潘志宏 等 2 糖蛋白抑制对体外培养骨髓间充质干细胞成脂分化的影响 -, , 随着糖皮质激素在临床的广泛应用 股骨头坏 死患者不断增多 但应用相同剂量激素的患者并非都发生股骨头坏死 据统计 激素性股骨头坏死率约为 近年来 等和 等发现当肾移植或系统性红斑狼疮患者的 2 糖

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1 复旦学报 医学版 糖蛋白抑制对体外培养骨髓间充质干细胞成脂分化的影响 潘志宏 韩 宁 复旦大学附属金山医院骨科 上海 同济大学附属东方医院急诊创伤外科 上海 摘要 目的 探讨 2 糖蛋白 2 2 活性抑制对骨髓间充质干细胞 - 在糖皮质激素诱导下成脂分化的影响 方法 体外培养 大鼠 - 分别给予维拉帕米 组 - 组 和 组 加入等量生理盐水作为阴性对照 组 培养至第 天 用罗丹明 荧光染料结合流式细胞仪技术检测 2 糖蛋白活性 各组再以 地塞米松诱导 天 分别于第 天和第 天 检测各组三酰甘油含量 和碱性磷酸酶 92 活力 结果 第 天时 - 和 组的罗丹明 平均荧光强度和阳性细胞数均高于 组 组低于 - 组 组最高 各组 含量和 92 活力的差异无统计学意义 第 天时 - 和 组的 含量分别为 和 均高于 组的 组低于 - 组 组最高 - 和 组的 92 活力分别为 和 均低于 组的 组低于 - 组 组最低 结论 2 糖蛋白活性抑制剂 维拉帕米 能降低 - 的 2 糖蛋白活性 促进糖皮质激素诱导的成脂分化 关键词 2 糖蛋白 骨髓间充质干细胞 维拉帕米 糖皮质激素 成脂分化 中图分类号 文献标志码

2 潘志宏 等 2 糖蛋白抑制对体外培养骨髓间充质干细胞成脂分化的影响 -, , 随着糖皮质激素在临床的广泛应用 股骨头坏 死患者不断增多 但应用相同剂量激素的患者并非都发生股骨头坏死 据统计 激素性股骨头坏死率约为 近年来 等和 等发现当肾移植或系统性红斑狼疮患者的 2 糖蛋白 2 2 活性下降时 激素性股骨头坏死发生率显著升高 2 糖蛋白是一种膜蛋白 它通过消耗 2 外泵 进入胞内的糖皮质激素 从而削弱激素药理作用 等发现对于相同剂量的糖皮质激素 联用 2 糖蛋白抑制剂 环孢素 和 9 能显著增加股骨头坏死的发生率 但详细机制不明 糖皮质激素诱导骨髓间充质干细胞 - 成脂分化被认为是激素性股骨头坏死的重要 机制 而 2 糖蛋白对 - 成脂分化的效应尚不明确 维拉帕米 是公认的 2 糖蛋白活性 抑制剂 本试验旨在利用维拉帕米抑制 2 糖蛋白活性 观察其对糖皮质激素诱导的 - 成脂分化影响 材料和方法 动物 试剂和仪器 周龄 大鼠由上海复旦大学附属公共卫生临床中心动物中心提供 高糖 培养基 美国 公司 胎牛血清 以色列 - 有限公司 含 的 胰蛋白酶 公司 维拉帕米 地塞米松 罗丹明 油红 和胞裂解液 美国 公司 培养瓶和 孔板 美国 公司 流式细胞仪 美国 - 公司 三酰甘油酶法定量检测试剂盒 含有 和 液 上海荣盛生物技术有限公司 碱性磷酸酶活力分析试剂盒 含有 和 液 上海前尘生物科技有限公司 紫外光分光光度仪 德国 公司 大鼠 培养及传代扩增 密度梯度离 心联合差速贴壁法分离 大鼠的 - 用 高糖完全培养液 含 胎牛血清 青霉素和 链霉素 冲洗大鼠股骨髓腔 充分混匀后滴加到 分离液 上层液面 离心 2- 洗涤中间单核细胞层 次 单细胞悬液以 接种于 培养瓶 置于 饱和湿度的细胞孵箱培养 全量换液 弃去未贴壁细胞 以后每 天换液 次 细胞生长至 融合后以含 的 的胰蛋白酶消化传代 维拉帕米干预 分别配制浓度为 和 维拉帕米 - 以 密度接种至 孔板 每孔中加入 高糖完全培养液和 上述浓度维拉帕米 根据维拉帕米终浓度分为 组 组为 - 组为 组为 组为生理盐水 第 天检测各组 - 的 2 糖蛋白活性后 各组均混合 地塞米松 继续孵育 天 在第 天和第 天分别检测各组细胞内三酰甘油 含量和碱性磷酸酶 92 活力 上述步骤重复 次 罗丹明外排试验检测 的 糖蛋白活性 第 天 各组制成 - 单细胞悬液 加入终浓度为 罗丹明 饱和湿度的孵箱中培养 2- 洗涤细胞 遍 重悬于 培养液中 各组分别加入相应浓度维拉帕米 饱和湿度的孵箱中培养 离心 重悬于 2- 中 立即以流式细胞仪测定荧光强度 激发波长和发射波长分别为 和 不含罗丹明 染液的 - 为对照组 上述试验重复 次 含量定量检测 分别以 细胞裂解液完全裂解各组细胞 离心 取上清液 测定管取 上清液 标准管取 液 空

3 复旦学报医学版 年 月 白 管 取 蒸 馏 水分 别 与 ; C 液 混 匀 [ 水浴 ; 各 管 分 别 加 入 C 液 混 匀 [ 温箱内静置 ; 以空白管调零 ; 测吸光度 根据说明书提供的公式计 算 AI 含 量 ;;2 ;M 活性检测 以 细胞裂解液分别完全 裂解 各 组 细 胞 离 心 ; 取 上 清 液 取 ;C 反应 液 加 入 比 色 杯 [ 静 置 ; 加 入 上清液混匀 [ 静置 加入 C 的 AI 含量分别为 <,< <,< 和 <,< ;;2 E 组与 AC 组 间 的 差 异 均 无 统 计 学 意 义 培 养 至 第 天@ E 和 AC 组 的 AI 含 量 分 别 为 <,< <,< <,< 和 <,< E 组均高于 AC 组 组低于 E 组 组 最高 图 反 应 液混 匀 [ 静 置 分 光 光 度 计 测 定 ;处 ; 内 的吸光 度变化根 据说 明书 提 供 活力 油红 染色 各组连 续 孵 育 天 后由 孔 板 内 取 出 -; 细 胞 爬 片B 多 聚 甲 醛 固 定 ; 以蒸馏水洗去 固定 液 B 乙醇 浸 渍 < ; 加 油 红 > 染 液 染 色 ; 弃 去 染 液 B 乙醇分化数秒流水冲洗 后 再 用 蒸 馏 水 洗 ; 苏 木精复染流水冲洗 ; 吸 干 水 分 以 甘 油 明 胶 封 固光镜下计数各组 脂 化 细 胞 胞 质 中 包 含 红 色 脂 滴颗粒的数量 图 罗丹明 AC 结合流式细胞仪检测 M 糖蛋白活性 H 2, M B 2 O 统计分 析 所 得 的 数 据 采 用, < 软件进 行两两 比 较 检 验 < 认 为 差 异 有 统 计 学 意义 -2, AC 2-, -< - D P 2 8 P L<2N N L< P L 8 结 果 ; < N 大鼠的 R8 分 离 培 养 E, 为 长 梭 形 贴壁细胞增殖迅速 天 达 到 融 合< B 胰 蛋白酶消化传代细 胞 于 8 内 完 全 贴 壁形 态 与 原代细胞相似 天达到融合 取 第 代 细 胞用于试验 M 糖蛋白活性 荧光染 料 罗 丹 明 顺 浓 度 梯 度进入细胞P 糖 将 其 外 泵减 少 胞 内蓄积通过流式细胞仪检测阳性细胞荧 光染 色 的比例及荧光强度可判断细胞膜上 P 糖蛋白活性阳 性细胞比 例 和 平 均 荧 光 强 度 越 高 P糖蛋白活性越 弱-本试验中 AC 组阳性细胞数最少- <, 图 A 第 F 天时 R8 胞内 >S 含量的检测结果 < B 胞内平均荧光强度最低 <, < 组 阳 性 细 胞 数 - <, R8, -B -, F 2 A>S B 和胞内平 均 荧 光 强 度 <,< 均 高 < 于 AC 组 E 组 阳 性 细 胞 数- <, < B 和胞内平均荧光强度 <,< 均高 于@ 组 < 组 阳 性 细 胞 数 - <, < B < 和 胞 内 平 均 荧 光 强 度 最 高 <,< 图 >S 含量 培 养 至 第 E 和 AC 组 A8AI N AC < N 2N 8 L<D < 2E N Q >,< E 和 AC ;M 活 力 培 养 至 第 天@ 活 力 分 别 为 <,< <, < <,< 和 E 组 与 AC 组 间 的 差 异 均 无 统 计 学 意 义

4 P 糖蛋白抑制对体外培养骨髓间充质干细胞成脂分化的影响 潘志宏等 < 培 养至第 E 和 AC 活力分 别为 <,< <,< <, 和 组 均 低于 E < AC 组 < 其 中@ 组 高 于 E 组 组最低 图 < 成脂分 化 培 R8 养 至 第 天随 维 拉 帕 米 浓度逐渐 增 组 9 诱 导 E, 逐 渐 增 大并由长梭形逐渐变为圆形 或多 角性胞质中 出现 逐渐增 多 的 脂 滴 空 泡油 红 > 染 色 示 为 红 色 脂 E 和 AC 组的细胞 计数分 别 为 -; <,< <,< -; 和 -; -; <,< E 组均高于 AC 组 组低 于 E 组 组最高 图 E 图 C 第 F 天时 R8 胞内的 ;M 活力检测 R8, -B -, F 2 2N 8 2 L N AC N 8 8 L<D N < N Q > 图 F 第 F 天时 R8 成脂分化形态学分析, -, F 2 FR82 Q; ;2 8 2 N 2 N 82 ; N 2 AC 2 N 8< ;2 ; -; 2 N 8< ;2 ; 2E 8 ;2 N 8< ;2 ; 2EA8;O N 8; 2AC<D N 8 2E 2 8 8O 2,< ;O <@ N Q > P 将 糖皮 质激素泵出细胞使胞内激素浓度下降削弱激素的 讨 论 药理作用 -荧光染料 罗 丹 明 是 特 异 性 的 P - 9 浓度决定 E, 分化方向 有时相同 浓度的 9却 诱 导 E, 向 不 同 方 向 分 化发 生 机制尚不明确 等 应 用 ;2 糖蛋白底 物可 被 P 糖 蛋 白 逆 浓 度 梯 度 泵 至 细 胞 外利用流式细胞仪检测胞内荧光残留量能够准确 反映 P 糖蛋白活性胞内罗丹明 蓄积越多 P糖 利 蛋白活性越弱 -相比于 P 糖蛋 白表达 检 测该法 9 诱 导 人 E, 分 化 为 成 骨 用 ;2 能够更加准确 而 直 接 地 反 映 P 糖 蛋 白 对 其 底 物 的 细胞近年来发现人 多 药 耐 药 基 因 编 码 的 P 糖 作用 -而 P 糖蛋白表达 常 背 离 其 对 底 物 的 实 际 蛋白能通过改变 9 的胞内蓄积调控其对细胞的 作用近年来发 现 P 糖蛋白活性抑制剂可能通过 9 诱 导 人 E, 分 化 为 脂 肪 细 胞 等 本研 究 发 现维 拉 帕 米 能 抑 制 P 糖 蛋 白 多药耐药基因 的转录后调控而上调 P 糖蛋白的表 活性有效促进 9 诱 导 的 E, 成 脂 分 化 P糖 达 -因此 P 糖蛋白 对 底 物 的 转 运 作 用 应 以 P 蛋白活性越低 9 诱导的 E, 成脂分化越强 糖蛋白活性为准 -许多学者 发 现维 拉 帕 米 能 够 作用

5 复旦学报 医学版 年 月 有效抑制肿瘤细胞的 2 糖蛋白活性 其浓度越高 2 糖蛋白活性越弱 本研究中 维拉帕米成功增加了 - 胞内荧光蓄积 即抑制了 - 的 2 糖蛋白活性 且浓度越高 抑制效果越明显 与胞内糖皮质激素受体结合发挥药理作 用 本研究中 诱导时 - 胞内出现脂滴 表现为成脂分化 浓度相同时 随维拉帕米浓度上升 - 逐渐增大 变圆 胞内脂滴逐渐增多 脂化细胞数量不断增加 胞内 含量不断上升 这些均表明 - 成脂分化逐渐增强 但是 单纯应用维拉帕米却不会诱导 - 发生成脂分化 这提示维拉帕米促进 - 成脂分化必须通过 来发挥作用 是 2 糖蛋白底物 可被 2 糖蛋白逆浓度梯度泵至细胞 外 而维拉帕米是 - 的 2 糖蛋白抑制剂 2 糖蛋白活性下降 胞内蓄积增加 糖皮质激素 受体结合率下降 作用减弱 而 浓 度上升 诱导 - 成脂分化作用增强 因此 我们推测维拉帕米促进 - 成脂分化可能是通过抑制 - 的 2 糖蛋白活性来增加胞内 蓄积 从而增强 诱导作用 92 活力是 - 成骨分化的重要标志 本研究中 地塞米松浓度相同时 随着维拉帕米浓度不断升高 2 糖蛋白活性抑制不断增强 - 成骨 分化不断减弱 等发现 浓度越高 - 成骨分化越弱 由于单纯应用维拉帕米不影响 - 的 92 活性 我们推测维拉帕米抑制 - 成骨分化可能是由于 - 的 2 糖蛋白活性被抑制 胞内 蓄积增加 进而抑制 - 成骨分化 近年来 糖皮质激素诱导 - 成脂分化被认为 是激素性股骨头坏死的重要机制 等发现激素导致股骨头内 - 数量减少 等利用示踪技术发现 全身应用糖皮质激素诱导植入股骨头内的 - 在股骨头内转化为脂肪细胞 本研究发现 2 糖蛋白活性抑制促进 - 成脂分化 但是 过度的 - 成脂分化增加股骨头内压 降低血供 增加股骨头坏死率 另一方面 2 糖蛋白活性下降会导致 - 成骨分化减弱 - 成骨抑制导致成骨细胞前体下降 骨坏死灶的成骨修复作用减弱 降低股骨头力学性能 可能加速股骨头 塌陷 总之 2 糖蛋白在 诱导 - 成脂分化过程中发挥重要作用 这为揭示 2 糖蛋白的活性下降促进激素性股骨头坏死重要机制提供了一条重要途径 参 考 文 献 9,, 9, , 刘杰 孙正义 曹蕾 地塞米松对骨髓基质干细胞生物学特性的影响 中华骨科杂志 9 下转第 页

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