3CA 基因突变与其病理特征的关系代云 1, 郑国华 1 2, 李青 (1. 溧阳市人民医院病理科, 江苏溧阳 ;2. 常州市第一人民医院病理科, 江苏常州 ) [ 摘要 ] 目的 : 探讨 265 例结直肠癌患者 BRAF, KRAS, NRAS 和 PIK3CA 基因突变及其病理特征关系方法 : 选取 2014 年 12 月至 2016 年 12 月的 265 例结直肠癌患者肿瘤组织标本进行回顾性分析, 采用 PCR 扩增直接测序法检测 BRAF 基因 (15 外显子 600 密码子 ),KRAS 基因 (12, 13, 61 密码子突变 ),NRAS(2 号与 3 号外显子的 12 密码子 13 密码子与 61 密码子常见的 12 个突变位点 ) 及 PIK3CA( 第 9,20 外显子 ) 基因的突变状态, 分析其与结直肠癌临床病理特征的关系结果 :265 例患者中存在 BRAF 基因突变率为 6.8%(18/265),KRAS 基因突变率为 32.1%(85/265),NRAS 基因突变率为 5.7%(15/265),PIK3CA 基因突变率为 11.3%(30/265) NRAS 基因和 KRAS 基因突变与年龄有关 (P<0.05), 与性别原发部位组织学类型分化程度 TNM 分期区域淋巴结转移远处转移术后复发转移均无关 (P>0.05);BRAF,PIK3CA 基因在原发部位为右半结肠患者中的突变率明显升高 (P<0.05), 但与年龄性别组织学类型分化程度 TNM 分期区域淋巴结转移远处转移术后复发转移均无关 (P>0.05) 结论:NRAS,PIK3CA 基因在中国结直肠癌患者中的突变率较低 KRAS,NRAS 基因突变与年龄相关,BRAF,PIK3CA 基因与肿瘤原发部位相关, 联合检测这些基因的突变情况可以判断疾病的发生发展 [ 关键词 ] 结直肠癌 ;BRAF;KRAS;NRAS;PIK3CA; 基因突变 Relationship between BRAF, KRAS, NRAS, PIK3CA gene mutation and pathological characteristics in patients with colorectal cancer DAI Yun 1, ZHENG Guohua 1, LI Qing 2 (1. Department of Pathology, Liyang People s Hospital, Liyang Jiangsu ; 2. Department of Pathology, First People s Hospital of Changzhou, Changzhou Jiangsu , China) Abstract Objective: To study the relationship between BRAF, KRAS, NRAS and PIK3CA gene mutations and pathological characteristics in 265 patients with colorectal cancer. Methods: From December 2014 to 收稿日期 (Date of reception): 通信作者 (Corresponding author): 李青, liqblk@163.com 基金项目 (Foundation item): 常州市卫生局重大项目 (ZD ) This work was supported by the Changzhou Health Bureau Major Projects, China (ZD ).

2 876 临床与病理杂志, 2017, 37(5) Keywords December 2016, tumor tissues of 265 patients with colorectal carcinoma in our hospital were retrospectively analyzed, BRAF gene (exon 15 codon 600), KRAS (gene mutations of 12,13,61 codon), NRAS (2 and 3 in exon 12 codon 13, codon 61 codons and 12 common mutations) and PIK3CA (exon 9,20) gene mutation status were detected by PCR-direct sequencing, and its relationship with clinical pathological characteristics of colorectal cancer was analyzed. Results: In 265 patients, the BRAF gene mutation rate was 6.8% (100/265), KRAS gene mutation rate was 32.1% (85/265), NRAS gene mutation rate was 5.7% (15/265), PIK3CA gene mutation rate was 11.3% (30/265). NRAS gene and KRAS gene mutation were associated with age (P<0.05), and gender, the primary site, histological type, differentiation degree, TNM staging, lymph node metastasis, distant metastasis, recurrence and metastasis were independent (P>0.05); BRAF, PIK3CA gene in the primary site for right colon in patients with mutation rate increased significantly (P<0.05), while age, gender, histological type, differentiation degree, TNM staging, lymph node metastasis, distant metastasis, recurrence and metastasis were independent (P>0.05). Conclusion: NRAS or PIK3CA has a low level in Chinese rectal cancer patients. KRAS and NRAS gene mutations were correlated with age, whereas BRAF and PIK3CA genes are correlated with the primary tumor site. A combined detection of these genes can define the pathogenesis and development of the disease. colorectal cancer; BRAF; KRAS; NRAS; PIK3CA; gene mutation 结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤, 研 [1-2] 究显示结直肠癌的发生发展与许多分子信号转导通路的调控有密切关系, 可以诱导肿瘤细 [3] 胞增殖侵袭转移以及血管生成研究显示 BRAF,KRAS,NRAS 及 PIK3CA 基因的突变状态与肿瘤的发生发展有一定的关系为了更好地分析 BRAF,KRAS,NRAS 和 PIK3CA 基因突变与结直肠癌的病理特征的关系, 本研究对结直肠癌组织中的 BRAF 基因 (15 外显子 600 密码子 ),KRAS 基因 (12,13,61 密码子突变 ),NRAS 基因 (2 号与 3 号外显子的 12 密码子 13 密码子与 61 密码子常见的 12 个突变位点 ) 及 PIK3CA 基因 ( 第 9,20 外显子 ) 的突变状态以及与结直肠癌的病理特征的关系进行分析, 旨在更好地判断该病的发生发展 1 对象与方法 1.1 对象选取常州市第一人民医院 2014 年 12 月至 2016 年 12 月的 265 例结直肠癌患者肿瘤组织标本进行回顾性分析, 纳入标准 [4] : 1) 经过影像学及病理学检查均符合结直肠癌诊断标准 ;2) 无直肠癌家族病史 ;3) 精神正常, 能配合相应的治疗排除标准 :1) 不符合结直肠癌的诊断标准 ;2) 合并严重的心肺等重要脏器的疾病 ;3) 患者意识不清, 不能正常沟通经过本医院伦理委员会批准其中男 165 例, 女 100 例, 年龄 49~79(52.9±21.2) 岁 ; 其中腺癌 181 例, 黏液腺癌 55 例, 印戒细胞癌 12 例, 鳞状细胞癌 5 例, 未分化癌 12 例 1.2 方法样本的制备将所有患者的肿瘤切除手术的肿瘤组织制作标本, 切取大小为 1 cm 1 cm 1 cm 的组织块, 放置于 80 的冰箱中备用 BRAF,KRAS,NRAS 和 PIK3CA 基因突变的检测采用 PCR 扩增直接测序法进行检测 [5] 使用 BRAF,KRAS,NRAS 和 PIK3CA 基因组 DNA 提取试剂盒 ( 北京宜科思源科技有限公司 ) 提取患者结直肠癌组织基因 DNA, 采用 PCR 扩增直接测序法检测 BRAF,KRAS,NRAS 和 PIK3CA 基因的突变情况, 测序结果按照相应的软件处理, 并与结直肠癌基因库序列对比分析 PCR 反应体系 [6] :10 PCR 缓冲液 2.5 μl,dntp(2.5 mmol/l) 3 μl, 上下游引物 (10 mmol/l) 各 0.8 μl,la Taq 酶 0.1 μl,dna 模板 2 μl, 无菌水 13 μl, 总反应体系为 20 μl PCR 反应条件 :95 变性 5 min;95 25 s,56 退火 40 s, s, 共 46 个循环 ;72 延伸 7 min 目的基因 PCR 引物序列见表统计学处理采用 SPPS 22.0 软件进行统计学, 计数资料采用例 (%) 进行表示, 并采用 χ 2 进行检验,P<0.05 为差异有统计学意义

3 结直肠癌患者 BRAF,KRAS,NRAS 和 PIK3CA 基因突变与其病理特征的关系代云, 等 877 表 1 目的基因 PCR 引物序列 Table 1 PCR primer sequences 基因外显子引物序列片段大小 /bp BRAF Exon15 F:5'-GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG-3' 211 R:5'-CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-3' KRAS Exon12 F:5'-GACGATAGTCATGCCCCGCG-3' 248 R:5'-AATAGAAGGCACAGTCGAGG-3' Exon13 F:5'-GTCTAAAAGCTGCGGAATTGT-3' 222 R:5'-AGTCCAAACTCATCAATGTATCG-3' Exon61 F:5'-GTAGGCGTGTACGGTGGGAGG-3' 284 R:5'-AACGCACACCGGCCTTATTCT-3' NRAS Exon12 F:5'-CCAGCCTCTTGCTGAGTGGAGATG-3' 243 R:5'-AAGCCGACAACCTTGATTGGA G-3' Exon13 F:5'-TGGGAGGTCTATATAAGCAGAG-3' 258 R:5'-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3' Exon61 F:5'-AGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCG-3' 287 R:5'-ACCTACAGGTGGGGTCTTTCATTCCC-3' PIK3CA Exon9 F:5'-AACAGCTCAAAGCAATTTCTACAC-3' 276 R:5'-GGTATGGTAAAAACATGCTGAGA-3' Exon20 F:5'-GACATTGCATACATTCGAAAGAC-3' R:5'-GTTTAATTGTGTGGAAGATCCAA-3' 结果 2.1 BRAF,KRAS,NRAS 和 PIK3CA 基因突变发生情况 265 例患者中存在 BRAF 基因突变率为 6.8%(18/265),KRAS 基因突变率为 32.1%(85/265), NRAS 基因突变率为 5.7%(15/265),PIK3CA 基因突变率为 11.3%(30/265, 表 2) 2.2 BRAF,KRAS,NRAS 和 PIK3CA 基因突变的发生与病理特征的关系 NRAS 基因和 KRAS 基因突变与年龄有关 (P<0.05), 与性别原发部位组织学类型分化程度 TNM 分期区域淋巴结转移远处转移术后复发转移均无关 (P>0.05);BRAF,PIK3CA 基因在原发部位为右半结肠患者中的突变率明显升高 (P<0.05), 但与年龄性别组织学类型分化程度 TNM 分期区域淋巴结转移远处转移术后复发转移均无关 (P>0.05, 表 3) 表例患者发生 BRAF,KRAS,NRAS,PIK3CA 基因突变情况 Table 2 BRAF, KRAS, NRAS, PIK3CA gene mutations in 265 patients 基因发生突变例数突变率 /% BRAF 外显子 600 密码子 18 KRAS 密码子突变密码子突变密码子突变 5 NRAS 密码子突变密码子突变 3 61 密码子突变 2 PIK3CA 外显子突变外显子突变 10

4 878 临床与病理杂志, 2017, 37(5) 表例患者 BRAF, KRAS, NRAS, PIK3CA 基因突变与病理特征的关系 Table 3 Relationship between BRAF, KRAS, NRAS, PIK3CA gene mutations and the pathological characteristics in 265 patients 病理指标 n BRAF/[ 例 (%)] P KRAS/[ 例 (%)] P NRAS/[ 例 (%)] P PIK3CA/[ 例 (%)] P 性别男性 (6.7) 50 (30.0) 10 (6.1) 20 (12.1) 女性 (7.0) 35 (35.0) 5 (5.0) 10 (10.0) 年龄 / 岁 < (7.3) 65 (59.6) 12 (11.0) 10 (9.2) < (6.4) 20 (12.8) 3 (1.9) 20 (12.8) 原发部位左半结肠 (17.1) 26 (31.7) 4 (4.9) 20 (24.4) 右半结肠 89 3 (3.4) 29 (32.5) 5 (5.6) 6 (6.7) 直肠 94 1 (1.1) 30 (31.9) 6 (6.4) 4 (4.3) 组织学类型腺癌 (7.7) 65 (35.9) 12 (6.6) 22 (12.2) 黏液腺癌 55 4 (7.3) 20 (36.4) 3 (5.5) 8 (14.5) 分化程度中高分化 (6.7) 55 (30.6) 10 (5.6) 20 (11.1) 低分化 85 6 (7.1) 30 (35.3) 5 (5.9) 10 (11.8) TNM 分期 I 级 15 1 (6.7) 5 (33.3) 1 (6.7) 2 (13.3) II 级 75 5 (6.7) 20 (26.7) 4 (5.3) 8 (10.7) III 级 85 5 (5.9) 30 (35.3) 5 (5.9) 9 (10.6) IV 级 90 7 (7.8) 30 (33.3) 5 (5.6) 11 (12.2) 远处转移有 (7.0) 35 (35.0) 5 (5.0) 10 (10.0) 无 (6.7) 50 (30.0) 10 (6.1) 20 (12.1) 术后复发转移有 95 6 (6.3) 30 (31.6) 5 (5.3) 10 (10.5) 无 (7.1) 55 (32.4) 10 (5.9) 20 (11.8) 淋巴结转移有 (6.7) 50 (30.0) 10 (6.1) 20 (12.1) 无 (7.0) 35 (35.0) 5 (5.0) 10 (10.0)

5 结直肠癌患者 BRAF,KRAS,NRAS 和 PIK3CA 基因突变与其病理特征的关系代云, 等讨论结直肠癌在发生发展过程中与表皮生长因子受体 (EGFR) 有密切关系, 而 RAS/RAF/MAPK 和 PIK3CA/AKT 是 EGFR 的 2 条下游信号通路, 可以通过 EGFR 与配体的结合进行激活 BRAF,KRAS, NRAS 和 PIK3CA 中任意一个基因发生突变都能够引起 EGFR 的 2 条下游信号通路分别处于持续激活状态, 从而引起结直肠癌的发生发展 [7] BRAF, KRAS,NRAS 都属于 RAS/RAF/MAPK 信号通路, 肿瘤的发生发展与其有密切的关系 [8] KRAS, [9] NRAS 都属于 RAS 家族研究发现 KRAS 基因突变率为 30%~40%,KRAS 基因突变主要发生于第 2 号外显子的第 12,13 密码子和第 3 号外显子的第 59, 61,117 密码子上,KRAS 可能发生的突变还有双突变或者三突变 NRAS 基因突变会导致细胞的恶性增殖和转移, 其在血液肿瘤中存在较高的突变风险,NRAS 基因突变率为 5.7%, 其基因突变率较低 NRAS 基因和 KRAS 基因突变与年龄有关, 高龄患者基因突变率较高 NRAS 基因和 KRAS 基因突变 [10] 与其他病理指标均无关有研究发现 BRAF 能够介导 RAS 与 MAPK 蛋白进行结合, 从而调节肿瘤细胞的增殖分化和凋亡本研究显示 BRAF 基因突变率为 6.8%,BRAF 基因在原发部位为右半结肠患者中的突变率明显升高, 但与年龄性别组织学类型分化程度 TNM 分期区域淋巴结转移远处转移术后复发转移均无关 PIK3CA 基因是 PIK3CA/AKT 信号通路的重要成员,PIK3CA 基因突变率为 11.3%, 其中 9 号与 20 号外显子是发生突变的主要部分,PIK3CA 发生基因突变时会导致结直肠 [10] 癌患者对抗 EGFR 药物不应答, 研究发现 PIK3CA 基因在原发部位为右半结肠患者中的突变率明显升高, 但与其他病理指标均无关直肠癌的发生发展与 BRAF, KRAS, NRAS, PIK3CA 对信号转导通路的调控有密切关 [11] 系 Eklöf 等在结直肠癌组织 KRAS, BRAF 及 PIK3CA 基因突变的检测及其与临床病理特征的关系中研究发现 :KRAS 基因突变与年龄有关, 对这些基因进行联合检测可以判断疾病的情况吴永 [12] 芳等在结直肠癌患者肿瘤组织中 KRAS,NRAS 和 BRAF 基因突变的分子病理检测分析中研究发现 :KRAS, NRAS 和 BRAF 与结直肠癌患者肿瘤发生发展有密切关系, 通过对这些基因进行联合检测可以判断疾病的情况本研究结果显示 : NRAS 基因和 KRAS 基因突变与年龄有关,BRAF, PIK3CA 基因在原发部位为右半结肠患者中的突变率明显升高,NRAS,PIK3CA 基因在中国结直肠癌患者中的突变率较低国内关于 BRAF,KRAS,NRAS 和 PIK3CA 基因在结直肠癌中突变情况及 4 种基因联合检测的报道较少, 本研究创新之处在于为结直肠癌基因检测提供宝贵的循证医学数据综上所述,NRAS,PIK3CA 基因在中国结直肠癌患者中的突变率较低 KRAS,NRAS 基因突变与年龄相关,BRAF,PIK3CA 基因与肿瘤原发部位相关, 联合检测这些基因的突变可以判断结直肠癌的发生发展情况参考文献 1. Cho S, Song IH, Yang HC, et al. Prognostic factors of pulmonary metastasis from colorectal carcinoma[ J]. Interact Cardiovasc Thorac Surg, 2013, 17(2): Rui Y, Wang C, Zhou Z, et al. K-Ras mutation and prognosis of colorectal cancer: a meta-analysis[ J]. Hepatogastroenterology, 2015, 62(137): di Magliano MP, Logsdon CD. Roles for KRAS in pancreatic tumor development and progression[ J]. Gastroenterology, 2013, 144(6): Ahn TS, Jeong D, Son MW, et al. The BRAF mutation is associated with the prognosis in colorectal cancer[ J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2014, 140(11): Demes M, Scheil-Bertram S, Bartsch H, et al. Signature of microsatellite instability, KRAS and BRAF gene mutations in German patients with locally advanced rectal adenocarcinoma before and after neoadjuvant 5-FU radiochemotherapy[ J]. J Gastrointest Oncol, 2013, 4(2): Kadowaki S, Kakuta M, Takahashi S, et al. Prognostic value of KRAS and BRAF mutations in curatively resected colorectal cancer[ J]. World J Gastroenterol, 2015, 21(4): Ouerhani S, Bougatef K, Soltani I, et al. The prevalence and prognostic significance of KRAS mutation in bladder cancer, chronic myeloid leukemia and colorectal cancer[ J]. Mol Biol Rep, 2013, 40(6): Imamura Y, Lochhead P, Yamauchi M, et al. Analyses of clinicopathological, molecular and prognostic associations of KRAS codon 61 and codon 146 mutations in colorectal cancer: cohort study and literature review[ J]. Mol Cancer, 2014, 13(5): Parsons BL, Myers MB. Personalized cancer treatment and the myth of KRAS wild-type colon tumors[j]. Discov Med, 2013, 15(83): Yaeger R, Cowell E, Chou JF, et al. RAS mutations affect pattern of

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戊酸雌二醇片联合宫颈注射利多卡因用于绝经后妇女取环的临床效果评价陆琴芬, 等 371 Keywords groups, no removal difficulties and failure, was statistically s 370 临床与病理杂志 J Clin Pathol Res 2015, 35(3) http://www.lcbl.net doi: 10.3978/j.issn.2095-6959.2015.03.009 View this article at: http://dx.doi.org/10.3978/j.issn.2095-6959.2015.03.009 戊酸雌二醇片联