2 研究论文 surface antigen CD44 and CD73 of BMSCs were positive in the group. The CFU-F assay showed that the BMSCs obtained from the group reduced the am

2015-11-12 12:46:03 http://www.cnki.net/kcms/detail/31.2035.q.20151112.1246.014.html 中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2015, 37(11): DOI: 10.11844/cjcb.2015.11.0280 激素性股骨头坏死患者骨髓间充质干细胞体外增殖分化能力的研究 康少平 1 刘淑艳 1 李永升 2 李萍 1* ( 1 河北北方学院医学检验学院, 张家口 075000; 2 张家口市第二医院骨外科, 张家口 075000) 摘要通过对激素性股骨头坏死患者股骨头部骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs) 增殖及成骨 成脂分化能力的研究, 探讨激素性股骨头坏死的发病机理及自体 BMSCs 移植治疗股骨头坏死的可行性 选择激素性股骨头坏死患者 10 例, 无股骨头坏死的股骨颈骨折患者 10 例作为对照组 两组患者在行全髋关节置换术中抽取股骨头部骨髓血, 密度梯度离心法分离 BMSCs 并培养至第 3 代细胞, 流式细胞仪检测细胞特异性表面抗原, 成纤维细胞 集落形成实验以及成骨 成脂诱导培养后分析细胞的增殖及成骨 成脂分化能力 结果显示, 股骨头坏死组细胞表达 BMSCs 特异性表面抗原 CD44 CD73; 股骨头坏死组 BMSCs 形成集落数明显低于对照组 ; 股骨头坏死组碱性磷酸酶活性和钙结节数均低于对照组 ; 股骨头坏死组的成脂细胞数明显高于对照组 该研究结果表明, 激素性股骨头坏死患者股骨头 BMSCs 的增殖及成骨分化能力下降, 但其成脂分化潜能增强, 推测 BMSCs 增殖及分化能力的改变可能参与激素性股骨头坏死病理生理过程 关键词激素性股骨头坏死 ; 骨髓间充质干细胞 ; 增殖 ; 分化 The Ability of Proliferation and Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells In Vitro in Steroid-induced Osteonecrosis of Femoral Head Kang Shaoping 1, Liu Shuyan 1, Li Yongsheng 2, Li Ping 1 * ( 1 College of Lab Medicine, He Bei North University, Zhangjiakou 075000, China; 2 Department of Orthopedics, the Second Hospital of Zhangjiakou, Zhanjiakou 075000, China) Abstract To explore the pathogenesis of steroid-induced osteonecrosis of femoral head () and the feasibility of autologous bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) transplantation treatment for those patients with the by studying the ability of the proliferation, osteogenic and adipogenic differentiation of BMSCs which were isolated from femoral heads of patients with steroid-induced. 10 patients with steroid-induced were selected and 10 patients with femoral neck fractures without were treated as the control group. Bone marrow blood of the femoral heads were collected during the total hip arthroplasty (THA). The BMSCs were isolated by density gradient centrifugation method and cultured to the 3rd passage. The specific antigens on cell surface were detected by flow cytometry. The ability of proliferation, osteogenic and adipogenic differentiation were analyzed by colony-forming unit fibroblast (CFU-F) assay, osteogenic and adipogenic induction. The results showed that specific 收稿日期 : 2015-08-21 接受日期 : 2015-10-08 张家口市科学技术研究与发展计划项目 ( 批准号 : 1321052D) 资助的课题 * 通讯作者 Tel: 0313-4029271, E-mail: zjkliping@163.com Received: August 21, 2015 Accepted: October 8, 2015 This work was supported by the Science Technology Research and Development Program of Zhangjiakou (Grant No.1321052D) *Corresponding author. Tel: +86-313-4029271, E-mail: zjkliping@163.com

2 研究论文 surface antigen CD44 and CD73 of BMSCs were positive in the group. The CFU-F assay showed that the BMSCs obtained from the group reduced the amount of colonies compared with the control group. The alkaline phosphatase activity and the calcium nodules of group were lower than the control group. But the BMSC S of group had the higher ability to produce lipid droplets than the control group. These results showed that BMSCs from patients with steroid-induced possess reduced proliferation activity and less capability to differentiate into osteoblasts but more potential to differentiate into adipocytes. The changes of BMSCs proliferation and differentiation ability may be involved in the pathophysiological process of steroid-induced. Keywords steroid-induced osteonecrosis of femoral head; bone marrow mesenchymal stem cell; proliferation; differentiation 股骨头坏死 (osteonecrosis of femoral head, ) 是指由于股骨头血供中断或受损引起骨细胞及骨髓成分死亡及随后的修复, 继而导致股骨头结构改变 [1] 股骨头塌陷 关节功能障碍的疾病 按照发病机理可将股骨头坏死分为创伤性与非创伤性, 非创伤性股骨头坏死的常见原因有激素使用 酗酒等 目前, 激素性股骨头坏死的发病率占非创伤性股骨头 [2] 坏死首位, 但其详细发病机理尚不清楚 许多研究提出, 骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs) 的增殖与分化能力改变与激素性 [3,13] 股骨头坏死的发生相关 BMSC S 是一种具有自我更新及多向分化能力的多能干细胞, 在不同的诱导条件下可以分化为成骨细胞 软骨细胞 脂肪细胞以及血管内皮细胞等 [4] 多种细胞, 而且 BMSCs 在骨折愈合的初期及骨骼 [5] 修复的过程中可能发挥重要的作用 目前, 临床上 [6-7] 尝试使用患者自体 BMSCs 治疗股骨头坏死, 使其向成骨细胞和血管内皮细胞分化, 但治疗的前提是获得增殖与分化能力正常的 BMSCs 因此, 本研究观察激素性股骨头坏死患者股骨头部 BMSCs 的增殖及成骨 成脂分化能力, 探讨激素性股骨头坏死的发病机理, 并为临床上自体 BMSCs 移植治疗激素性股骨头坏死提供实验依据 1 材料与方法 1.1 材料 选择 2013 年 3 月 ~10 月在张家口市第二医院骨外科收治的 10 例糖皮质激素诱导 患者, 其中男 4 例, 女 6 例, 平均年龄 45.2 岁 (37~52 岁 ) 10 例新鲜股骨颈骨折患者 (<1 周 ) 作为对照组, 其中男 5 例, 女 5 例, 平均年龄 61 岁 (55~71 岁 ) 激素性股骨头坏死组患者中有系统性红斑狼疮 肾病综合征及特发性血 小板减少性紫癜应用糖皮质激素治疗的病史, 临床主要表现为髋部疼痛 活动受限 跛行, 符合 的诊断标准 (X 线正侧位片及 MRI); 对照组无股骨头坏死 无激素应用史 两组患者在行全髋关节置换术 (total hip arthroplasty, THA) 中抽取股骨头部骨髓血, 分离获得 BMSCs 该项研究经医院伦理委员会批准并征得患者知情同意 1.2 主要仪器和试剂主要仪器有 : 流式细胞仪 (Becton Dickinson 公司 ) 倒置相差显微镜 (Leica 公司 ) 细胞培养箱 (SANYO 公司 ) 主要试剂有 : 胎牛血清 (FBS) DMEM/F-12 培养基 青霉素 链霉素 ( 双抗 ) 0.25% 胰蛋白酶 -EDTA, 以上均购自 Gibco 公司 ; 人外周血淋巴细胞分离液 (Percoll, 1.077 g/ml) 购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 ; Mouse anti-human CD44-FITC CD73 CD45 和 Mouse anti-human CD34- PE 均购自 Becton Dickinson 公司 ; 成骨诱导分化试剂盒 成脂诱导分化试剂盒 茜素红染液, 油红 O 染液, 以上均购自 Sigma 公司 ; 碱性磷酸酶试剂盒购自南京建成生物工程研究所 1.3 BMSCs 的分离 培养与鉴定 1.3.1 BMSCs 分离 培养手术过程中取 5 ml 股骨头部骨髓血标本置于肝素抗凝管, 轻轻混匀, 与等量 DMEM/F-12 混合, 1 000 r/min 离心 10 min; 弃上清及脂肪层, 并用 DMEM/F-12 重悬细胞, 以等体积比缓慢沿管壁叠加在 Percoll 液面上, 2 000 r/min 离心 25 min; 吸取乳白色环状细胞层即单个核细胞层, PBS 洗涤 2 次, 1 000 r/min 离心 10 min; 用细胞培养基 (DMEM/F-12 10% FBS 1% 双抗 ) 重悬细胞, 混匀后以 1 10 6 /ml 接种至 6 孔板中, 镜下观察细胞分布均匀 ; 置于 CO 2 细胞培养箱中 (37 C 5% CO 2 ), 常氧下进行培养, 48 h 更换新鲜培养液, 去除未贴壁细胞 ; 以

康少平等 : 激素性股骨头坏死患者骨髓间充质干细胞体外增殖分化能力的研究 3 后每隔 3 d 换液 1 次, 待贴壁细胞达到 80%~90% 融合后, 0.25% 胰蛋白酶 -EDTA 消化, 以 1:3 的比例传代培养, 镜 [8] 下观察细胞形态 培养的第 3 代细胞用于实验 1.3.2 BMSCs 的鉴定流式细胞仪检测细胞表面抗原 : 取生长状态良好的第 3 代 BMSCs, 0.25% 胰蛋白酶 -EDTA 消化收集细胞, 调整细胞数为 1 10 6 /ml PBS 充分洗涤 2 次, 各管依次加入单克隆抗体 CD34- PE CD45-FITC CD44-FITC CD73-FITC, 同时每管样品设立同型对照 常温避光孵育 30 min, PBS 洗涤细胞 3 次, 除去未结合抗体, 用 500 μl PBS 重悬细胞, 上流式细胞仪进行检测分析 1.4 BMSCs 的成纤维细胞 集落形成实验 (coloning forming unit-fibroblast, CFU-F) 分离各组骨髓血中单个核细胞 (MNC), 接种 1 10 4 MNC 于 60 cm 2 细胞培养皿中, 每个培养皿中共 10 ml 培养基 (DMEM/F-12 10% FBS 1% 双抗 ), 置于 CO 2 细胞培养箱中 (37 C 5% CO 2 ) 进行培养 孵育 14 d 后, PBS 洗涤 3 次, 0.5% 结晶紫染液染色 10 min, 蒸馏水洗涤平皿直至背景颜色消失, 倒置相差显微镜下观察计数集落的数目, 并挑取单个集落用普通计数板进行每个集落细胞计数 1.5 BMSCs 成骨诱导与钙结节染色将第 3 代细胞按 3 10 4 /cm 2 接种于 6 孔板中, 基础培养基 (DMEM/F-12 10% FBS 1% 双抗 ) 进行培养, 24 h 后使用成骨细胞诱导分化培养基 (DMEM/ F-12 10% FBS 1% 双抗 0.1 μmol/l 地塞米松 10 mmol/l β- 甘油磷酸 60 μmol/l 抗坏血酸 ) 进行成骨诱导, 每隔 2 d 换液 1 次, 成骨诱导培养第 14 d 使用茜素红染液做钙结节染色 PBS 洗涤细胞 2 次, 4% 预冷甲醛 (4 C) 固定 15 min, 双蒸水洗涤 3 次, 茜素红染液染色 10 min, 双蒸水洗涤 2 次 在低倍镜下观察每个视野中阳性钙结节的个数, 每孔随机选取 5 个视野, 取其平均数做比较 1.6 细胞培养液上清中碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP) 活性测定收集第 3 代贴壁细胞成骨诱导培养第 7, 14 d 各组培养液上清, 测定 ALP 的活性, 反映 BMSCs 成骨诱导 [9] 分化 取 96 孔培养板, 设定测定孔 标准孔 空白孔, 按照碱性磷酸酶试剂盒说明书进行操作, 计算各组细胞培养液上清中 ALP 活性 ( 金氏单位 /100 ml) 1.7 BMSCs 成脂诱导与脂滴染色将第 3 代细胞按 2 10 4 /cm 2 接种于 6 孔板中, 基础 培养基 (DMEM/F-12 10% FBS 1% 双抗 ) 进行培养, 每隔 2 d 换液 1 次 待细胞达到 100% 融合后, 使用成脂 细胞诱导分化培养基 (DMEM/F-12 10% FBS 1% 双 抗 1 μmol/l 地塞米松 10 µg/ml 胰岛素 0.5 mmol/l IBMX) 进行成脂诱导分化 每隔 2 d 换液 1 次, 成脂诱 导培养第 14 d, 使用油红 O 染液进行脂滴染色 PBS 洗涤细胞 2 次, 10% 中性甲醛固定 60 min, 双蒸水洗 涤 3 次, 待干, 加入预配并过滤后的油红 O 染液, 染色 15 min; 吸去多余染液, PBS 洗涤 2 次 倒置相差显微 镜下观察各组染色差异并照相记录, 了解 BMSCs 向 脂肪细胞的分化程度 1.7 统计学方法 计量资料结果以 x _ ±s 表示, 采用 t 检验评价组 间差异, 应用 SPSS 13.0 软件进行统计学处理, 以 P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 BMSCs 形态观察与鉴定 取第 3 代细胞在倒置相差显微镜下观察, 激素 性股骨头坏死组 () 与非股骨头坏死组 () BMSCs 形态相似, 细胞贴壁生长, 呈长梭型 多角型, 漩涡状分布排列 ( 图 1) 流式细胞仪检测 组第 3 代 BMSCs 相对特异 性表面抗原 CD44 CD73 均阳性, CD34( 造血干细胞 阳性 ) CD45( 白细胞阳性 ) 均为阴性 ( 图 2) 2.2 BMSCs 成纤维细胞 集落形成实验 (colonyforming unit fibroblast, CFU-F) 经密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞 (MNC) 后, 接种 1 10 4 MNC 于 60 cm 2 细胞培养皿中, 孵育 14 d 后, 结晶紫染液染色, 计数集落数目及每个集落平均 细胞数 组 BMSCs 集落数目为 组的 4 倍 ( 图 3A 和图 3B), 且 组每个集落平均细胞数目 高于 组 (P<0.01)( 图 3C 和图 3B) 结果提示, 激素 性 患者股骨头 BMSCs 的集落数量及增殖活性下 降 2.3 BMSCs 成骨诱导与钙结节染色 组 BMSCs 向成骨细胞诱导培养 3 d 后, 细胞体积变大, 由长梭形变为多角形, 逐渐细胞内颗 粒增多, 并逐渐出现细胞交叉重叠, 培养 11 d 后可见 细胞聚集成团, 颗粒状钙盐沉积明显, 14 d 进行茜素 红染色后, 显微镜下可观察到细胞间出现多个体积 较大的红色钙结节 ; 组 BMSCs 向成骨细胞诱导培

4 研究论文 (A) SSC Height (C) CD34 PE 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 Qnte % Gated Q1 90.99 CD73 FITC (B) CD34 PE 0 200 400 600 800 1000 FSC Height (D) CD34 PE CD44 FITC CD45 FITC A: FSC/SSC 设门圈定细胞群 ; B: CD44-FITC/CD34-PE; C: CD73-FITC/CD34-PE; D: CD45-FITC/CD34-PE A: delineated cell group by FSC/SSC gating analysis; B: CD44-FITC/CD34-PE; C: CD73-FITC/CD34-PE; D: CD45-FITC/CD34-PE. 图 2 流式细胞仪检测 组第 3 代 BMSCs 表面抗原 Fig.2 Detection of cell surface antigens of BMSCs from group in the third passage of culture by FACS (A) (B) (C) 100 90 80 70 60 50 40 2 500 2 000 1 500 1 000 30 ** 20 500 10 0 0 Number of colonies Number of cells per colony A: 与 组 BMSCs 集落数目 (**P<0.01); B: 与 组 BMSCs 孵育 14 d 后结晶紫染色细胞集落形成状态 ; C: 与 组每个 集落平均细胞数 (**P<0.01) A: the number of cell colonies of BMSCs in and group (**P<0.01); B: photograph of cell colonies by crystal violet staining after 14 days of culture of BMSCs; C: the average number of cells per colony of and group (**P<0.01). 图 3 与 组 BMSCs 成纤维细胞 - 集落形成 Fig.3 Colony-forming unit fibroblast assays of BMSCs from and group 图 1 与 组第 3 代 BMSCs 形态观察 (200 ) Fig.1 Morphological observation of BMSCs from and group in the third passage of culture (200 ) **

康少平等 : 激素性股骨头坏死患者骨髓间充质干细胞体外增殖分化能力的研究 5 Day 3 Day 7 Day 11 Day 14 : BMSCs 向成骨细胞诱导培养第 3, 7, 11 d 细胞形态及第 14 d 茜素红钙结节染色 ; : BMSCs 向成骨细胞诱导培养第 3, 7, 11 d 细胞形态 及第 14 d 茜素红钙结节染色 : the morphology of BMSCs after osteogenic induction culture on the day 3, day 7, day 11 and Alizarin red staining on the day 14; : the morphology of BMSCs after osteogenic induction culture on the day 3, day 7, day 11 and Alizarin red staining on the day 14. 图 4 与 组 BMSCs 成骨细胞诱导形态 (200 ) Fig.4 Morphology of BMSCs from and group after osteogenic induction (200 ) 养 11 d 后仅可见少量颗粒状钙盐沉积, 14 d 进行茜素 红染色仅见少许散在体积较小红色钙结节 ( 图 4) 在 表 1 与 组 BMSCs ALP 活性 (n=10, U/100mL, x _ ±s) Table 1 ALP activities of BMSCs from and group (n=10, U/100mL, x _ ±s) 组别 Group 第 7 d The day 7 第 14 d The day 14 5.86±0.90 13.67±1.20 0.75±0.10* 5.34±1.50 *P<0.05, 组第 7 d ALP 活性与 non- 组第 7 d ALP 活性比较 ; P<0.05, 组第 14 d ALP 活性与 non- 组第 14 d ALP 活性比较 *P<0.05, ALP activity of group compare with non- group on the day 7; P<0.05, ALP activity of group compare with non- group on the day 14. 组每个视野可见 (21.1±3.5) 个钙结节, 而 组每个视野钙结节数目为 (9.5±1.8) 个, 组每个视野钙结节数明显低于 non- 组 (P<0.05), 结果提示, 激素性 患者股骨头 BMSCs 成骨分化能力下降 2.4 细胞培养液上清中碱性磷酸酶 (ALP) 活性测定 BMSCs 向成骨细胞诱导培养第 7, 14 d, 收集各组细胞培养液上清, 检测 ALP 的活性 ( 表 1) 组 ALP 活性低于 non- 组 (P<0.05), 结果提示, 激素性 患者股骨头 BMSCs 成骨分化能力下降 2.5 BMSCs 成脂诱导与鉴定 组 BMSCs 向脂肪细胞诱导培养 3 d 后, 倒置相差显微镜下观察可见 BMSCs 开始由长梭形 Day 3 Day 7 Day 11 Day 14 : BMSCs 向脂肪细胞诱导培养第 3, 7, 11 d 细胞形态及第 14 d 油红 O 染色脂滴 ; : BMSCs 向脂肪细胞诱导培养第 3, 7, 11 d 细胞形态及第 14 d 油红 O 染色脂滴 : the morphology of BMSCs after adipogenic induction culture on the day 3, day 7, day 11 and Oil red O staining on the day 14; : the morphology of BMSCs after adipogenic induction culture on the day 3, day 7, day 11 and Oil red O staining on the day 14. 图 5 与 组 BMSCs 脂肪细胞诱导形态 (200 ) Fig.5 Morphology of BMSCs from and group after adipogenic induction (200 )

6 研究论文 变为圆形或多边形, 细胞突起逐渐变小变圆, 11 d 后 可见胞浆内形成少量高折光性的脂滴, 主要集中于 细胞核周围 ; 组培养 3 d 后细胞胞质内出现类似 脂滴样物质, 第 11 d 可见细胞中形成大量脂滴并覆 盖细胞核, 14 d 进行油红 O 染色后, 倒置显微镜下观 察脂滴呈红色, 大部分 BMSCs 分化为脂肪细胞 ( 图 5) 结果表明, 激素性 组 BMSCs 向脂肪细胞分化 的时间较对照组提前且成脂细胞的数目较对照组增 加, 因此推测, 激素性 组股骨头 BMSCs 成脂分化 能力增强 3 讨论在临床上糖皮质激素被广泛应用于治疗系统 性红斑狼疮 白塞病 肾病综合征 特发性血小板 减少性紫癜等疾病, 患者在使用激素治疗后容易发 生股骨头坏死 糖皮质激素已经成为非创伤性股骨 头坏死的主要危险因素, 但目前激素性股骨头坏死 的确切病理机制尚未完全明确 许多研究表明, 激 素性股骨头坏死除与成骨细胞及骨细胞的凋亡 [10] 脂肪栓塞 血管内凝血 骨内高压及骨细胞脂肪变 性有关外, 还与股骨头颈内 BMSCs 的增殖与分化能 力有关 Ching 等 [11] 发现, 酒精性和糖皮质激素诱导 患者 BMSCs 的成骨分化能力较非 患者显著降 低, 而酒精性 患者 BMSCs 的成脂分化能力增强 Hernigou 等 [12] 对激素性 患者 BMSCs 的体外培养 发现, 细胞集落形成率明显低于正常人, 从而证明了 股骨头坏死患者的 BMSCs 增殖活性下降 王佰亮等 [13] 也发现, 激素性股骨头坏死患者股骨头 BMSCs 的数 量减少及增殖活性下降 本研究所得激素性 患 者股骨头 BMSCs 增殖及成骨 成脂分化能力的结果 与以上文献报道相似 本文通过 CFU-F 实验检测激素性 患者与非 患者 BMSCs 的数量与增殖活性, 结果显示, 组 BMSCs 细胞集落形成数目及每个集落平均细胞 数目明显低于 non- 组, 表明激素性 患者的 BMSCs 的数量减少及增殖活性下降 为了比较激素 性 患者与非 患者 BMSCs 的成骨和成脂分化能 力, 对两组 BMSCs 进行成骨 成脂诱导培养, 并分析 细胞培养液上清中 ALP 的活性及钙结节 ( 茜素红染 色 ) 与脂滴 ( 油红 O 染色 ) 的形成 BMSCs 成骨诱导培 养第 7, 14 d, 组 ALP 活性明显低于 non- 组 ; 14 d 进行茜素红染色, 组每个视野钙结节数明显低于 non- 组, 提示激素性 患者股骨头 BMSCs 成骨分化能力下降 对两组 BMSCs 进行成脂诱导培养, 倒置相差显微镜下观察发现, 激素性 组 BMSCs 细胞胞质内开始出现脂滴样物质的时间较对照组提前, 即培养第 3 d 细胞胞质内开始出现脂滴样物质, 14d 进行油红 O 染色结果显示, 激素性 组的成脂细胞明显多于对照组的成脂细胞, 提示激素性 组股骨头 BMSCs 成脂分化能力增强 因此, 推测糖皮质激素可能具有抑制 BMSCs 向成骨分化作用但促进 BMSCs 向成脂分化的能力 本研究存在一定的局限性 首先, 实验没有测定 与 non- 组这两组人群 BMSCs 在体内的成骨及成脂分化能力, 因此, 体内与体外实验结果是否一致并不清楚 其次, 正常人 BMSCs 对糖皮质激素的反应与糖皮质激素诱导 患者是否相同也不明确 最后, 实验未设计激素性 患者不同取材部位 BMSCs 增殖及成骨 成脂分化能力比较 从股骨头获取的 BMSCs 不能完全代表从髂骨取材获得 BMSCs 的增殖与分化能力 以上这些结果有待进一步实验探讨 综上所述, 激素性股骨头坏死患者股骨头部 BMSCs 增殖活性及成骨分化能力下降, 更易向脂肪细胞分化 糖皮质激素引起股骨头 BMSCs 的增殖活性及成骨 成脂分化能力的改变可能参与激素性股骨头坏死病理生理过程 临床上如果使用此类患者自身股骨头部骨髓间充质干细胞进行股骨头坏死的治疗, 其临床效果可能不是很理想 参考文献 (References) 1 Levasseur R. Mechanisms of osteonecrosis. Joint Bone Spine 2008; 75(6): 639-42. 2 杨述华. 股骨头坏死及研究进展. 中国矫形外科杂志 (Yang Shuhua. Progress of research on the necrosis of femoral head. The Orthopedic Journal of China) 2004; 12(18): 1428-31. 3 Lee JS, Lee JS, Roh HL, Kim CH, Jung JS, Suh KT. Alterations in the differentiation ability of mesenchymal stem cells in patients with nontraumatic osteonecrosis of the femoral head: Comparative analysis according to the risk factor. J Orthop Res 2006; 24(4): 604-9. 4 Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature 2002; 418(6893): 41-9. 5 Niedźwiedzki T, Dabrowski Z, Miszta H, Pawlikowski M. Bone healing after bone marrow stromal cell transplantation to the bone defect. Biomaterials 1993; 14(2): 115-21. 6 Gangji V, de Maertelaer V, Hauzeur JP. Autologous bone marrow cell implantation in the treatment of non-traumatic osteonecrosis

康少平等 : 激素性股骨头坏死患者骨髓间充质干细胞体外增殖分化能力的研究 7 of the femoral head: Five year follow-up of a prospective controlled study. Bone 2011; 49(5): 1005-9. 7 Angélique L, Alexandre P, Madeleine C. Development of a simple procedure for the treatment of femoral head osteonecrosis with intra-osseous injection of bone marrow mesenchymal stromal cells: Study of their biodistribution in the early time points after injection. Stem Cell Res Ther 2015; 6(1): 68-81. 8 Chang JK, Ho ML, Yeh CH, Chen CH, Wang GJ. Osteogenic gene expression decreases in stromal cells of patients with osteonecrosis. Clin Orthop Relat Res 2006; 453: 286-92. 9 Chen CH, Ho ML, Chang JK, Hung SH, Wang GJ. Green tea catechin enhances osteogenesis in a bone marrow mesenchymal stem cell line. Osteoporos Int 2005; 16(12): 2039-45. 10 Weinstein RS, Nicholas RW, Manolagas SC. Apoptosis of osteocytes in glucocorticoid-induced osteonecrosis of the hip. J Clin Endocrinol Metab 2000; 85(8): 2907-12. 11 Ching H, Jeken C, Meiling H, Chung H. Different differentiation of stroma cells from patients with osteonecrosis. Clin Orthop Relat Res 2009; 467(8): 2159-67. 12 Hernigou P, Beaujean F, Lambotte JC. Decrease in the mesenchymal stem cell pool in the proximal femur in corticosteroidinduced osteonecrosis. Bone Joint Surg Br 1999; 81(2): 349-55. 13 王佰亮, 李子荣, 娄晋宁. 激素性股骨头坏死骨髓基质干细胞增殖活性的检测. 中华关节外科杂志 (Wang Bailiang, Li Zirong, Lou Jinning. Decreased proliferation abbility of the mesenchymal stem cell in steroid-induced osteonecrosis of femoral head. Chin J Joint Surg) 2008; 2(1): 40-5.