衛生勞動篇 法規 中華民國 96 年 5 月 29 日 ( 補登 ) 行政院衛生署公告 衛署藥字第 0960312332 號 主旨 : 公告訂定 增列含亞硫酸鈉 (sodium sulfite) 成分之燙髮用劑為化粧品含有醫療或毒劇藥品之基準, 如附件, 並自即日生效 依據 : 化粧品衛生管理條例第七條第三項及第二十條 公告事項 : 一 訂定 增列含亞硫酸鈉 (sodium sulfite) 成分之燙髮用劑為化粧品含有醫療或毒劇藥品之基準 二 自公告日起, 凡持有未符合本公告基準規定之含藥化粧品許可證者, 應即自動向本署辦理變更登記, 其未辦理者, 許可證有效期間屆滿不予展延 署 長侯勝茂 本案依分層負責規定授權處室主管決行 增列含亞硫酸鈉成分之燙髮用劑為化粧品含有醫療或毒劇藥品之基準 成分名稱 限量 ( 最高允許使用濃度 ) 用途 亞硫酸鈉 (sodium sulfite) 6.7% ( 以游離 SO 2 計 ) 燙髮 公告及送達 中華民國 96 年 5 月 29 日 行政院衛生署公告 衛署食字第 0960403048 號 主 旨 : 預告訂定 健康食品之輔助調整過敏體質功能評估方法草案 健康食品之不易形成體脂肪功能評估方法草案 及修正 健康食品之調節血糖功能評估方法草案 15299
健康食品之調節血脂功能評估方法草案 共 4 項, 如附件 依據 : 行政程序法第一百五十四條 公告事項 : 一 主管機關 : 行政院衛生署 二 訂定依據 : 健康食品管理法第三條第二項 三 本草案另詳載於本署網站 ( 網址 :http://www.doh.gov.tw/) 之 本署公告 網頁或本署食品資訊網 ( 網址 :http://food.doh.gov.tw/) 之 最新公告 網頁 四 對公告內容如有意見或修正建議者, 請於本公告刊登公報之日起 20 日內陳述意見或洽詢, 逾期視同無意見 ( 一 ) 承辦單位 : 行政院衛生署 ( 二 ) 地址 : 臺北市愛國東路 100 號 ( 三 ) 電話 :(02)2321-0151 轉 368 ( 四 ) 傳真 :(02)2392-9723 署 長侯勝茂 健康食品之輔助調整過敏體質功能評估方法草案 壹 前言健康食品的 輔助調整過敏體質 功能評估, 是減少過敏免疫反應之功能評估 所謂降低過敏免疫反應, 針對不同過敏型式有各種過敏反應的指標, 例如 : 降低血清過敏抗體含量 降低發炎反應 減少過敏反應相關細胞激素或介質的分泌 調節 T 細胞分泌細胞激素 降低呼吸阻力等 但必須在不影響正常免疫反應的情況下, 對過敏指標有減輕作用, 對健康才有助益 若以動物實驗可以過敏原致敏動物, 再進行抗原特異性免疫反應的評估 至於人體的改善過敏的評估, 可由正常人與過敏傾向的人分別進行 貳 實驗方法一 動物實驗實驗動物 : 建議選用小鼠, 常用的 Balb/c 或是 B6 小鼠皆可,6-8 週大, 雄鼠或雌鼠皆可, 每組隻數為單一性別至少 10 隻 ( 一 ) 致敏小鼠本動物實驗之過敏免疫反應是以腹腔注射過敏原的模式進行, 採用過敏原作為抗原, 可以氫氧化鋁作為佐劑 (adjuvant), 在注射抗原前及注射抗原一週後以眼窩採血, 取得血清進行抗原特異性抗體濃度之分析, 確立動物過敏模式之建立, 必要時須致敏三至四次 對於呼吸道過敏之動物模式, 宜另以噴霧致敏法使從呼吸道接觸過敏原, 鼻腔過敏之動物模式宜以鼻腔接觸過敏原等各種不同過敏動物模式 15300
1 血液抗體濃度 (1) 可利用 sandwich-elisa 免疫呈色反應法或 Radial immunodiffusion(rid) 法, 定量血 清中免疫球蛋白 IgE IgG IgM IgA 和總抗體含量 利用免疫呈色反應法測定免疫球蛋白濃度 : 將血清加入表面已覆蓋免疫球蛋白抗 體的 96 孔盤中, 靜置反應後, 再加入標有呈色酵素的抗體作用, 最後加入呈色劑並 與標準值對照, 經由可見光吸光測定分析計算便可以算出免疫球蛋白濃度 RID 方法為 : 將血清放入培養孔中, 靜置 24 至 48 小時後, 再測量其直徑大小, 與標準值對照, 算出免疫球蛋白濃度 (2) 過敏原誘發的特異性抗體產生 利用免疫呈色反應法測定抗原特異性免疫球蛋白濃度 : 將血清加入表面已覆蓋過 敏抗原的 96 孔盤中, 靜置反應後, 再加入標有呈色酵素的抗老鼠 IgE IgG 1 或等抗體 作用, 最後加入呈色劑並與標準值對照, 經由可見光吸光測定分析計算便可以算出免疫球蛋白濃度 2 脾臟或是淋巴結細胞增生反應: 細胞增生能力即指免疫細胞受到刺激時, 能夠增生的能力 故增生能力之表示, 以添加裂殖素後, 細胞增生的數值為未添加裂殖素時數值的倍數, 稱為增生指數 (Stimulation Index), 簡稱 S. I. 本實驗的細胞增生的刺激物須包括過敏原和裂殖素,T 細胞須以過敏原刺激培養, 另可使用如 ConA PHA 等裂殖素或抗 CD3 抗體的刺激劑, 以分析 T 細胞的增生反應 B 細胞須以過敏原刺激培養, 另可使用如 LPS 來刺激, 分析 B 細胞的增生反應 進行步驟 : (1) 3 H-thymidine 嵌入法 : 本方法較靈敏, 將脾臟細胞 2x10 6 /ml 置於 96 孔盤, 再加入 RPMI 培養基或分別添加有 LPS Con A PHA 等細胞裂殖素的培養基 於 37 二氧化碳無菌培養箱培養兩天後, 加入 1µCi/well 3 H-thymidine, 繼續培養 20 小時後, 以細胞收集儀收集細胞於濾紙上, 濾紙風乾後以閃爍計數儀測 3 H-thymidine 含量, 計算細胞增生能力 (2) MTT 法 : MTT 的測定方法, 是利用細胞本身的酵素對受質的作用, 產生顏色的變化, 再進一步測定其吸光值 如果細胞受到細胞裂殖素的刺激, 增生越多, 則活的細胞愈多, 酵素的活性就會較高, 可以測到較高的吸光值 利用此一原理, 也可以來測定細胞的增殖反應, 但是此種測定方法通常對附著性細胞的準確度較高, 對懸浮性細胞則較不理想, 細胞數與吸光值的直線相關有飽和現象, 吸光值無法代表細胞數值, 以致較不靈敏, 進行本實驗時應特別注意 (3) 螢光流體計數儀來測定 DNA 的染色 : 利用螢光染色的方法來分析細胞是否受到刺激, 細胞核內的 DNA 是否有任何變化, 可以利用 bromodeoxyuridine(brdu) 的方法來染色 BrdU 的方法則需要再加上 15301
一個抗 BrdU 的單株抗體加上螢光, 才能利用螢光流體計數儀來加以分析 為了進一步分析是那些細胞的 DNA 有增加的變化, 可以同時對這些細胞進行表面標記的分析 如利用抗 CD3 及抗 B220 抗體先行染色, 再將細胞加以固定, 然後進行 DNA 的染色 對細胞的表面標記及細胞內的 DNA 螢光使用不同波長的螢光, 以便能夠在儀器上能對這兩群不同的細胞進行分析 如果能夠達到此一目的, 便能夠不需要將細胞分離出就可以知道是那些細胞受到活化 3 細胞激素分泌實驗將分離出的淋巴球以 5x10 6 /ml 的濃度置於 24- 孔盤中, 利用已經定量過的過敏原 Con A 或抗 CD3 抗體來刺激這些淋巴球 經過 24 到 48 小時的培養後, 將上層液離心下來, 以測定其細胞激素製造的量 在取得足夠檢體以前, 可將其它檢體先保存在 -70, 等到檢體足夠時再一起測試 細胞激素的測定是利用 sandwich-elisa 法 先將抗細胞激素的抗體先覆蓋在 24- 孔盤上, 在 4 靜置一晚, 在進行實驗前先以 1%PBS-BSA 處理清洗去多餘抗體 再加入測定的樣品至 24- 孔盤, 於室溫 2 小時後加入 biotin 聯結的抗細胞激素抗體 兩小時的室溫靜置後, 加入 avidin 聯結過氧化酵素 (avidin-linked peroxidase), 再靜置二個小時後加入受質以呈色 上述的裂殖素的濃度及刺激時間在實驗進行之前都應先測定其最適當的濃度, 並以已知濃度的細胞激素作為對照 4 呼吸道肺沖洗液之分析 (1) 發炎細胞數量及種類分析, 如 : 嗜伊紅性白血球 中性白血球 單核球及淋巴球等 犧牲鼠隻後, 剪開氣管露出小洞, 以靜脈置留管插入氣管, 軟管綁緊後, 以生理食鹽水沖洗肺部 5 次, 回收肺沖洗液放入離心管離心, 取上清液保存待分析 下層細胞以含 BSA 生理食鹽水溶開, 經 trypan blue dye exclusion 法染色, 以細胞計數器計算所有存活白血球數目 裝置好玻片後, 取細胞液置於 cytospin 離心管,cytospin 後取下載玻片風乾, 取 Liu A 染劑染色 30 秒, 從背面以水龍頭沖去多餘染劑, 風乾, 取 Liu B 染劑染色 60 秒, 再沖去多餘染劑, 風乾, 觀察染色成果 以阿拉伯膠封片, 以油鏡判讀至少五個視野之細胞或總數 200 個以上之細胞組成, 計算判讀細胞所佔總細胞之數目 (2) 發炎相關介質分析, 如 : 組織胺 細胞激素及趨化激素 組織胺可以 HPLC 方法分析, 唯樣品中組織胺回收率較低, 目前組織胺定量多以市售的組織胺測定試劑組分析 細胞激素與趨化激素分析方法如前所述 5 肺功能測定或其他過敏相關有效之指標測定 (1) 氣喘疾病模式 : 呼吸道阻力 呼吸敏感度 每隻小鼠在最後一次吸入式致敏的隔天進行肺功能測定, 使用 whole body plethysmography(buxco), 以噴霧的方式依序吸入 3 分鐘的 0 3.125 6.25 12.5 25 mg/ml methacholine, 再分別測定 3 分鐘, 記錄肺功能指標 Penh(Enhanced Pause) 值 (2) 鼻炎疾病模式 : 打噴嚏 鼻阻力 鼻內面積 抓鼻次數等 15302
打噴嚏 抓鼻次數等可以抗原溶液滴入小鼠鼻腔內, 於滴入性致敏後計數 10 分 鐘內小鼠打噴嚏或抓鼻次數, 唯此計數方法因個人判斷差異性較大, 須多人重複計數 (3) 其他病症 : 其他有效評估工具 6 自然殺手細胞活性為測定實驗動物之自然殺手細胞的活性, 先培養自然殺手細胞的標的細胞 (YAC-1 細胞株 ) 將 YAC-1 細胞與 51 Cr 先在一起培養約 4 小時, 將殘餘在試管中的 51 Cr 除去 再加入不同數目的單核細胞與已經與 51 Cr 培養過的標的細胞一起培養, 培養一段時間後取出上清液, 以間 -counter 內計算其放射強度 在實驗的過程中, 利用 NP-40 或是 HCl 將細胞破壞, 以取得 51 Cr 的最高釋放值 實驗值 - 背景值計算公式 = 100% 最高釋放值 - 背景值除了上述傳統方法, 目前亦有以 FAScan 分析法, 可參照所使用的相關試劑與儀器操作流程, 但須明列數據計算方式與表示方法 7 吞噬細胞活性吞噬細胞可以分別測定單核球 (monocyte) 或是中性白血球的吞噬能力, 目前可以分別利用吞噬細菌如 E. coli 或酵母菌等方法來加以測定, 也可以利用已標記好的 E. coli ( 如螢光 ), 在細胞吞噬後利用螢光流體計數儀來加以分析 二 人體的臨床試驗必須委託國內外大學食品營養 醫藥等相關研究所 醫學中心或其他中央衛生主管機關認可之研究機構執行, 需有醫師參與, 並遵循衛生單位對保健食品人體實驗有關之相關規定 人體試驗的過敏免疫功能評估, 原則上與動物的評估近似, 惟進行人體的臨床試驗之前應經過人體試驗委員會通過才能加以進行 受試者分對照組 ( 不吃待測樣品 ) 實驗組( 分二至三組劑量 ), 分別在實驗前後採血液, 測定抗體, 並分離周邊血液單核細胞, 進行以下實驗 同時, 建議由至少一家以上之試驗中心進行試驗以求公允 ( 一 ) 過敏免疫反應指標 : 以下分析方法與動物實驗部分方法相同, 唯須使用分析人類的試劑 1 總 IgE 抗體與過敏抗原特異性 IgE 抗體之測定對受試者進行採血後, 血清部分可利用 sandwich-elisa 免疫呈色反應法或 Radio immunodiffusion (RID) 法, 定量血清中免疫球蛋白 IgE 總抗體含量, 建議同時測定 IgG IgM IgA 的含量, 觀其是否有所變化, 分析方法如前所述 2 過敏抗原特異性增生反應對受試者進行採血後, 以 Percoll 梯度法分離得淋巴球, 如前所述, 以適當濃度之裂 15303
殖素, 常見或特定過敏原刺激後, 分析其細胞增生能力 3 過敏抗原特異性細胞激素分泌同前, 以 Percoll 梯度法分離得淋巴球, 如前所述, 以適當濃度之裂殖素, 常見或特定過敏原刺激後, 收集上清液分析其細胞激素含量 4 周邊血液單核細胞分離培養, 進行發炎介質分析同前, 以 Percoll 梯度法分離得淋巴球, 如前所述, 以適當濃度之單核球裂殖素, 常見或特定過敏原刺激後, 收集上清液分析其發炎介質含量 5 發炎細胞計數, 如 : 嗜伊紅性白血球之數量及比例同前, 以 Percoll 梯度法分離得淋巴球顆粒球, 如前所述計數細胞 ( 二 ) 臨床症狀評估 1 肺功能檢查受試者有氣喘病症時, 需進行呼吸道阻力 呼吸道敏感度評估 2 鼻炎評估內容包含症狀分數 ( 依據症狀評分表進行評分 ) 鼻阻力及鼻內面積 3 異位性皮膚炎症狀分數評估 4 其他包含受試者自評及醫師評估等 參 結果判定之基準判定的基準原則上依據上述實驗項目及方法進行相關研究, 統計分析有意義者判定其功能 15304
健康食品之不易形成體脂肪功能評估方法草案 壹 前言肥胖症是指身體由於生理或生化機能之改變而引起體內脂肪過度沉積, 造成體重增加之病症 WHO&FDA 已經於 1996 年將肥胖列為慢性疾病之一, 強調 維持理想體重 之重要性 而肥胖症可分為以下兩種 : 一 單純性肥胖 (simple obesity): 又可分為體質性肥胖和獲得性肥胖兩種 體質性肥胖是指脂肪細胞數目較多所引起之肥胖症, 常見於兒童時期之肥胖 另外, 獲得性肥胖則是指脂肪細胞增大所引起之肥胖, 常見於成年時期之肥胖症 而 95% 以上之肥胖症是屬於單純性肥胖症 二 續發性肥胖 (secondary obesity): 由於內分泌或代謝性疾病等所引起之肥胖症, 亦稱為症狀性肥胖 (symptomatic obesity) 一般而言, 保健食品可做為不易形成體脂肪所應用之原理如下 : 一 調節體內脂質分解作用 - 活化激素敏感性脂解酶 (hormone-sensitive lipase): 不易形成體脂肪之過程就是體內脂肪動員作用之過程 許多不易形成體脂肪食品乃是利用其中可以促進脂肪組織分解之物質, 減少體脂肪, 以達到體重降低之目的 而身體中存在於脂肪組織之激素敏感性脂解酶 (hormone-sensitive lipase), 可以促進脂肪組織中三酸甘油酯 (triglyceride, TG) 之分解, 乃是脂肪分解作用之關鍵酵素 二 調節消化道消化及吸收之功能 : 不易形成體脂肪食品中亦有許多可以影響消化道消化及吸收之物質, 藉此作用減少營養素之吸收, 例如 : 抑制胰脂解酶之分解作用, 減少腸道中脂質之分解 ; 或抑制胰澱粉酶和雙醣酶之活性, 減少澱粉和雙醣類之消化分解 ; 或促進消化道蠕動, 使食物快速通過, 減少營養素之消化與吸收等 由於續發性肥胖多因內分泌失調或代謝異常所致, 影響因素甚多 因此, 本功能評估方法以單純性肥胖症為對象, 評估保健食品之不易形成體脂肪功能 貳 評估食品是否具有不易形成體脂肪功能之檢測方法一 動物實驗 1 原理 (1) 原理一 : 以高熱量飼料誘發實驗動物之肥胖症後, 投與受試物, 並利用各種評估指標判定 (2) 原理二 : 同時投與高熱量飼料與受試物, 並利用各種評估指標判定 2 實驗材料與方法 (1) 實驗動物 10~12 週齡之雄性 SD Wistar 大白鼠或小白鼠 15305
(2) 實驗分組及飼養方法依照上述實驗原理之不同, 可進行以下兩種分組方式 : 原理一之分組 : 以組間平均體重無顯著差異為原則, 將實驗動物分為對照組 (control group, C) 及高熱量組 (high energy group, HE) C 組以正常飼料飼養, 而 HE 組以高熱量飼料飼養 ( 參考例 : 大白鼠固型飼料 47% 玉米油 8% 煉乳 44%)(Ricci and Levin, 2003; Levin and Dunn-Meynell AA, 2002) 飼養至少 4 週後, 確定 HE 組之體重顯著高於 C 組 20% 後 (p<0.05),c 組繼續以正常飼料飼養,HE 組再依照有無投與受試物以及投與劑量之高低分成三組 其中一組為不投與受試物之組 (HE(-)), 另外根據受試物之人體每日每公斤建議量之 1 倍及 2~5 倍之劑量分成 HE(1x) 及 HE(2 ~5x) 兩組, 每組至少 8 隻實驗動物 受試物之投與可以添加於飼料或以胃管灌食 再飼養至少 4 週後, 犧牲實驗動物, 進行各項分析 分組之方法如下圖 : 至少 4 週 至少 4 週 犧牲動物及分析 對照組 (C): 正常組成之飼料高熱量組 (HE): 高熱量飼料 C 組 : 正常組成之飼料 HE(-) 組 : 高熱量飼料, 不投與受試物 HE(1x) 組 : 高熱量飼料, 投與 1 倍劑量之受試物 HE(2~5x) 組 : 高熱量飼料, 投與 2~5 倍劑量之受試物 原理二之分組 : 以組間平均體重無顯著差異為原則, 將實驗動物分為對照組 (C) 不投與受試物之高熱量組(HE(-)), 以及根據受試物之人體每日每公斤建議量之 1 倍及 2~5 倍劑量之 HE(1x) 及 HE(2~5x) 等四組 受試物之投與可以添加於飼料或以胃管灌食 飼養至少 4 週後, 犧牲動物, 進行以下各項分析 分組之方法如下圖 : 至少 4 週 C 組 : 正常組成之飼料 HE(-) 組 : 高熱量飼料, 不投與受試物 HE(1x) 組 : 高熱量飼料, 投與 1 倍劑量之受試物 HE(2~5x) 組 : 高熱量飼料, 投與 2~5 倍劑量之受試物 犧牲動物及分析 關於添加劑量之算法, 依據體重 60kg 之成人除以受試物之每日人體建議攝取量, 即可得每公斤體重之建議攝取量 再乘以實驗動物相對於人體之代謝係數, 即可得該實驗動物每日之攝取劑量 大白鼠相對於人體之代謝係數為 6.25, 小白鼠為 9.01( 苗, 1997) 計算式表示如下: 大白鼠每公斤體重之攝取劑量 = 人體建議攝取量 體重 60kg 6.25 小白鼠每公斤體重之攝取劑量 = 人體建議攝取量 體重 60kg 9.01 (3) 測量項目及方法 安全性指標 15306
A 必測項目 (a) 血脂質 - 三酸甘油酯 非酯化游離脂肪酸 總膽固醇 低密度脂蛋白及高密度脂蛋白膽固醇濃度實驗動物禁食 12 小時後, 以乙醚麻醉, 收集腹腔大動脈的血液離心後, 利用酵素法及比色原理測量血中脂質濃度 (b) 肝臟脂質 - 三酸甘油酯 總膽固醇濃度於腹腔動脈採血結束後, 以生理食鹽水沖洗後, 以 Folch 等人的方法萃取脂質後, 測量肝臟三酸甘油酯與總膽固醇濃度 (Folch et al, 1957) (c) 血糖實驗動物禁食 12 小時後, 以乙醚麻醉, 收集腹腔大動脈的血液後, 利用酵素法及比色原理測量濃度血糖濃度 (d) 肝功能 - 血中 GOT GPT 活性利用酵素法及比色原理測量血中 GOT 及 GPT 活性 (e) 腎功能 - 血中尿酸 肌酸酐濃度利用酵素法及比色原理測量血中尿酸及肌酸酐含量 (Kassieer, 1971; Tanganelli et al, 1982) B 必測項目 (a) 血中酮體濃度實驗動物禁食 12 小時後, 以乙醚麻醉, 收集腹腔大動脈的血液後, 利用酵素法及比色原理測量濃度酮體濃度 (b) 電解質平衡狀態 - 血中鈉 鉀濃度利用酵素法及比色原理測量血中鈉及鉀的含量 (Berry et al, 1988; Berry et al, 1989) 功效性指標分為必測項目及選測項目 必測項目為必定要測量之項目, 而選測項目則可依照受試物之特性及不易形成體脂肪原理, 選擇測量之項目 A 必測項目 (a) 體重實驗期間定期測量老鼠體重, 比較實驗開始時與實驗結束時之體重 (b) 攝食量及食物利用率紀錄每日之飼料攝取量, 於實驗末計算食物利用率 (feed efficiency), 計算公式如下 : Feed efficiency=(weight gain food intake) 100% (c) 體脂肪量取出實驗動物腎周圍及睪丸周圍之脂肪組織後秤重 B 選測項目 15307
(a) 脂肪細胞數目及大小取下脂肪組織, 判定脂肪細胞之數目以及大小 (b) 脂肪組織之脂解酉每活性取 0.1g 睪丸脂肪組織, 以生理鹽水洗淨後, 用濾紙吸乾水分, 秤重 然後, 以均質機將脂肪組織均質化並離心後, 取上清液, 利用比色之方法進行分析 (Morimoto et al, 2001; Morimoto et al, 1999) (c) 其他欲進一步證實受試物之特性或其不易形成體脂肪作用機轉時, 可以增加相關測量項目 例如 : 脂蛋白脂解酶 (lipoprotein lipase) 活性等 (4) 統計方法統計分析方法則可用 ANOVA 或其他科學數據常用之統計分析法, 分析組間各項數值之差異性, 並以 p<0.05 表示具有統計上的差異 3 結果判定以安全性指標作為判定實驗動物在無損害健康之情況下, 投與受試物後, 其體重及體脂肪均顯著降低者 (p<0.05), 則可判定此受試物在動物實驗中具有不易形成體脂肪效果 二 人體實驗 1 原理以單純性肥胖症患者為實驗對象, 攝取受試物後, 利用各種不易形成體脂肪指標評估其不易形成體脂肪效果以及觀察受試物對身體有無不良之影響 2 實驗材料及方法 (1) 樣本篩選條件人體實驗必須委託國內外大學食品 營養 醫學等相關研究所 醫學中心執行, 需有醫師參與, 並遵循衛生主管機關對人體實驗有關之相關規定 進行人體的臨床試驗之前應經過人體試驗委員會通過才能加以進行 參與不易形成體脂肪試驗者必須符合以下條件 : BMI 27 之單純性肥胖者 無心臟 肝臟 腎臟 內分泌及其他器官之重大疾病者 非精神病患者 沒有服用藥物 (2) 實驗分組及進行方法可採用自身對照或組間對照之方式, 根據受試者之年齡 性別 身高 體重 BMI 體脂肪以及相關之基本資料分為對照組及實驗組 每組必須大於 10 人, 且必須採用單盲或雙盲方法進行實驗 實驗期間至少 4 週 受試物之攝取方式可以分成以下兩種 : 非替代飲食之受試物 : 實驗組之受試者每天依照推薦之方式及建議量攝取受試物, 對 15308
照組則給予安慰劑 另外, 為排除飲食因素之影響, 受試者不改變原來的飲食習慣 替代飲食之受試物 : 受試者每天依照推薦之方式及建議量攝取受試物 (3) 測定項目及方法 安全性指標 A 必測項目 (a) 一般狀況 - 精神狀況 睡眠 厭食 腸胃症狀 血壓 脈搏 呼吸次數觀察並記錄受試者在實驗期間之精神狀況 睡眠 厭食以及有無其他腸胃症狀等 並定期測量血壓 脈搏及呼吸次數等 (b) 血液常規檢查 - 紅血球及白血球細胞數目 血紅素 血容比 平均紅血球體積定期抽血測量血中紅血球細胞數目 白血球細胞數目 血紅素 血容比 平均紅血球體積等項目 其測定方法, 可由實驗室用公認之方法自行分析, 或由教學醫院利用血液生化自動分析儀器分析 (c) 血液生化分析 - 血脂質 血糖 肝功能 腎功能 甲狀腺功能定期抽血測量血脂質 (TG TC free fatty acid LDL-C 及 HDL-C) 血糖 肝功能 (GOT GPT γ-gt 白蛋白) 腎功能( 尿素氮 肌酸酐 尿酸 ) 甲狀腺功能等項目 其測定方法, 可由實驗室用公認之方法自行分析, 或由教學醫院利用血液生化自動分析儀器分析 (d) 飲食紀錄實驗前 中期及後期等三個時期必須對受試者進行三天之飲食紀錄, 排除飲食習慣因子影響實驗數據之可能性 B 選測項目 (a) 血液生化分析 - 血中酮體濃度及電解質平衡狀態定期抽血測量血中酮體以及電解質 ( 鈉 鉀 ) 等項目 其測定方法, 可由實驗室用公認之方法自行分析, 或由教學醫院利用血液生化自動分析儀器分析 (b) 尿液檢查 - 酸鹼值 尿蛋白 尿糖定期收集受試者尿液分析酸鹼值 尿蛋白及尿糖等項目 可由實驗室用公認之方法自行分析, 或由教學醫院利用血液生化自動分析儀器分析 (c) 心肺功能檢查 - 心電圖 肺功能檢查定期檢測受試者之心臟功能及肺功能 心臟功能以心電圖偵測, 肺功能以肺活量 一秒用力吐氣量等項目判定 建議由醫院醫事技術人員負責檢測及判讀 功效性指標 (a) BMI 定期測量受試者之身高及體重, 計算 BMI, 觀察其變化 (b) 腰臀比定期測量受試者之臀圍及腰圍, 求出腰臀比 (c) 體脂肪 15309
定期測量受試者之體脂肪含量 可用三頭肌或肩胛骨皮下脂肪厚度表示, 亦可利用生物電阻原理或其他相關之儀器測量 (4) 統計方法統計分析方法則可用 student s t-test 或其他科學數據常用之統計分析法, 分析組間各項數值之差異性, 並以 p<0.05 表示具有統計上的差異 3 結果判定實驗組自身比較或與對照組比較, 以安全性指標判定受試者在攝取受試物後, 於無損害健康狀態之下,BMI 體脂肪及腰臀比等均有顯著降低者(p<0.05), 可判定在人體實驗具有不易形成體脂肪效果 參 參考文獻 1 Berry MN, Mazzachi RD, Pejakovic M and Peake MJ (1988) Enzymatic determination of sodium in serum. Clin. Chem. 34: 2295-2298. 2 Berry MN, Mazzachi RD, Pejakovic M and Peake MJ (1989) Enzymatic determination of potassium in serum. Clin. Chem. 35: 817-820. 3 Floch J, Lees M and Stanley GHS (1957) A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissue. J.Bio.Chem. 226: 497-502. 4 Huang PC, Yu SL, Lin YM and Chu CL (1992) Body weight of Chinese adults by sex, age and body height and criterion of obesity based on body mass index. Nutr. Sci. J. 17: 157-172. 5 Kassirer JP (1971) Clinical evaluation of kidney function--tubular function. New Eng. J. Med. 285: 499-502. 6 Levin BE and Dunn-Meynell AA (2002) Reduced central leptin sensitivity in rats with diet-induced obesity. Am. J. Physiol.-Regul. Integr. Comp. Physiol. 283: R941-948. 7 Lindsted K, Tonstad S and Kuzma JW (1991) Body mass index and patterns of mortality among Seventh-day Adventist men. Int. J. Obes. 15: 397-406. 8 Lott JA, Patel ST, Sawhney AK, Kazmierczak SC and Love JE Jr (1986) Assays of serum lipase: analytical and clinical considerations. Clin. Chem. 32: 1290-1302. 9 Manson J E, Stampfer MJ, Hennekens CH and Willett WC (1987) Body weight and longevity. A reassessment. JAMA 257: 353-358. 10 Miao MS (1997) Experimental animals and the technique, pp127-132, China Renmin Press. 11 Morimoto C, Kameda K, Tsujita T and Okuda H (2001) Relationships between lipolysis induced by various lipolytic agents and hormone-sensitive lipase in rat fat cells. J. Lipid Res. 42: 120-127. 12 Morimoto C, Sumiyoshi M, Kameda K, Tsujita T and Okuda H (1999) Relationship between hormone-sensitive lipolysis and lipase activity in rat fat cells. J. Biochem. 125: 976-981. 13 Ricci MR and Levin BE (2003) Ontogeny of diet-induced obesity in selectively bred Sprague- Dawley rats. Am. J. Physiol.-Regul. Integr. Comp. Physiol. 285: R610-618. 15310
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健康食品之調節血糖功能評估方法修正草案 壹 前言根據統計, 全球罹患糖尿病的人數高達 1.35 億 ~1.6 億 以美國 加拿大為例, 糖尿病就位居該國十大死因的第三位, 僅次於心血管疾病及癌症之後 在我國, 根據本署的統計, 糖尿病居十大死因的第四位 台灣地區的糖尿病型態以第二型糖尿病 (type 2 DM) 為主, 約佔罹患率的 95% 左右 從罹患情形來看, 居住都市者明顯高於居住鄉村者, 體型肥滿者亦有此較高的傾向, 顯示糖尿病是都市化 工業化的一種文明病 糖尿病的病症除了有過高的血糖濃度及明顯的尿糖外, 糖尿病最可怕的是會引起一些併發症, 如視網膜症 腎症 神經障害 乃至於腦及循環系統的障害 因此如何控制血糖, 使血糖調節到一定的濃度以避免併發症的發生則是糖尿病控制的原則之一 到目前為止, 糖尿病的治療基本上有三大方法, 分別是 (1) 飲食療法 (2) 運動療法 (3) 藥物療法, 其中以飲食療法為最基本也是最重要的療法 據估計, 約 50% 以上的患者可以因良好的飲食療法而改善病情 此外, 在進行藥物療法時, 飲食療法亦非常重要 如果沒有適當的飲食療法配合, 藥物也將無法發揮其功能 因此對糖尿病患者而言, 如何透過良好的飲食療法使血糖濃度得到良好的控制是最基本也是最重要的課題 在可見的未來, 糖尿病患者必將逐年上升, 因此如何透過健康食品的研究與開發, 使患者的生活品質及健康得到更好的保障應該是政府 學界與業者共同努力的目標 血液中主要醣類為葡萄糖 由實驗動物模式或人體試食實驗的研究, 經由觀察空腹血糖值 葡萄糖耐量 飲食耐量 醣化血色素或其他一般生化分析等項目, 可瞭解受試物是否具有調節血糖作用 廠商除提供與其產品相關之資料與文獻, 以佐證該產品或其部分原料可能具有調節血糖作用之功能外, 必須針對擬以 健康食品 上市之產品, 進行下列所規定之 動物實驗 或 人體試食試驗 若所提產品的相關科學研究證據不甚明確時, 宜同時進行 動物實驗 和 人體試食試驗 以加強證據之可信度 貳 實驗項目與實驗方法一 動物實驗 ( 一 ) 實驗動物使用高血糖動物, 雌雄均可, 但須使用單一性別,6 週齡以上之小鼠 (mouse) 或大鼠 (rat), 每組 8 隻以上 ( 二 ) 給受試物的時間和劑量分組以長期 (14 天以上 ) 口服方式投予受試物 ; 受試物劑量 (g/kg) 除對照組外, 需有 3 個劑量組以上, 其中 1 個劑量 ( 每公斤體重克數 ) 應相當於人體推薦攝取量之 5-10 倍左右 受試物之給予依下列不同實驗動物模式, 在血糖變異之前及之後進行 ( 三 ) 實驗方法 15312
1 實驗動物 (1) 遺傳性自發高血糖動物此類動物包括 :1 肥胖非胰島素缺乏型動物, 例如 : 肥胖小鼠 (ob/ob) 糖尿病小鼠 (db/db) 及肥胖黃小鼠 (A vy );2 非肥胖型動物, 例如 :BB 大鼠及中國倉鼠 (Cricetulus griseus) (2) 化學物誘導糖尿病動物常用的化學物為 Streptozotocin( 簡稱 STZ) STZ 溶於生理食鹽水, 並含有檸檬酸鈉 (10 mm) 為緩衝 (ph 4.5), 以靜脈 (25~55mg/kg) 或腹腔 (55~75mg/kg) 注射方式給予動物 ( 小鼠或大鼠 ) 待一星期後, 採血測量隔夜空腹 (17~24 小時 ) 血糖值, 若達或超過 13 mm(230+10 mg%) 時, 則視為有糖尿病 (3) 其他動物模式例如使用非胰島素依賴型 ( 第二型 ) 糖尿病動物 : 給予實驗動物 STZ(65 mg/kg) 加上 Nicotinamide(230 mg/kg) 若達或超過 13 mm(230+10 mg%) 時, 則視為有糖尿病 2 調節血糖作用之測試 (1) 空腹血糖值測定高血糖動物給予受試物一定時間後, 採血測定隔夜空腹血糖值 測定方法目前常用的是酵素法, 有下列三種情形 : 1 葡萄糖氧化酵素法 (glucose oxidase assay): 葡萄糖經葡萄糖氧化酵素 (glucose oxidase) 催化作用而被氧化成葡萄糖醛酸和 H 2 O 2, 再經由 H 2 O 2 的測定而求出血糖濃度 2 己糖激酵素法 (hexokinase assay ): 葡萄糖在 ATP 存在下受己糖激酵素 (hexokinase) 催化成葡萄糖 -6- 磷酸鹽 (G-6-P) 再經由 G-6-P 與 NADP + 反應生成之 NADPH 的測定, 即可定量出血糖濃度 3 葡萄糖去氫酵素法 (glucose dehydrogenase assay): 葡萄糖與 NAD(P) + 經葡萄糖去氫酵素 (glucose dehydrogenase) 作用生成 NAD(P)H 再經由 NAD(P)H 量的測定, 即可定量出血糖濃度 (2) 葡萄糖耐量測定 (Glucose tolerance test) 以口服 (1 g/kg) 靜脈注射(0.5 g/kg) 或腹腔注射 (0.5 g/kg) 方式給予實驗動物葡萄糖, 然後分別在給糖前及給糖後的 30 60 90 120 和 180 分鐘採血測定血糖值 (3) 其他測定尿糖值 餐後血糖值 空腹及餐後血漿胰島素 等 ( 應視產品特性及相關考量加測, 以增強實驗報告之效力 ) ( 四 ) 數據處理和結果判定依一般生物統計方法分析 根據試驗前後上述空腹血糖值及葡萄糖耐量或飲食耐量後 15313
血糖 ( 即餐後血糖 ) 及葡萄糖耐量測定結果為統計上具顯著差異者 (p<0.05), 可初步判定該受試物具有調節血糖作用 二 人體試食試驗必須委託國內外大學食品營養 醫藥等相關研究所 醫學中心或其他中央衛生主管機關認可之研究機構執行, 需有醫師參與, 並遵循衛生單位對保健食品人體實驗有關之相關規定 進行人體的臨床試驗之前, 應經過相關人體試驗委員會審核通過才能加以進行 ( 一 ) 受試者參加人體試食試驗之受試者為血糖值偏高者或臨床上判定為輕微糖尿病症者且應本著自覺自願的原則 受試物組和對照組必須是同一年齡層次 同一性別, 依照人體推薦攝取量給予受試物或安慰劑 ( 外觀 味道 顏色等需與受試物一樣 ), 受試期間 1 至 3 個月, 且受試人數每組至少 20 人 ( 二 ) 實驗方法 1 空腹 8 小時後之葡萄糖耐量試驗或飲食耐量試驗建議在整晚空腹至少 8 小時後, 次日上午以 75 g 葡萄糖或固定熱量飲食 ( 約 250-350 卡 ) 方式給予受試者, 然後分別在空腹及葡萄糖耐量試驗或飲食耐量試驗後 120 分鐘採血測定血糖值 2 醣化血色素(glycosylated Hb) 測定正常人血液約有 3-6% 的血色素被醣化成 HbA 1 c, 而糖尿病患者則隨血糖升高, HbA 1 c 可能提高 2-3 倍 選用高血糖症之受試者試食受試物, 觀察醣化血色素變化 參考之測定方法有下列幾種 : (1) 比色法 : 醣化血紅素經氧化 水解使變成為 5-hydroxymethylfufural, 此物再和 2-thiobarbituric acid 產生顏色反應, 比色而測得 HbA 1 (2) 電泳法 : 利用 agarose gel ph 6.3, 進行血色素電泳分析 (3) 圓柱層析法 : 利用 KCN 和醣化血色素反應產生 CN- 醣化血色素, 然後通過陽離子交換樹脂圓柱層析, 在適當 ph 下, 使醣化血色素先析出, 以比色法測出各醣化血色素之百分比 (4) 陽離子交換高效液相層析法 (HPLC 法 ): 利用 phosphate cyanide 緩衝液 Bio-Rex 70 陽離子交換樹脂及 400 psi 壓力, 分離各種 HbA 1 3 一般生化測定血糖 血脂 血紅蛋白 總蛋白測定 尿酸和酮體 等 ( 應視產品特性及相關考量加測, 以增強實驗報告之效力 ) ( 三 ) 數據處理和結果判定依一般生物統計方法分析 根據試驗前後上述空腹血糖或葡萄糖耐量後或飲食耐量後血糖 ( 即餐後血糖 ) 或醣化血色素試驗結果為統計上具顯著差異者 (p<0.05, 即可判定該受試物具有調節血糖作用 15314
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健康食品之調節血脂功能評估方法修正草案 壹 前言 2001 年, 腦血管疾病與心臟疾病分佔國內十大死因的第二與第三位 (1), 雖無論腦血管疾病或心臟疾病都是由多項因子交互作用所導致, 但根據許多研究資料顯示動脈粥狀硬化 (Atherosclerosis) 是導致這些血管疾病的最主要原因 在動物實驗, 常以直接解剖或間接測定的方式來探討動脈粥狀硬化的構致導因或危險因子程度 ; 但在人體試驗, 通常只能採間接的方式, 主要常包括測定血清或血漿之各種脂質或脂蛋白 (Lipoproteins) 的含量, 以及其低密度脂蛋白 (LDL) 氧化程度或對氧化之敏感度, 來評估其可能罹患動脈粥狀硬化的危險機率 血清脂質主要包括三酸甘油酯 (Triacylglycerols ) 膽固醇(Cholesterol ) 磷脂質 (Phospholipids) 和游離脂肪酸 (Free fatty acids) 等 三酸甘油酯和膽固醇 (70-75% 以膽固醇酯型態存於血液中 ) 無法溶解於水性的血漿中, 故需藉由蛋白質和磷脂質等兩性乳化劑包圍在外側而形成可親水性的脂蛋白顆粒, 才能溶解於血漿中, 而隨著血液循環運送至身體的各器官組織中 血漿中之脂蛋白依其顆粒大小或密度, 可分為乳糜粒 (Chylomicrons) 極低密度脂蛋白 (Very low density lipoproteins;vldl) 低密度脂蛋白(Low density lipoproteins,ldl) 高密度脂蛋白 (High density lipoproteins; HDL) 人類血漿脂蛋白的物理特性和其組成大致如表 1 (2) : 表 1. 人類血漿脂蛋白的物理特性與組成 ( 重量百分比 ) 脂蛋白 平均直徑密度蛋白質三酸甘油酯膽固醇磷脂質 (nm) (g/ml) (%) (%) (%) (%) 乳糜粒 100-1000 <0.95 1-2 87 3 8 VLDL 43 0.95-1.006 10 55 17 18 LDL 24-26 (3) 1.006-1.063 25 8 45 22 HDL 7-11 (3) 1.063-1.210 44 3 23 30 From: Thompson, G.R., Handbook of Hyperlipidemia, 1989 如加以細分時, 密度在 1.006-1.019g/ml 部分可歸為中密度脂蛋白 (Intermediate density lipoproteins; IDL), 密度在 1.019-1.063g/ml 部分才算為 LDL 不同物種的哺乳類或實驗動物之血漿脂蛋白之密度可能會略有差異, 但許多研究還是沿用人類的密度來分離 (4,5), 不過亦有針對該動物種類而選用特殊密度範圍者, 例如選用 1.020-1.055 g/ml 來分離倉鼠之 LDL (6) 低密度脂蛋白含大量的膽固醇 ( 佔血漿總膽固醇的 60-70%), 具有趨動脈粥狀硬化特質, 較容易穿透進入血管壁內 (7) 當其中的脂質被氧化形成 oxldl, 而被穿透進入血管壁下方的巨噬細 15316
胞 (Macrophages) 所吞食, 形成泡沫細胞 (Foam cells), 再經一連串變化而形成動脈粥狀硬化, 因此目前認為 LDL 的氧化修飾是引發初期動脈粥狀硬化病變的最主要導因 (Key step) (8-11) 相反的, 高密度脂蛋白含較多量的磷脂質 ( 約 30%) 與較少量的膽固醇 ( 佔血漿總膽固醇的 20-30%), 從肝臟和小腸釋出進入血液循環後, 從周邊組織移走多餘的膽固醇, 因此具有可減少膽固醇在血管壁沈積的作用 (7) 目前, 已普遍接受如果血漿總膽固醇 (TC) 或低密度脂蛋白膽固醇 (LDL-C) 過高是導致動脈粥狀硬化疾病的正相關危險因子 ; 而升高血漿高密度脂蛋白膽固醇 (HDL-C) 或 HDL-C/LDL-C 的比率, 則是導致動脈粥狀硬化疾病的負相關危險因子 (12) 但是血漿 LDL 中含太少量的抗氧化劑 含太高比率的多元不飽和脂肪酸 (PUFAs) 或血漿中太高濃度的 Cu ++ Fe ++ 等因素, 會導致 LDL 容易氧化, 更是產生動脈粥狀硬化的最重要正相關危險因子 (8-11) (7) 我國與歐洲動脈硬化學會 (European Atherosclerosis Society) 將血脂異常分成三類 :(1) 高膽固醇血症 : 血漿總膽固醇 (TC)>200 mg/dl;(2) 混合型高脂血症 : 血漿總膽固醇 (TC)> 200 mg/dl 三酸甘油酯(TG)>200 mg/dl;(3) 高三酸甘油酯血症 : 血漿三酸甘油酯 (TG)> 200 mg/dl, 且高密度脂蛋白膽固醇 (HDL-C) <35 mg/dl 或 TC/HDL-C>5 美國國家膽固醇教育計畫學程 (American National Cholesterol Education Program) 則依 TC LDL-C 和 HDL-C 濃度分為 :(1) 理想膽固醇濃度 :TC<200 mg/dl 或 LDL-C<130 mg/dl;(2) 邊緣型高膽固醇濃度 : TC =200-239 mg/dl 或 LDL-C=130-159 mg/dl;(3) 過高的膽固醇濃度 :TC 240 mg/dl 或 LDL- C 160 mg/dl;(4) 過低的高密度脂蛋白膽固醇濃度 :HDL-C<35 mg/dl 膽固醇除了部分由飲食攝入體內 ( 通常佔體內每天代謝量之 30% 左右 ) 外, 大部分乃由肝臟和小腸細胞所合成 血漿中膽固醇濃度不會立即受到飲食中膽固醇多寡的影響 (7) 三酸甘油酯在肝和脂肪細胞內持續不斷的由血漿脂肪酸和醣的代謝物再酯化合成, 作為生理能量的儲蓄資源 肝臟為了避免堆積過多的三酸甘油酯, 可藉由極低密度脂蛋白 (VLDL) 的分泌將之排出, 而飲食中的三酸甘油酯可很容易影響到血液中的濃度, 另攝取大量的酒精或醣類的食品, 亦可在短時間內大幅提高血清三酸甘油酯的濃度 持續的高濃度血清三酸甘油酯, 可導致肝細胞中堆積過多的三酸甘油酯, 而引起脂肪肝 (Fatty liver) 之病變 (7) 糖尿病患者常伴有血脂異常, 例如第二型糖尿病患者有 VLDL-TG 偏高 HDL-C 偏低和出現小而密的 LDL(small, dense LDL) 等三種脂蛋白代謝異常特徵 (3) 貳 評估食品樣本是否具有調節血脂質功能之檢測方法 : 廠商除須提供與其產品相關之資料與科學文獻, 以佐證該產品或其部分原料可能具有調節血脂質之功能外, 必須針對擬以 健康食品 上市之產品, 進行至少包括下列所規定之 人體實驗 或 動物實驗 之一 若過去的科學文獻對所提產品的特性瞭解不足時, 應同時進行 人體實驗 和 動物實驗, 以加強證據之可信度 本辦法所建議之檢測項目並非每項都必須進行 但欲對產品加以宣稱 廣告或介紹其具有某項生理機能時, 則必須提出相符且足夠之科學證據來支持 通常適當的檢測項目越多, 其證據越明確 一 人體實驗 : ( 一 ) 必須委託國內外大學食品營養 醫藥等相關研究所 醫學中心或其他中央衛生主管機關認 15317
可之研究機構執行, 需有醫師參與, 並遵循衛生單位對保健食品人體實驗有關之相關規定 ( 二 ) 每組人數 8 人 實驗對象與人數視實驗特性與設計之周密性而定, 採用血脂異常病患時, 宜考慮選用同型 ( 例如 Type IIb) 者 ( 三 ) 實驗期 4 週 實驗前必須有一適當的穩定期, 以獲得受試者之血脂質值作為基礎線, 才開始進行攝食含欲檢測產品之飲食 實驗後, 宜有一適當的恢復期, 以觀察停止攝取檢測之產品後, 血脂質恢復之情形作為參考 ( 四 ) 實驗前 實驗期和實驗後除檢測之樣品外, 得按受試者按原飲食習慣攝食, 但必須維持每天相近穩定之飲食型態 ( 例如應盡量避免應酬和外食 ) 與營養攝取, 且不得有太明顯干擾血脂質之因子 ( 含運動量 ) 實驗採自體比較的方式, 若其於實驗後比實驗前有明顯 (P< 0.05) 改善, 則可認定該產品具有該項生理功能 二 動物實驗 : ( 一 ) 以測定生化指標為主的實驗應採用倉鼠 (Hamster), 進行其他指標實驗者可採用其他適宜之實驗動物 ( 二 ) 動物必須來自公立研究機構 公私立大學或其他中央衛生主管機關認可之實驗動物中心 ( 三 ) 每組動物 8 隻 ( 四 ) 建議實驗飼料應有 2-3 組高低不同的欲測保健食品劑量進行實驗, 實驗後廠商得由所獲結果來推估該產品的適當建議攝取量 ( 以每人每日攝取 500 克乾重食物為基準 ) 但若試驗樣品之主成分過去已有研究文獻 實驗報告或已有相似的產品已通過 健康食品 的認證等參考資料, 可預估能顯示其生理功能的適當劑量 ; 或該產品已上市而欲證實其所建議的劑量能顯示擬宣稱的生理功能時, 實驗得採用單劑量 ( 五 ) 從 天然食品 中經萃取濃縮製成之產品, 當以動物實驗來檢測其生理功能時, 建議人攝取劑量應為動物適當劑量的 1-1/2 倍 ( 即動物實驗劑量為人攝取劑量的 1-2 倍 ); 而產品之主成分除脫水外, 保有大部分的天然食品成分時, 則其建議人攝取劑量得為動物適當劑量的 1-1/5 倍 ( 即動物實驗劑量為人攝取劑量的 1-5 倍 ) ( 六 ) A. 實驗可採先餵一合理範圍之高油脂 ( 倉鼠實驗得添加 0.2% 的膽固醇 ) 飼料, 使動物升高其血清脂質 ( 可由尾巴採血或另分一組動物來確定 ), 才開始正式實驗 實驗期以相同之高油脂飼料為基礎飼料 實驗結束時, 如攝取含檢測食品之飼料組的血脂質明顯 (P< 0.05) 比控制組低, 則可認定該產品具降低血脂質之功能 B. 實驗亦可採以血脂質正常的動物來進行, 基礎飼料可為高油脂 ( 得添加 0.2% 的膽固醇 ) 飼料 經飼養適當週數後, 控制組之血脂質會逐漸上升, 若攝取含檢測樣品飼料的實驗組, 其血脂質明顯 (P<0.05) 低於控制組, 則可認定該產品具降低血脂質之功能 ( 七 ) 實驗期 4-8 週或是視實驗需要而定 ( 八 ) 實驗必須記錄每隻動物之體重改變與平均每日飼料攝取量 三 血脂質測定指標 : 15318
( 一 ) 包括血清 ( 或血漿 ; 以下皆同 ) 三酸甘油酯 (TG) 總膽固醇(TC) 高密度脂蛋白膽固醇 (HDL-C) 和低密度脂蛋白膽固醇 (LDL-C) 值 動物實驗另應依受試樣品調節血脂功效之可能作用機制, 加測其肝臟 ( 糞便 ) 三酸甘油酯和膽固醇, 以了解受試樣品是否會造成肝脂肪的堆積 ( 二 ) 人體或動物實驗中, 若測定 LDL 對氧化之穩定度, 當實驗組之 LDL 被氧化所需之誘發時間 (Lag phase) 比控制組顯著延長 (P<0.05) 時, 則可宣稱 攝取該產品可延緩低密度脂蛋白之氧化 實驗亦可測其 LDL 之 TBARS 值供參考 四 血脂質測定方法 : (7) 抽取血液樣品前, 以空腹 12-14 小時為原則, 但得視實驗特性而改變 實驗報告必須詳細載明所採用之分析方法 測定血清或血漿中脂質和脂蛋白濃度, 以及 LDL 氧化的測定方法得採用當時一般學術界和醫學檢驗機構普遍採用或認可之方法, 以下所附之方法僅供參考用 得使用適當的市售生化試劑 (Test kits) 直接測定, 如能以超高速離心方式, 將各密度之脂蛋白加以分離, 然後再分別測定各不同密度脂蛋白所含膽固醇量, 則更佳 ( 一 ) 血清三酸甘油酯 (Serum Triacylglycerol,TG) 利用酵素法 (GPO-PAP) (13), 在定量的血清中加入呈色劑, 經 22-25 下水浴, 以分光光度計於波長 500 nm 下測定, 經計算後可得 TG 的濃度 (9) ( 二 ) 血清總膽固醇 (Serum Total Cholesterol; TC) 採用 Enzymatic colorimetric method (14), 於定量的血清中加入呈色劑, 置於 37 水浴, 作用之後可產生紅色化合物, 於 500 nm 波長下測定其吸光度, 而換算得知血清總膽固醇的濃度 ( 三 ) 血清高密度脂蛋白膽固醇 (Serum HDL-C) 1 利用酵素作用及比色測定之原理 (14), 先取定量的血清加入適當的沈澱劑, 將 Chylomicrons 極低密度脂蛋白(VLDL) 及低密度脂蛋白 (LDL) 沈澱, 作用完全之後將其離心, 取定量上清液並加入測定膽固醇之試劑, 在波長 500 nm 下測定吸光值, 經計算後可得 HDL-C 的濃度 2 以簡易沈澱法測定人類的 HDL-C (17, 18) : 由於許多實驗室或醫院並沒有昂貴的超高速離心機, 因此可以考慮採用簡易的沈澱法來測定人類的 HDL-C 本方法的基本原理是利用試劑與 VLDL 和 LDL 表面的 Apolipoprotein B 結合, 而使 VLDL 和 LDL 沈澱, 因此可取得只含 HDL 的上層液 目前在市面上較普遍的沈澱試劑有 (1)Sodium phosphotungstate-magnesium chloride; (2)Dextran sulfate-magnesium chloride;(3)heparin-manganese chloride;(4)haparincalcium chloride;(5)polyethylene glycol 到底那一沈澱試劑最好, 目前沒有定論 但根據 American Association for Clinical Chemistry 於 1994 刊出的 Laboratory Measurement of Lipids, Lipoproteins and Apolipoproteins(Edited by N. Rifai and G. R. Warnick) 所引述的調查數據, 大約有 55% 的實驗室是採用上述第一項的 Sodium phosphotungstate-magnesium chloride; 而約有 30% 採用第二項的 Dextran sulfate-magnesium chloride 因此本功能評估方 15319
法推薦盡量一致採用最普遍被採用的 Sodium phosphotungstate- magnesium chloride 沈澱試劑之方法 測定時, 除小心按商業試劑所附的檢測步驟來進行, 以及必須很精確取樣和試劑量外, 特別要提醒注意 (1) 血液樣品盡量採用血清 (serum) 或非使用 EDTA 取得的血漿 (plasma), 以免殘留的 EDTA 與沈澱試劑結合, 而導致 VLDL 和 LDL 沒完全沈澱, 以致高估了 HDL-C 值 ;(2) 要預備新鮮的試劑 ;(3) 要讓樣品與試劑回溫到室溫才進行 ( 即前後要盡量恆溫 );(4) 使用精確的 dispenser 來定量取樣 ;(5) 沈澱作用後, 以 1,500 x g 在 4 離心 45 分鐘 必須作用時間 離心速率 溫度 時間與每一步驟都應一致, 才能達到較高的再現性 (reproducibility);(6) 需很小心的取出上層液, 轉移至一適當的容器 ;(7) 測得的膽固醇濃度必須再乘上該步驟中的稀釋因子 ( 四 ) 血清低密度脂蛋白膽固醇 (Serum LDL-C) 1 利用酵素作用及比色測定之原理 (14), 取定量之血清加入適當的沈澱劑將 LDL 沈澱, 作用完全之後將其離心, 取定量上清液並加入測定膽固醇之試劑, 在波長 500 nm 下測其吸光值, 經計算後, 再以總膽固醇值扣除上清液膽固醇值, 可得 LDL-C 的濃度 2 由簡易沈澱法估算人類的 LDL-C (17, 18) : 目前並沒有一簡易方法可獲得 LDL 層來供檢測, 而 Friedwald 等人於 1972 年提出一簡易的估算法, 其理論基礎是人類血漿中的 TG 大部分是存在於 VLDL, 且 VLDL 中 TG 與 Cholesterol 的重量比例大約為 5:1 由於血漿中的 TC total TG 與 HDL-C 值 ( 藉沈澱法 ) 均可測得, 且 TC=VLDL-C + LDL-C+HDL-C( 將 IDL-C 併到 LDL- C), 以及 VLDL-C=(plasma total TG)/5, 所以 LDL-C=TC-HDL-C-(plasma total TG)/5 由於上述的二個假設並不精確, 因此求得的計算值 LDL-C 只是一近似值 Friedwald 等人比較了不同型態高血脂症與正常人樣品的計算值與測定值, 發現除了血液樣品中含有明顯量的 Chylomicrons 或血漿 TG>400 mg/dl 之外, 大致上計算值與測定值相近 如沒要求數值很精確, 可以於測得血漿之 Total cholesterol (TC) Total triacylglycerols(tg) 及 HDL-C 之後, 以 LDL-C=TC-HDL-C-(plasma total TG)/5 之公式, 求得 LDL-C 的估算值 目前本估算方法在醫院的臨床檢測上普遍被使用 此估算 LDL-C 方法, 不一定能適用於一些動物系統中 ( 五 ) 血清低密度脂蛋白 ( 人体 1.006-1.063 g/ml 或 1.019-1.063 g/ml; 或倉鼠 1.020-1.055 g/ml) 分離方法 : 1 取 2 ml 全血, 於 4 C 以 2,100 X g 離心 15 分鐘 2 約可取得 1 ml 的血清 ( 或血漿 ), 取 10ul 做總膽固醇之測定 3 從每樣品取 0.5 ml 血清至於超高速離心管中, 加入 2.5 ml 密度為 1.006 g/ml 之 NaBr 溶液, 在 4 C 下, 以 120,000 x g 離心 16 小時 ( 或 453,000 x g, 離心 3.5 小時 ), 取浮於最上層部分約 0.5ml, 得密度 1.006 g/ml 之 VLDL 若欲獲得人体 1.019-1.063 g/ml 或倉鼠 1.020-1.055 g/ml 之 LDL 時, 本步驟可直接加密度為 1.019 g/ml 或 1.020 之 NaBr, 相同條件離心後可得人体 1.019 g/ml 或倉鼠 15320
1.020 g/ml 之 VLDL+IDL 4 需要時, 可由該層取 20 ul 定量其膽固醇等 5 假設剩下之溶液為 2.5 ml, 再加入密度 1.348 g/ml( 倉鼠 1.230 g/ml) 之 NaBr 溶液 0.5 ml, 得總體積 3 ml 溶液 其計算方法為 1.006 g/ml x 2.5 ml+1.348 g/ml x 0.5 ml=1.063 g/ml x 3 ml; 或倉鼠 1.020 g/ml x 2.5 ml+1.230 g/ml x 0.5 ml=1.055 g/ml x 3 ml 6 再於 4 下, 以 120,000 x g 離心 20 小時 ( 或 453,000 x g, 離心 3.5 小時 ), 得密度 1.006 g/ml<d 1.063 g/ml 之 LDL 約 1 ml 可取 20 ul 之 LDL 定量其膽固醇等 7 假定剩下溶液有 2 ml, 可再加入 1.5 ml 密度 1.406 g/ml 之 NaBr 溶液, 得總體積為 3.5 ml 之溶液 8 重複於 4 下, 以 120,000 x g 離心 20 小時 ( 或 453,000 x g, 離心 3.5 小時 ), 得密度 1.063 g/ml<d 1.210 g/ml 之 HDL 約 0.5 ml 可取 20 ul 之 HDL 定量其膽固醇等 9 計算 VLDL LDL 和 HDL 膽固醇濃度時, 須注意單位之換算 註 : 當上述方法操作時, 若所得各分離層體積有變動或欲取得密度不同之實驗動物之脂蛋白時, 所需加入 NaBr 之密度與量可以下列公式來計算 : D-D 1 V 2 =V 1 ------------------- D 2 -D V 1 = 原溶液體積 V 2 = 須加入 NaBr 溶液體積 D = 最終所欲獲得溶液之密度 D 1 = 原溶液密度 D 2 = 加入 NaBr 溶液之密度 ( 六 ) 血清低密度脂蛋白氧化 (Serum LDL Oxidation) 之測定 : 採銅離子誘導 LDL 氧化之延滯期 (Lag phase) 方法 (15,16) 取適量透析後之 LDL, 以 ph7.0-7.4 之 Phosphate buffered-saline(pbs) 調整其濃度, 使最終濃度約 50µg/ml, 誘導氧化之最終銅離子濃度為 1.67~25µM 之內 於波長 232 nm 每固定時間測定其吸光值變化, 直至 Conjugated dienes 生成量達最高, 不再有明顯變化為止 計算出誘導低密度脂蛋白氧化之 Lag phase( 以 Propagation phase 的切線對 X 軸之截距代表 Lag phase) 亦可測 TBARS 或其他適當值對時間的變化作為 LDL 對氧化穩定度之指標 (15) 參 宣稱 廣告與產品標示 : 食品進行以本評估方法推薦之實驗或以更嚴謹之其他被醫學或相關科學界所認可的實驗或檢測方法, 且得明確之結果時, 得向中央衛生主管機關申請與實驗結果相符的宣稱 廣告或產品介紹, 例如僅降低血清三酸甘油酯者, 不得廣泛宣稱能降低血脂肪, 以免誤導以為亦可降低血清膽固醇等其他脂肪 凡經人體實驗證實, 有兩項結果對調節血脂具正面調控之意義者, 且其中一項為能降低血清 LDL-C( 同時可誘升 HDL-C 更佳 ) 或延緩 LDL 氧化的產品, 得宣稱 廣告或介紹 攝取本產品可能可減少發生腦心血管疾病或動脈粥狀硬化的危險因子 或其他相近有科學依據 15321
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