第期王军, 等. 多西环素多克隆抗体的制备及鉴定 99 其他重要的生物学活性, 如抗肿瘤 [1-], 抗炎症 [3], 抑制基质金属蛋白酶 (MMPs) [4] 中性粒细胞弹性蛋白酶 (NE) [5] 和诱导型一氧化氮合酶 (inos) [6] 等, 故在抗炎症及抑制肿瘤侵袭转移方面显示出潜在的

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简季
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1 第 5 卷第期 15 年 3 月江苏大学学报 ( 医学版 ) JournalofJiangsuUniversity(MedicineEdition) Vol.5 No. Mar.15 多西环素多克隆抗体的制备及鉴定王军 1,, 尹蕾 1, 蒋砚秋 1,3, 禚娅 1,4, 刘霞 1, 王荟 1, 张苗苗 1, 杜凤移 1, 夏圣 1 1, 邵启祥 (1. 江苏大学医学院, 江苏镇江 113;. 武汉市妇女儿童医疗保健中心检验科, 湖北武汉 4314;3. 扬中市人民医院检验科, 江苏扬中 1;4. 鹤壁市第一人民医院检验科, 河南鹤壁 4583) [ 摘要 ] 目的 : 采用人工偶联方法构建多西环素完全抗原, 制备多克隆抗体方法 : 分别采用直接偶联法甲醛一步法重氮法 + 混合酸酐法和重氮法 + 碳二亚胺法等 4 种方法将多西环素与牛血清白蛋白 (bulserum albumin, ) 或鸡卵清蛋白 (ovalbumin,ova) 分别偶联, 构建人工完全抗原选择最好偶联效果制备的抗原免疫 BALB/c 小鼠, 通过直接 ELISA 法检测多克隆抗体效价, 竞争抑制 ELISA 法分析其灵敏性及特异性结果 : 重氮法 + 碳二亚胺法偶联的多西环素人工完全抗原效果最好, 其与的偶联比为 , 与 OVA 的偶联比为采用该方法偶联的抗原免疫小鼠获得的多克隆抗体效价在 1 8 以上 ; 该抗体对多西环素的半数抑制浓度 (IC 5 ) 为 98.89~1.3μg/L, 与其他四环素类药物的交叉反应性较低结论 : 重氮法 + 碳二亚胺法的偶联效率最高, 获得的多西环素多克隆抗体效价较高, 特异性和灵敏度均较理想 [ 关键词 ] 多西环素 ; 多克隆抗体 ; 偶联 ; 鉴定 [ 中图分类号 ] R39.11 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (15)-98-5 DOI:1.1331/j.isn y1479 Preparationandidentificationofdoxycyclinepolyclonalantibody WANGJun 1,,YINLei 1,JIANGYan qiu 1,3,ZHUOYa 1,4,LIUXia 1,WANGHui 1, ZHANGMiao miao 1,DUFeng yi 1,XIASheng 1,SHAOQi xiang 1 (1.SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu113;.DepartmentofClinicalLaboratory,WuhanWomenandChildren MedicalCareCenter,WuhanHubei4314;3.DepartmentofClinicalLaboratory,People shospitalofyangzhong,yangzhongjiangsu 1;4.DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstPeople shospitalofhebi,hebihenan4583,china) [Abstract] Objective:Toconjugatethedoxycycline()withbulserumalbumin()/ovalbu min(ova)andgeneratepolyclonalantibodyagainstthe.methods:thewascoupledwith /OVAviadirect,one stepformaldehyde,diazoplusmixedanhydrideanddiazopluscarbodimide conjugationmethod,respectively.thebalb/cmicewereimmunizedwith whichconjugatedby mosteficientmethod.thetiter,sensitivityandspecificityofantibodyweredetectedandasayedbydi rectorindirectcompetitiveinhibitionelisa.results:ithadbeendeclaredthatthediazopluscarbodi imideconjugationmethodwasmosteficient,andthecouplingratioof was8.37 1,and OVAwas4.9 1.Thepolycloneantibody(pAb)titerwasmorethan1 8byindirectELISA. Thehalfmaximalinhibitoryconcentration(IC 5 )was μg/l.therewaslesthecrosre activitywithothertetracyclines.conclusion:theconjugationmethodofdiazopluscarbodimidewasthe mosteficientandthepabhashightiter,betersensitivityandspecificity. [Keywords] doxycycline;polyclonalantibody;coupling;identification 多西环素 (doxycycline,) 是四环素类抗生素, 临床广泛应用于细菌性和原虫类感染的治疗与四环素家族的其他成员相比, 多西环素的亲脂性较强, 这就增加了其在组织内的浓度与穿透力, 加之半衰期较长, 因此, 其抗菌活性更强近来研究发现, 四环素及其衍生物除了具有抗菌作用外, 还具有 [ 基金项目 ] 国家自然科学基金资助项目 (8173) [ 作者简介 ] 王军 (1987 ), 男, 湖北十堰人, 硕士, 初级检验师 ; 邵启祥 ( 通讯作者 ), 教授, 博士生导师,E mail:shao_qx@ujs.edu.cn

2 第期王军, 等. 多西环素多克隆抗体的制备及鉴定 99 其他重要的生物学活性, 如抗肿瘤 [1-], 抗炎症 [3], 抑制基质金属蛋白酶 (MMPs) [4] 中性粒细胞弹性蛋白酶 (NE) [5] 和诱导型一氧化氮合酶 (inos) [6] 等, 故在抗炎症及抑制肿瘤侵袭转移方面显示出潜在的应用前景本实验室通过前期研究发现, 多西环素可通过 MAPK 途径促进小鼠胸腺上皮细胞系 1(mousethy micmedulary typeepithelialcelline1,mtec1) 增殖 [7], 同时还可通过 NF κb 和 MAPK 途径促进 MTEC1 分泌 IL 6 和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (GM CSF) [8] 但是, 多西环素与细胞相互作用的靶点是定位于胞膜胞质还是胞核, 目前还不清楚因此, 我们拟制备多西环素多克隆或单克隆抗体, 通过免疫共沉淀或荧光染色的方法对其进行亚细胞定位由于多西环素为不完全抗原, 很难激发动物的免疫应答, 因此, 要想获得很好的免疫原性, 必须引入蛋白大分子作为载体, 制备出人工完全抗原, 才能进行免疫小分子药物与载体蛋白偶联的方法较多, 不同的偶联方法其效率也不同故本实验比较 4 种常用的偶联方法与多西环素偶联的偶联效率, 选择其中一种偶联方法较好的产物进行免疫制备多克隆抗体, 并进行鉴定 1 材料与方法 1.1 材料多西环素 (),N 羟基琥珀酰胺 (NHS), 水溶性碳二亚胺 (EDC), 牛血清白蛋白 () 鸡卵清蛋白 (OVA) 均为 Sigma 公司产品 ; 四环素, 盐酸金霉素购于大连比亚隆生物工程有限公司 ; 土霉素为江苏大学药学院周爱华教授惠赠 ; 对氨基苯甲酸 (PA BA),N,N 二甲基甲酰胺 (DMF), 乙二胺均购于中国医药集团上海化学试剂公司 ; 辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的羊抗鼠 IgG 二抗购于南京生兴生物技术有限公司 ;UV41PC 紫外可见光分光光度计为 Shimadzu 公司产品 1. 方法 1..1 多西环素与载体的偶联 [9] 直接偶联法具体操作参考甘金华等方法精确称取 7mgNHS 1.3mgEDC 165mg 共溶于 5mL.1mol/LPBS(pH7.4) 溶液中, 冰浴条件下搅拌过夜,5r/min 离心 1min, 上清液为 A 液精确称取 1mg 多西环素溶于.5 mldmf 中, 待完全溶解后边搅拌边用移液器逐滴加入到 A 液中, 避光反应 4h,5r/min 离心 1 min, 取上清液于 1mL 烧杯中, 以 ph7.4pbs 溶液作为透析液, 置冰浴中透析 3d, 每天更换 3 次 PBS, 除去未反应的 DMF EDC NHS 和多西环素等小分子物质经紫外分光光度计光谱鉴定, 并分装于 - 保存此偶联物称为甲醛一步法具体操作参考文献 [1] 首先, 制备阳离子化 (cationed,c), 接着在甲醛作用下, 使 D 环中酚羟基的邻对位的活泼氢与载体蛋白的氨基发生胺的甲基化 (Mannich 反应 ), 从而制备人工完全抗原, 此偶联产物称为 c 重氮法 + 混合酸酐法具体操作参考乐 [11] 涛等方法将重氮化后与偶联物偶联, 之后引入羧基 (-COOH), 然后采用混合酸酐的方法将与载体蛋白或 OVA 进行偶联, 从而制备人工完全抗原, 此偶联物称为 PA BA 重氮法 + 碳二亚胺法具体操作参考 [1] Zhang 等方法首先, 进行的活化, 制备 cb SA, 备用 ; 接着将进行重氮化反应, 使重氮化后的产物与进行偶联, 引入羧基在 EDC 与 NHS 的作用下, 加入载体蛋白, 从而制备人工完全抗原 c 以及包被抗原 OVA 1.. 人工完全抗原的鉴定采用紫外分光光度计光谱扫描的方法进行鉴定将 4 组偶联物和分别用蒸馏水配制成适宜浓度的溶液进行光谱扫描 ; 用蒸馏水调零, 波长扫描范围为 ~ 6nm; 最后将每组的扫描曲线叠加进行比较, 观察波峰的吸收情况, 以确定是否成功偶联并计算相应的偶联比 (N) N 的计算参照如下公式 : (1) 蛋白浓度 (mg/ml)=1.45d D 6 ; ()D=ε 摩尔消光系数 cl; (3) N =(DCam KBbm -DCbm KBam)/ (DCbm KAam-DCam-KAbm) 公式中 :D 8 和 D 6 分别为该蛋白在 8nm 和 6nm 波长下的光密度值,D 为该物质最大吸收波长处的光度密值,c 为该物质的质量浓度 (mol/l),l 为石英比色杯的直径 (cm),ε 为该物质某一波长下的摩尔消光系数 [L/(mol cm)],n 为每摩尔载体蛋白上所偶联的多西环素的摩尔数,KAam 和 KAbm 表示物质 A 在 a b 处的摩尔吸光系数,KBam 和 KBbm 表示物质 B 在 a b 处的摩尔吸光系数,DCam 和 DCbm 表示偶联物在 a b 处的光密度,a,b 分别

3 1 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 5 卷为物质 A 与物质 B 的最大吸收波长 1..3 多西环素多克隆抗体的制备选取偶联较好的免疫 6~8 周龄雌性 BALB/c 小鼠, 共 3 只每只每次免疫剂量为 1μg,.mL, 共免疫 4 次, 每间隔周免疫 1 次初次免疫时用无菌 PBS 溶解的多西环素偶联物与等体积的弗氏完全佐剂背部皮下多点注射 ; 第 3 次免疫用无菌 PBS 溶解的多西环素偶联物与等体积的弗氏不完全佐剂腹腔注射 ; 第 4 次免疫用无菌 PBS 直接溶解多西环素偶联物 (5mg/L), 每只小鼠尾静脉注射.mL; 最后一次免疫后 1 周, 麻醉小鼠, 眼球内眦采血, 室温放置 1h,4r/min, 离心 1min, 分装,-9 保存备用取初次免疫之前小鼠尾静脉血作为阴性对照 1..4 多西环素多克隆抗体效价的滴定将多西环素人工完全抗原按免疫程序免疫小鼠后, 分别取血清进行效价滴定, 采用直接 ELISA 法测定以 ph 9.6 的 Na CO 3 /NaHCO 3 缓冲液为包被缓冲液, 溶解包被抗原 OVA 使之终质量浓度分别为 mg/L, 包被到空白 96 孔酶标板上, 每孔体积为 1μL 待测血清用 1 TBST 稀释, 浓度分别为和 1 1 酶标仪 45nm 波长处读取 D(45nm) 值当 D(45nm) 待测 /D(45nm) 阴性.1 时, 即判定为阳性同时绘制小鼠血清效价曲线图 1. 多西环素多克隆抗体灵敏度的检测采用间接竞争抑制 ELISA 法测定多西环素标准浓度为 μg/L, 用 PBST( 含 1% 甲醛 ) 配制绘制标准浓度多西环素对 3 只小鼠血清抗体抑制率曲线图, 并计算 IC 5 衡量其灵敏度 1..6 多西环素多克隆抗体特异性的检测多西环素为四环素类抗生素, 为评价其多抗的特异性, 应选择四环素土霉素和盐酸金霉素等四环素类抗生素进行鉴定将药物用 PBS 稀释至终质量浓度分别为 μg/L 采用竞争抑制 ELISA 法测定绘制药物竞争抑制率曲线并计算药物的交叉反应率药物交叉反应率计算公式 : 交叉反应率 (%)=IC 5 / 某药物 IC 5 1% 结果.1 人工完全抗原紫外鉴定结果将 4 组偶联物 OVA 和分别用蒸馏水配制成适宜浓度的溶液进行紫外分光光度计的光谱扫描, 见图 1 和图由图 1 可知, 有个明显的紫外吸收峰, 分别为 74nm 和 344.5nm; 有 1 个明显的吸收峰, 为 78.5nm; 有 1 个最大吸收峰, 波长为 77.5nm 4 种偶联产物中, 直接偶联法偶联物的最大吸收峰为 76.5 nm, 甲醛一步法偶联物 c 有个最大吸收峰, 分别为 78nm 和 345nm 重氮法 + 混合酸酐法中偶联物也有个最大吸收峰, 分别为 8nm 和 47.5nm 重氮法 + 碳二亚胺法中偶联物 c 有个最大吸收峰, 分别 c --c 图 1 4 种不同偶联方法的紫外光谱图

第期王军等多西环素多克隆抗体的制备及鉴定１１为８ｎｍ和４１ｎｍ对比４种偶联方法重氮法多克隆抗体灵敏度测定结果使用间接碳二亚胺法最大吸收峰发生了最为明显的红移ＥＬＩＳＡ方法评价３只小鼠免疫血清用于多西环素检说明有大量的新偶联物产生因此我们认为该方法测的灵敏度抗血清稀释比为１４由图４可ｘ与的偶联效率最高根据公式计算出该方法中Ｄｏ μｇ

个明显的吸收峰为７９ｎｍＰＡＢＡ有１个最大吸收９３Ｘ１１１ｓ８３ｒ９４６７ＩＣ５峰波长为７７５ｎｍ而包被原ＤｏｘＯＶＡ的１３μｇＬ鼠３的线性回归曲线方程为Ｙ３５ｎｍＤｏｘ与ＯＶＡ的偶联比最大吸收峰波长为４为４９１ 3.

"(nm) #$%+&'()% 6 1.!1!!3.8 图包被原ＤｏｘＯＶＡ的紫外光谱图 D/D 多西环素多克隆抗体的鉴定.6.4.

4 第期王军等多西环素多克隆抗体的制备及鉴定１１为８ｎｍ和４１ｎｍ对比４种偶联方法重氮法多克隆抗体灵敏度测定结果使用间接碳二亚胺法最大吸收峰发生了最为明显的红移ＥＬＩＳＡ方法评价３只小鼠免疫血清用于多西环素检说明有大量的新偶联物产生因此我们认为该方法测的灵敏度抗血清稀释比为１４由图４可ｘ与的偶联效率最高根据公式计算出该方法中Ｄｏ μｇＬ之间均知标准多西环素的浓度在５１ＢＳＡ的偶联比为８３７１按此方法制备了包被原有不同的抑制性其中鼠１的线性回归曲线方程为ＤｏｘＯＶＡ从图可看出Ｄｏｘ有个明显的Ｙ８５Ｘ１６８ｓ５８ｒ９７１ＩＣ５紫外吸收峰分别为７４ｎｍ和３４４５ｎｍＯＶＡ有１９８８９ μｇＬ鼠的线性回归曲线方程为Ｙ个明显的吸收峰为７９ｎｍＰＡＢＡ有１个最大吸收９３Ｘ１１１ｓ８３ｒ９４６７ＩＣ５峰波长为７７５ｎｍ而包被原ＤｏｘＯＶＡ的１３μｇＬ鼠３的线性回归曲线方程为Ｙ３５ｎｍＤｏｘ与ＯＶＡ的偶联比最大吸收峰波长为４为４９１ 3. *+, Ｌ故鼠１的多克隆抗体效价高一些其检测多 μｇ西环素的ＩＣ５低一些相反灵敏度高一些而鼠和 OVA --OVA. １ｓ６４ｒ９６８８ＩＣ５１１３１３Ｘ１鼠３的ＩＣ５高一些相反灵敏度低一些３只小鼠所产生的多西环素多克隆抗体对多西环素的ＩＣ５在９８８９１３ μｇＬ之间从而说明该抗体具有较 1. 好的灵敏度.5 4!"(nm) #$%+&'()% 6 1.!1!!3.8 图包被原ＤｏｘＯＶＡ的紫外光谱图 D/D 多西环素多克隆抗体的鉴定.6.4. １多克隆抗体效价的滴定结果由图３Ａ可５ｍｇＬ每孔５μｇ由知最适包被原浓度为 1 3 lgc 图３Ｂ可知３只小鼠中有１只抗血清的效价在１１以上另外只在１８以上ｌｇＣＤＯＸ多西环素浓度 μｇＬ的对数值ＤＤ加入不同浓度５ｎｍ值与多西环素浓度为时的Ｄ４５多西环素后的Ｄ４ 4 mg/ml mg/ml 1 mg/ml 5 mg/ml m g/ml 1.5 m g/ml D (45 nm) &( 图４多克隆抗体对不同浓度多西环素的竞争抑制曲线３多克隆抗体特异性的测定取免疫效果较好的鼠１的多抗进行药物之间的交叉反应抗血清稀释比为１４绘制交叉反应曲线见图５由 1:1 1:1 1:1!"#$%&' (A) 1:1 )1 ) )3 6 图可知四环素土霉素金霉素对应的ＩＣ５分别为１１９９１９９８１１６６３３μｇＬ与多西环素的 8 D (45 nm) &( ｎｍ值之比交叉反应率分别为８３４５１６３多西环素多克隆抗体与３种四环素类药物的交叉反应率均小于１由此说明获得了较好特异性的抗多西 4 环素多克隆抗体 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1!"#$%&' (B) ３讨论多亚环素属于小分子质量化合物其盐酸化相对分子质量为４４４只有免疫反应性无免疫原Ａ不同包被原浓度曲线Ｂ３只小鼠抗血清效价曲线性故为了使其具有免疫原性须将大分子载体蛋白图３多西环素多克隆抗体的效价曲线与其进行偶联借助载体蛋白产生针对多西环素的

5 1 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 5 卷 D / D lgc 3 lgc DOX : 多西环素浓度 (μg/l) 的对数值 ;D/D : 加入不同浓度多西环素后的 D(45nm) 值与多西环素浓度为时的 D(45 nm) 值之比图 5 四环素类药物的竞争抑制曲线特异性抗体最常用的载体蛋白一般要求具备性质较稳定, 氨基酸残基较多, 同时与小分子物质偶联后, 小分子物质性质不发生变化等特性, 和 OVA 是常用的载体蛋白多西环素化合物自身带有氨基, 因此可采用直接法将其与载体蛋白的羧基端进行偶联反应 ; 同样也可改变其化学结构如引入羧基, 然后与载体蛋白的氨基进行偶联, 但引入的化学基团不能改变其本身的理化性质, 因此, 主要在多西环素的第 7 8 和 9 这 3 个空位碳原子上进行改变本实验中第种方法即为在 8 和 9 号碳原子之间进行偶联, 其余两种方法为在 7 号碳原子上引入化学基团本研究首先比较了 4 种常用偶联方法应用于多西环素与或 OVA 偶联的效率, 经紫外分光光度计扫描, 结果显示, 重氮法 + 碳二亚胺法获得的多西环素与载体偶联物的吸收波峰发生明显的红移, 说明其更适合于多西环素与载体的偶联我们采用该方法制备了大量相关偶联物, 并进一步免疫小鼠获得了特异性和灵敏度较高的多克隆抗体, 为后期应用该抗体进行多西环素的细胞内定位或免疫共沉淀奠定了良好的基础 [ 参考文献 ] [1] SonK,FujiokaS,IidaT,etal.ycyclineinduces apoptosisinpanc 1pancreaticcancercels[J].Anti cancerres,9,9(1): [] TangH,SampathP,YanX,etal.Potentialforen hancedtherapeuticactivityofbiologicalcancertherapies withdoxycyclinecombination[j].genether,13, (7): [3] BermanB,PerezOA,ZelD.Updateonrosaceaand anti inflammatory dosedoxycycline[j].drugstoday (Barc),7,43(1):7-34. [4] SuW,LiZ,LiF,etal.ycycline mediatedinhibi tion ofcornealangiogenesis: an MMP independent mechanism[j].investophthalmolvissci,13,54 (1): [5] DalviPS,SinghA,TrivediHR,etal.Efectofdoxy cyclineinpatientsofmoderatetoseverechronicobstruc tivepulmonarydiseasewithstablesymptoms[j].ann ThoracMed,11,6(4):1-6. [6] SuW,LiZ,LiY,etal.ycyclineenhancesthein hibitoryefectsofbevacizumaboncornealneovascular izationandpreventsitssideefects[j].investophthal molvissci,11,5(1): [7] ChenX,XiaS,LiR,etal.ycyclineenhancesthe Ras MAPKsignalingandproliferationofmousethymic epithelialcels[j].jcelbiochem,9,17(3): [8] HuangY,LiR,ChenX,etal.ycyclineup regu latestheexpresionofil 6andGM CSFviaMAPK/ ERK andnf κbpathwaysinmousethymicepithelial cels[j].intimmunopharmacol,11,11(9): [9] 甘金华, 邓薇, 李进平, 等. 强力霉素人工抗原的合成与抗体制备 [J]. 食品与生物技术学报,11,3 (): [1] 万亮. 三种真菌毒素蛋白质微阵列检测方法的初步研究以及抗四环素多克隆抗体的制备 [D]. 南昌 : 南昌大学,8. [11] 乐涛, 严佩峰, 王喜亮, 等. 多西环素人工抗原的合成与鉴定 [J]. 中国兽药杂志,1,44(1):3-34,55. [1] ZhangY,LuS,LiuW,etal.Preparationofanti tetra cyclineantibodiesanddevelopmentofanindirectheter ologouscompetitiveenzyme linkedimmunosorbentasay todetectresiduesoftetracyclineinmilk[j].jagric FoodChem,7,55(): [ 收稿日期 ] [ 编辑 ] 刘星星

第期甘金华等强力霉素人工抗原的合成与抗体制备材料与方法试剂及溶液

第期甘金华等强力霉素人工抗原的合成与抗体制备材料与方法试剂及溶液第卷第期年月食品与生物技术学报强力霉素人工抗原的合成与抗体制备甘金华邓薇李进平艾晓辉中国水产科学研究院长江水产研究所湖北荆州武汉纺织大学环境与城建学院湖北武汉采用改进的碳二亚胺两步法将强力霉素半抗原与载体蛋白连接制备强力霉素牛血清白蛋白人工免疫抗原并用同样方法将强力霉素与载体蛋白连接制备人强力霉素卵清白蛋白人工包被抗原经紫外扫描分析和动物免疫试验证实强力霉素人工抗原合成成功