2017,37(6) 范梦恬等 : 趋化因子受体 CX3CR1 对人肝癌细胞 7721 和 HepG2 的作用及其机制的研究 23 LO2 细胞株由重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室保存备用两种细胞均用含 10% 胎牛血清的 DMEM 高糖完全培养基培养, 置于 37 5%CO 2 的培养

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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2017,37(6):22 30 DOI: /j.cb 趋化因子受体 CX3CR1 对人肝癌细胞 7721 和 HepG2 的作用及其机制的研究范梦恬陈思成郭杨柳李亚孙艳婷李汪施琼 ( 重庆医科大学检验医学院临床诊断教育部重点实验室重庆 ) 摘要目的 : 探究趋化因子受体 CX3CR1(C X3 Cmotifchemokinereceptor1,CX3CR1) 对人肝癌细胞 7721 和 HepG2 增殖迁移和侵袭的影响及其机制方法 : 采用 Q PCR 和 Westernblot 法分别检测人正常肝细胞 LO2 和两种肝癌细胞 (7721 和 HepG2) 中 CX3CR1 的基因表达情况 (mrna 和蛋白质 ); 以过表达 CX3CR1 的质粒转染 7721 细胞, 用抑制 CX3CR1 的干扰 RNA 转染 HepG2 细胞, 通过 Q PCR 和 Westernblot 法检测 CX3CR1 的变化 ; 应用 MTT 和流式细胞实验检测各组细胞的增殖能力 ; 用集落形成实验检测各组细胞的自我更新和增殖能力 ; 借助划痕愈合和 Transwel 检测各组细胞的迁移和侵袭能力 ; 利用 Westernblot 法检测 PI3K/AKT MAPK/ERK 信号通路的激活情况结果 :CX3CR1 在 7721 细胞中 mrna 和蛋白质呈低表达趋势, 而在 HepG2 细胞中则呈高表达趋势 ; 转染过表达 CX3CR1 质粒后 7721 细胞中 CX3CR1 的 mrna 和蛋白水平有明显的升高, 细胞的增殖迁移侵袭能力增强,p AKT 和 p ERK 水平升高 ; 转染干扰 RNA 后 HepG2 细胞中的 CX3CR1 表达水平明显下降, 增殖迁移侵袭能力减弱,p AKT 和 p ERK 水平降低结论 : 趋化因子受体 CX3CR1 可以促进人肝癌细胞增殖迁移和侵袭能力, 该作用可能与 PI3K/AKT MAPK/ERK 信号通路激活有关关键词 CX3CR1 肝癌增殖迁移侵袭中图分类号 Q71 肝癌是我国发病率最高的恶性肿瘤之一尽管目前治疗肝癌有手术放疗化疗等方法, 但是因为原发性肝癌早期症状不明显, 很多患者发现时已到中晚期, 失去了手术治疗机会放疗和化疗的使用又因为毒副作用大而疗效不佳, 也受到了限制 [1] 因此探究肝癌发生发展的机制寻找新的治疗方法就显得尤为重要趋化因子是一类能够吸引白细胞移行到感染部位的一些低分子量的蛋白质, 主要通过与其特定受体结合发挥生物学效应 [2] 趋化因子受体根据其 N 端半胱氨酸的数目和间隔可以分为 C CC CXC CX3C 四类, 其中趋化因子受体 CX3CR1(C X3 Cmotifchemokine receptor1,cx3cr1) 是 CX3C 家族已知的唯一成员, 主收稿日期 : 修回日期 : 国家自然科学基金资助项目 (NSFC ) 通讯作者, 电子信箱 :anniesq8718@aliyu.com 要表达于 T 细胞自然杀伤细胞单核细胞血管内皮细胞表面 [3] 越来越多的研究表明, 趋化因子及其受体在肿瘤的生长侵袭转移等方面发挥着重要的作用已证实 CX3CR1 参与调节肾癌胃癌胰腺癌骨 [4 7] 肉瘤等多种肿瘤的发生发展, 但是关于其在肝癌中的作用及其机制的报道还比较少本研究选择在低表达细胞株中过表达 CX3CR1 和在高表达细胞株中抑制 CX3CR1 两个方面探索 CX3CR1 对人肝癌细胞的增殖迁移和侵袭的影响, 并对其分子机制进行初步的探讨, 为肝癌的治疗和预后判断提供新的依据 1 材料与方法 1.1 细胞培养及分组处理人肝细胞癌 7721 HepG2 细胞株及人正常肝细胞

2 2017,37(6) 范梦恬等 : 趋化因子受体 CX3CR1 对人肝癌细胞 7721 和 HepG2 的作用及其机制的研究 23 LO2 细胞株由重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室保存备用两种细胞均用含 10% 胎牛血清的 DMEM 高糖完全培养基培养, 置于 37 5%CO 2 的培养箱中培养这两种细胞均贴壁生长, 当融合度达 80% 时, 行常规胰酶消化传代 1.2 试剂过表达 CX3CR1 基因的质粒和表达绿色荧光蛋白的空载体质粒均购自上海吉凯基因化学技术有限公司, 干扰 CX3CR1 基因的干扰 RNA 和阴性对照干扰 RNA 均购自广州市锐博生物科技有限公司 DMEM 高糖培养基购自美国 Hyclone 公司胎牛血清购自美国 Gibco 公司 Q PCR 试剂盒和 Q PCR 引物购自日本 TaKaRa 公司 Lipo2000 和 TRIzol 购自美国 Invitrogen 公司 MTT 购自美国 Sigma 公司基质胶购自美国 Corning 公司兔抗人 CX3CR1 单克隆抗体购自美国 Abcam 公司兔抗人 AKT 和 ERK 及磷酸化 ERK (phosphorylated ERK, p ERK), 磷酸化 AKT (phosphorylatedakt,p AKT) 单克隆抗体均购自美国 CelSignalingTechnology 公司鼠抗人 β actin 多克隆抗体购自美国 SantaCruz 公司辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠和山羊抗兔 IgG 均购自北京中杉金桥生物技术有限公司聚偏二氟乙烯 (polyvinylidene difluoride,pvdf) 膜化学发光试剂盒购自美国 Milipore 公司 Transwel 小室购自美国 Corning 公司结晶紫购自温州东升化工公司 1.3 方法质粒转染及实验分组处理首先收集对数生长期的肝癌细胞 7721 HepG2 及正常肝细胞 LO2, 进行 Q PCR 和蛋白质印迹法检测, 以了解 CX3CR1 在这 3 种细胞中的表达情况然后采用质粒转染的方法过表达肝细胞癌 7721 细胞中 CX3CR1 的基因水平 : 选择对数生长期的 7721 细胞, 当细胞融合度达 70% 时将培养基更换为没有血清和抗生素的双无 DMEM 培养基, 通过助转剂 Lipo2000 将过表达 CX3CR1 质粒转染细胞, 4h 后将培养液换为新鲜的完全 DMEM 培养基 ; 同时, 以不转染和转染空载体质粒的 7721 细胞分别作为空白对照和阴性对照, 以排除质粒载体本身对实验的影响感染 24h 和 48h 后, 在荧光显微镜 ( 100) 下观察各组细胞中 GFP 的表达情况, 以此来判断质粒转染程度一般以转染后 24h 表达荧光的细胞百分数在 30% ~50% 为宜, 说明质粒转染成功同时用干扰 RNA 处理 HepG2 细胞 : 选择对数生长期的 HepG2 细胞, 当细胞融合度达 70% 时, 转入干扰 RNA, 以不转染组和转染阴性对照干扰 RNA 作为空白对照和阴性对照 Q PCR 法检测细胞中相关因子的 mrna 表达收集人正常肝细胞 LO2 未转染的人肝癌细胞 7721 转染空载质粒的 7721 细胞和转染过表达 CX3CR1 质粒 48h 的 7721 细胞未转染的人肝癌细胞 HepG2 转染阴性对照干扰 RNA 的 HepG2 细胞和转染干扰 CX3CR1 的干扰 RNA48h 的 HepG2 细胞,TRIzol 法提取各组细胞的 RNA, 两步法逆转成 cdna 后用 Q PCR 法检测各组细胞 CX3CR1 的表达水平,Q PCR 反应体系为 10μl, 反应条件为 :95 30s;95 5s,60 30s,40 个循环 ; 72 30s, 实验重复 3 次引物序列如下 : CX3CR1Forward:CAACAGCAAGAAGCCCAAGAG Reverse:TGAAGAAGAAGGCGGTAGTGAA β actinforward:ccacgaaactaccttcaactcc Reverse:GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT 蛋白质印迹法检测细胞中 CX3CR1 AKT p AKT ERK 和 p ERK 的蛋白表达水平收集人正常肝细胞 LO2 未转染的人肝癌细胞 7721 转染空载质粒的 7721 细胞和转染过表达 CX3CR1 质粒 48h 的 7721 细胞未转染的人肝癌细胞 HepG2 转染阴性对照干扰 RNA 的 HepG2 细胞和转染干扰 CX3CR1 的干扰 RNA48h 的 HepG2 细胞, 提取总蛋白, 加入蛋白上样缓冲液后, 煮沸 10min 至蛋白变性,BCA 法测蛋白浓度, SDS PAGE 分离蛋白, 转移蛋白至 PVDF 膜,5% BSA 37 封闭 2h, 一抗 4 孵育过夜 ( 稀释比例为 :CX3CR ,AKT1 1000,ERK1 1000,p AKT1 1000,p ERK1 1000,β actin1 1000), 洗膜, 二抗 37 孵育 1h ( 稀释比例为 ), 洗膜, 化学发光显影,Quantity one 软件计算出各电泳条带的灰度值, 并与内参 β actin 的灰度值比较, 得出各蛋白的表达水平, 实验重复 3 次 MTT 法检测细胞增殖能力收集对数生长期人肝癌细胞 7721 HepG2, 以 2000 个 / 孔 (20000/ml) 接种于 96 孔板中, 每组设置 5 个平行孔待细胞贴壁后, 在 7721 细胞中转染 CX3CR1 过表达质粒, 在 HepG2 细胞中转染 CX3CR1 干扰 RNA, 此时记为 0d, 每孔加入 10μl 的 MTT(5g/L),37 孵育 4h, 弃去培养基, 每孔加入 150μlDMSO, 轻摇震荡 20min 后, 用酶标仪在 492 nm 波长处检测每组各孔细胞吸光度值, 继续培养细胞, 并依次检测 1d 2d 3d 每组各孔细胞吸光度值, 绘制出细胞增殖曲线, 实验重复 3 次集落形成实验检测细胞自我更新和增殖能力

3 24 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No 收集对数生长期人肝癌细胞 7721 HepG2,500 个 / 孔接种于 6 孔板中, 分别转染 CX3CR1 过表达质粒和干扰 RNA,15d 后弃去各孔培养基, 加入 PBS 清洗 3 遍, 每孔加入 1ml4% 多聚甲醛固定 20min, 弃去多聚甲醛, 每孔加入 1ml 结晶紫染色 30min, 弃去结晶紫, 加入 PBS 清洗 3 遍, 干燥后扫板, 计数大小在 0.3~1mm 之间的集落, 实验重复 3 次流式细胞法检测细胞周期将对数生长期人肝癌 7721 HepG2 细胞接种至 6 孔板中, 细胞密度 50% 时分别转染 CX3CR1 过表达质粒和干扰 RNA,48h 后收集细胞,PBS 清洗 3 遍,70% 乙醇固定, 加入 PI/Triton X 100 染色液, 染色 15min 后, 上流式细胞仪检测细胞周期, 实验重复 3 次划痕实验检测细胞迁移能力将对数生长期的人肝癌细胞 7721 HepG2 接种至 6 孔板中, 细胞密度 80% 时分别转染 CX3CR1 过表达质粒和干扰 RNA,24h 后用 10μl 小枪头行一字划痕, 弃去培养基,PBS 清洗 3 遍, 每孔加入含 2% 血清的 DMEM 培养基, 显微镜下观察并照相, 此时记为 0h, 继续培养 48h 72h 后在同一观察点观察划痕愈合情况并照相, 通过计算多个观察点划痕宽度平均值, 得出各组细胞划痕愈合率划痕愈合率 (%)=(0 划痕宽度 -72h 划痕宽度 )/0h 划痕宽度 100%, 实验重复 3 次 Tanswel 实验检测细胞迁移和侵袭能力将转染过表达质粒 48h 后的人肝癌细胞 7721 HepG2 制成无血清细胞悬液, 将含有个细胞的 400μl 悬液加入上室的小室中 ( 侵袭实验需铺基质胶, 基质胶与 DMEM 培养基按 1 10 比例, 铺 32μl, 细胞密度为 80000/ 孔 ) 下室中加入 700μl 含 10% 血清完全 DMEM 培养基, 每组设置 4 个平行对照,24h 后取出小室, 弃去培养基,PBS 清洗 3 遍, 用棉签轻轻拭去小室膜上未穿膜的细胞,500μl4% 多聚甲醛固定 20min, 弃去多聚甲醛,500μl 结晶紫染色 30min, 弃去结晶紫,PBS 清洗 3 遍, 干燥后于显微镜下计数, 每个小室至少观察 10 个视野, 计数后取平均值, 实验重复 3 次 1.4 统计学处理采用 SPSS16.0 统计学软件对各实验结果进行统计分析各实验均重复 3 次, 结果以均数 ± 标准差表示,2 组间差异比较采用 t 检验 ;3 组或 3 组以上差异比较采用单因素方差分析, 并用 Bonferoni 校正的 t 检验进行组内两两比较以 P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 趋化因子受体 CX3CR1 在人正常肝细胞 LO2 和人肝癌细胞 7721 HepG2 中的表达 Q PCR 和蛋白质印迹法检测结果显示,7721 细胞中 CX3CR1 的 mrna 和蛋白质表达水平与 LO2 细胞无明显差异,HepG2 细胞中 CX3CR1 的 mrna 和蛋白质表达水平较 LO2 细胞明显升高 ( 图 1a) 结果提示, 趋化因子受体 CX3CR1 在正常人肝细胞 LO2 和人肝癌细胞 7721 中表达无明显差异, 均呈低表达, 在 HepG2 细胞中呈高表达趋势 ( 图 1b 图 1c), 可以用于后续的基因过表达实验, 见图 1 图 1 LO2 细胞 HepG2 细胞和 7721 细胞中 CX3CR1 的 mrna 和蛋白质表达水平 Fig.1 TheexpresionofCX3CR1atmRNAand proteinlevelsinthelo2hepg2and7721cels n=3. P<0.01vsLO2 2.2 CX3CR1 过表达质粒和干扰 RNA 在 7721 HepG2 细胞中转染效果验证分别将外源性的阴性对照质粒和过表达 CX3CR1 质粒转染 7721 细胞,24h 后转染效率达 30% 以上 Q PCR 及蛋白质印迹法检测结果显示,7721 和 HepG2 细胞的空白对照组和阴性对照组相比,CX3CR1 的 mrna 和蛋白质表达水平之间差异无统计学意义, 而 7721 细胞中 CX3CR1 过表达质粒转染组较阴性对照组的 CX3CR1mRNA 和蛋白质水平均显著升高 ( 图 2a 图 2bP <0.001),HepG2 细胞中 CX3CR1 干扰 RNA 转染组较阴性对照组的 CX3CR1mRNA 和蛋白质水平均显著降低

4 2017,37(6) 范梦恬等 : 趋化因子受体 CX3CR1 对人肝癌细胞 7721 和 HepG2 的作用及其机制的研究 25 ( 图 2c~ 图 2gP<0.001) 以上结果说明,CX3CR1 过表达质粒和干扰 RNA 转染成功, 可用于下一步的功能研究图 2 CX3CR1 过表达质粒和干扰 RNA 在 7721 HepG2 细胞中转染效果验证 Fig.2 ThemRNAandproteinlevelsofCX3CR1wasdetectedbytransfectingover expresion plasmidinthe7721celsandthesirnainthehepg2 Mean±SD.n=3. P<0.001vsNegativecontrol 2.3 CX3CR1 对 7721 HepG2 细胞增殖能力的影响 MTT 结果显示, 第 0 天时三组细胞的 OD 值无明显差异 ; 第 2 天第 3 天和第 4 天时,7721 和 HepG2 细胞的空白对照组和阴性对照组之间细胞的 OD 值也无明显差异, 但 7721 细胞中过表达 CX3CR1 质粒转染组细胞的 OD 值比阴性对照组明显增加 ( 图 3aP<0.01), HepG2 细胞中 CX3CR1 干扰 RNA 转染组细胞 OD 值比阴性对照组明显降低 ( 图 3bP<0.05) 结果说明, 过表达 CX3CR1 基因可以促进 7721 细胞的增殖, 干扰 CX3CR1 基因可以抑制 HepG2 细胞的增殖

5 26 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No 集落形成实验结果显示,7721 细胞中过表达 CX3CR1 质粒转染组与未转染空白对照组和转染空载体质粒的阴性对照组比较, 集落形成的数目明显增加, ( 图 3c~ 图 3dP<0.001),HepG2 细胞中 CX3CR1 干扰 RNA 转染组较空白对照组和阴性对照组, 集落形成的数目明显降低 ( 图 3e~ 图 3fP <0.01) 结果说明, 过表达 CX3CR1 基因可以促进 7721 细胞的自我更新和增殖, 而干扰 CX3CR1 可以抑制 HepG2 细胞的自我更新和增殖能力图 3 CX3CR1 对 7721 和 HepG2 细胞增殖能力的影响 Fig.3 TheefectsofCX3CR1ontheproliferationabiltyofthe7721andHepG2cels Mean±SD.n=3. P<0.05vsNegativecontrol P<0.01vsNegativecontrol P<001vsNegativecontrol

6 2017,37(6) 范梦恬等 : 趋化因子受体 CX3CR1 对人肝癌细胞 7721 和 HepG2 的作用及其机制的研究 27 流式周期实验结果显示,7721 细胞中过表达 CX3CR1 组与空白对照和阴性对照组比较, 处于 G1 期细胞数明显减少, 处于 S 期细胞数明显增多 ( 图 3g~ 图 3hP<0.05),HepG2 细胞中干扰 CX3CR1 组与空白对照和阴性对照比较, 处于 G1 期细胞数明显增多, 处于 S 期细胞数明显减少 ( 图 3i~ 图 3jP<0.05) 结果说明, 过表达 CX3CR1 基因可以促进 7721 细胞的增殖, 干扰 CX3CR1 基因可以抑制 HepG2 细胞的增殖 2.4 CX3CR1 对 7721 HepG2 细胞迁移和侵袭能力的影响 Transwel 迁移实验结果显示,7721 细胞中未转染空白对照组穿过小室膜的细胞数为 (266±13) 个, 转染空载质粒的阴性对照组为 (267±18) 个, 两组相比较差异无统计学意义 ; 但过表达 CX3CR1 质粒转染组穿过小室膜的细胞数为 (338±11) 个, 较阴性对照组明显增加 ( 图 4a~ 图 4bP<0.01),HepG2 细胞中空白对照组穿膜细胞数为 (311±13) 个, 与阴性对照组 (338±50) 个相比无统计学差异,CX3CR1 干扰 RNA 转染组的细胞穿膜数为 (163±9) 个, 较阴性对照组明显减少 ( 图 4c~ 图 4dP<0.01) Transwel 侵袭实验结果显示,7721 细胞中未转染空白对照组穿过基质胶的细胞数为 (140±9) 个, 转染空载质粒的阴性对照组为 (139±10) 个, 两组相比较差异无统计学意义 ; 但过表达 CX3CR1 质粒转染组穿过基质胶的细胞数为 (230±28) 个, 较阴性对照组明显增加 ( 图 4e~ 图 4fP<0.01),HepG2 细胞中空白对照组穿过基质胶的细胞数为 (60±8) 个, 与阴性对照组 (55 ±8) 个相比无统计学差异,CX3CR1 干扰 RNA 转染组穿过基质胶的细胞数为 (27±5) 个, 较阴性对照组明显减少 ( 图 4g~ 图 4hP<0.01) 划痕愈合实验结果显示,7721 细胞中未转染空白对照组 48h 的划痕愈合率为 (54±5)%, 与转染空载质粒的阴性对照组 (47±4)% 相比, 差异无统计学意义 ; 但过表达 CX3CR1 质粒转染组的划痕愈合率为 (83± 4)%, 较阴性对照组明显提高 ( 图 4i~ 图 4jP< 0.001),HepG2 细胞中空白对照组 48h 划痕愈合率为 (54±9)% 与阴性对照组 (53±8)% 相比无统计学差异,CX3CR1 干扰 RNA 转染组的划痕愈合率为 (31± 6)%, 较阴性对照组明显降低 ( 图 4k~ 图 4lP<0.05) 以上结果说明,CX3CR1 过表达可以促进 7721 细胞的迁移和侵袭,CX3CR1 干扰可以抑制 HepG2 细胞的迁移和侵袭能力

28 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No.62017 图 4 CX3CR1 对 7721 和 HepG2 细胞迁移和侵袭能力的影响 Fig.4 TheefectsofCX3CR1onthemigrationandinvasionabiltyofthe7721andHepG2cels Mean±SD.n=3. P<0.

7 28 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No 图 4 CX3CR1 对 7721 和 HepG2 细胞迁移和侵袭能力的影响 Fig.4 TheefectsofCX3CR1onthemigrationandinvasionabiltyofthe7721andHepG2cels Mean±SD.n=3. P<0.05vsNegativecontrol P<0.01vsNegativecontrol P<001vsNegativecontrol 2.5 过表达和干扰 CX3CR1 对 PI3K/AKT 和 MEK/ ERK 信号通路的影响蛋白质印迹法检测结果显示,7721 细胞中未转染的空白对照组和转染空载质粒的阴性对照组相比,p ERK p AKT 水平没有统计学差异, 而过表达 CX3CR1 质粒转染组的 p ERK p AKT 水平较阴性对照组明显升高 ( 图 5a),HepG2 细胞中空白对照组和阴性对照组相比,p ERK p AKT 水平没有统计学差异, 而 CX3CR1 干扰 RNA 转染组的 p ERK p AKT 水平较阴性对照组明显降低 ( 图 5b) 以上结果说明 PI3K/AKT 和 MEK/ ERK 信号通路可能参与 CX3CR1 调节肝癌发生发展的过程 3 讨论肝癌是中国发病率最高的恶性肿瘤之一, 每年死于肝癌的患者高达 74.5 万例 [8], 肝癌的发生和发展是一个多因素参与的复杂过程, 虽然目前治疗肝癌有手术放疗化疗等方法, 但是因为肝癌早期发病症状隐匿, 大多数患者就医时已处于中晚期, 失去了手术治疗的机会 [9], 随着人们对肝癌的研究逐渐加深, 趋化因子及其受体在肝癌发生发展中的作用越来越被重视, CXCL12 CXCR4 CCL20 CCR6 CCL5 CCL22 CCR4 [10 13] 等趋化因子轴都被证实能促进肝癌的增殖迁移侵袭 CX3CR1 作为趋化因子受体中的一员, 也被证实参与调节多种肿瘤的生物学效应, 例如在前列腺癌中高表达 CX3CR1 可以促进前列腺癌的迁移和骨转移能力 [14], 在非小细胞肺癌组织中也检测出高表达的 CX3CR1, 而抑制掉 CX3CR1 后可以提高非小细胞肺癌患者的生存率和化疗敏感性 [15] 而关于 CX3CR1 在肝癌中的研究则鲜有报道

2017,37(6) 范梦恬等 : 趋化因子受体 CX3CR1 对人肝癌细胞 7721 和 HepG2 的作用及其机制的研究 29 图 5 Westernblot 检测过表达后 7721 和 HepG2 细胞中 p ERK p AKT 的表达水平 Fig.5 Thelevelofp ERK p AKTinthe7721andHepG2celsaftertransfecting Mean±SD.

8 2017,37(6) 范梦恬等 : 趋化因子受体 CX3CR1 对人肝癌细胞 7721 和 HepG2 的作用及其机制的研究 29 图 5 Westernblot 检测过表达后 7721 和 HepG2 细胞中 p ERK p AKT 的表达水平 Fig.5 Thelevelofp ERK p AKTinthe7721andHepG2celsaftertransfecting Mean±SD.n=3. P<0.001vsNegativecontrol 本研究发现,CX3CR1 在不同的肝癌细胞株中差异性表达, 本研究采用 CX3CR1 过表达质粒转染 7721 细胞, 使其过表达 CX3CR1, 而用 CX3CR1 干扰 RNA 转染 HepG2 细胞, 抑制其 CX3CR1 的表达, 高表达 CX3CR1 的 7721 细胞增殖迁移侵袭能力显著增强, 同时 p AKT 和 p ERK 水平显著增高, 抑制 CX3CR1 的 HepG2 细胞增殖迁移侵袭能力明显减弱, 同时 p AKT 和 p ERK 水平显著降低说明 PI3K/AKT MAPK/ERK 信号通路参与了 CX3CR1 调节肝癌发生发展的过程综上所述, 过表达 CX3CR1 可以明显促进肝癌细胞 7721 的增殖迁移和侵袭能力, 干扰 CX3CR1 可以明显抑制 HepG2 细胞的增殖迁移和侵袭能力, 其机制可能与激活 PI3K/AKT MAPK/ERK 信号通路有关, 由此可见 CX3CR1 可能成为潜在的治疗肝癌的新靶点, 为临床治疗提供一点新的思路, 并且 CX3CR1 在不同肝癌细胞株中差异性表达的特点, 可能可以为临床预后的判断提供一些帮助参考文献 [1]MoriguchiM,UmemuraA.Curentstatusandfutureprospectsof chemotherapyforadvanced hepatocelularcarcinoma. Clin J Gastroenterol,2016,9(4): [2] Kufareva I.Chemokinesand theirreceptors: insightsfrom molecularmodelingandcrystalography.curopinpharmacol, 2016,30: [3]HuangF,GengXP.Chemokinesandhepatocelularcarcinoma. WorldJournalofGastroenterology,2010,16(15): [4] RenH,ZhaoT,SunJ.TheCX3CL1/CX3CR1 reprograms glucose metabolism through HIF 1 pathway in pancreatic adenocarcinoma.jcelbiochem,2013,114(11): [5]YaoX,QiL,ChenX.ExpresionofCX3CR1asociateswith celularmigration,metastasis,andprognosisinhumanclearcel renalcelcarcinoma.urologiconcology,2013,32(2): [6] LvC Y, Zhou T, Chen W.Preliminarystudycorelating CX3CL1/CX3CR1expresionwithgastriccarcinomaandgastric carcinomaperineuralinvasion.worldjournalofgastroenterology, 2014,20(15): [7] LiuJF,TsaoY T,HouC H.Fractalkine/CX3CL1induced intercelularadhesion molecule 1 dependent tumor metastasis through the CX3CR1/PI3K/Akt/NF κb pathway in human osteosarcoma.oncotarget,2016,aug12. [8]ShaoY,GuanJZ.Advancesinthetreatmentofprimaryliver. InfectiousDiseaseInformation,2016,29(4): [9] BrunotA, LeSourd S. Hepatocelularcarcinomain elderly patients:chalengesandsolutions.jhepatocelcarcinoma,2016, 3:9 18. [10] Shah A D, Bouchard M J.Interstitialfluid flow increases hepatocelularcarcinomacelinvasionthroughcxcr4/cxcl12 andmek/erksignaling.plosone,2015,10(11):e [11]DuD,LiuY.TheefectsoftheCCR6/CCL20biologicalaxison theinvasionandmetastasisofhepatocelularcarcinoma.intjmol Sci,2014,15(4): [12] SadeghiM,LahdouI.Serum levelsofchemokinesccl4and CCL5incirhoticpatientsindicatethepresenceofhepatocelular carcinoma.brjcancer,2015,113(5): [13]YeungOW,LoCM.Alternativelyactivated(M2)macrophages promote tumour growth and invasivenes in hepatocelular

9 30 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No carcinoma.jhepatol,2015,62(3): [14]JamiesonW L.CX3CR1isexpresedbyprostateepithelialcels andandrogensregulatethelevelsofcx3cl1/fractalkineinthe bonemarow:potentialroleinprostatecancerbonetropism. CancerRes,2008,68(6): [15] Luo Wen, Lin Yuanlong. mirna 296 3p modulates chemosensitivityoflungcancercelsbytargetingcx3cr1.amj TranslRes,2016,8(4): EfectofCX3CR1onHumanHepatocelular CarcinomaCelsandItsMechanism FANMeng tian CHENSi cheng GUOYang liu LIYa SUNYan ting LIWang SHIQiong (KeylaboratoryofClinicalLaboratoryDiagnostics,MinistryofEducation,ColegeofLaboratoryMedicine, ChongqingMedicalUniversity,Chongqing ,China) Abstract Aim:ToinvestigatetheefectofCX3CR1ontheproliferationmigrationandinvasionabilitiesof hepatocelularcarcinoma(hcc)cellinesanditsmechanism.methods:theexpresionofcx3cr1atmrna andproteinlevelsof7721,hepg2andhumannormalliverepithelialcelslo2wasdetectedbyq PCR and Westernblot.The7721celsweretransfectedwiththeoverexpresionplasmidofCX3CR1;theHepG2celswere transfectedwithsirnaofcx3cr1,andtheexpresionofcx3cr1atmrnaandproteinlevelsweredetectedby Q PCRandWesternblot.ThecelproliferationabilitywasdetectedbyMTTandcloneformationasay.The migrationandinvasionabilityweredetectedbywound healingandtranswelasays.theproteinlevelsofpi3k/ AKTandMAPK/ERKweredetectedbyWesternblot.Results:TheexpresionofCX3CR1waslowerin7721 celsthanthatinhepg2cels.afteroverexpresionplasmidwastransfectedinto7721cels,theexpresionof CX3CR1wasup regulated;celproliferationmigrationandinvasionabilitieswereincreased.meanwhile,the levelsofp ERKandp AKTwereup regulated.aftersirnawasthansfectedintohepg2cels,theexpresionof CX3CR1wasdown regulated,andcelproliferation,migrationandinvasionabilitiesweredecreased,withthe levelsofp ERKandp AKTdown regulated.conclusion:cx3cr1canpromotetheproliferation,migrationand invasionabilitiesofhepatocelularcarcinoma(hcc)cels.theactivationofpi3k/aktandmek/erksignaling pathwaymayplayanimportantroleintheseproceses. Keywords CX3CR1 Hepatocelularcarcinoma Proliferation Invasion Migration

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot