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J South Med Univ, 2014, 34(6): 777-782 doi 10.3969/j.issn.1673-4254.2014.06.05 777 基础研究二乙基亚硝胺诱导建立斑马鱼肝纤维化模型王坤元, 刘莉, 戴文聪, 陈小辉, 郑新春, 侯金林南方医科大学南方医院感染科暨肝病中心 // 南方医科大学南方医院器官衰竭研究国家重点实验室, 广东广州 510515 摘要 : 目的探讨利用二乙基亚硝胺 (DEN) 致中毒性肝损伤的方法构建斑马鱼肝纤维化模型的可行性方法 3 月龄野生型斑马鱼 120 条, 随机等分为对照组和 DEN 处理组, 分别观察两组斑马鱼生存率及行为学改变, 在 DEN 处理 2 周 4 周和 6 周末, 分别从两组中随机抽取等量样本测量肝指数, 并制作石蜡切片, 采用 HE 染色 Gomori 氏网状纤维染色及天狼星红苦味酸染色方法观察肝纤维化病变结果 DEN 处理组斑马鱼在造模期间未见明显行为学改变, 与对照组斑马鱼相比,DEN 处理组斑马鱼肝指数在 2 周 4 周和 6 周末均无统计学差异病理染色结果显示造模 4 周末,DEN 处理组斑马鱼肝细胞变性坏死,30% 斑马鱼肝脏网状纤维合成分泌增多 ;6 周末,DEN 处理组斑马鱼结构紊乱,80% 斑马鱼肝脏纤维过度沉积, 网状纤维和胶原纤维合成分泌异常增多, 可见纤维结节形成结论采用 DEN 诱导中毒性肝损伤方法能够成功地构建稳定的斑马鱼肝纤维模型, 为进一步探讨肝纤维化的发病机制以及药物筛选奠定了实验基础关键词 : 斑马鱼 ; 肝纤维化 ; 二乙基亚硝胺 ; 动物模型 Establishment of a hepatic fibrosis model induced by diethylnitrosamine in zebrafish WANG Kunyuan, LIU Li, DAI Wencong, CHEN Xiaohui, ZHENG Xinchun, HOU Jinlin Department of Infectious Diseases and Hepatology Unit, State Key Laboratory of Organ Failure Research, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China Abstract: Objective To establish a zebrafish model of liver fibrosis via diethylnitrosamine (DEN)-induced liver injury. Methods A total of 120 wild-type 3-month-old zebrafish were randomly divided into DEN-treated group and control group. The survival rate and behavioral changes of each group were observed. After treatment with DEN for 2, 4, and 6 weeks, liver index was measured, and liver fibrosis was evaluated with HE staining, Gomori staining and Sirius red staining. Results No obvious behavioral change was observed in DEN-treated group during the experiment. Compared with that in control group, the liver index of zebrafish in DEN-treated group showed no significantly changes at the time points of observation. Proliferation of reticulate fibers was found in 30% of zebrafish treated with DEN for 4 weeks, and the rate increased to 80% at 6 weeks when reticulate fibers and collagen fibers actively proliferated to result in fiber collapse and formation of fibrotic nodules. Conclusion A stable zebrafish liver fibrosis model was successfully established by inducing liver damage to facilitate studies of the pathogenesis of liver fibrosis and screening therapeutic drugs. Key words: zebrafish; liver fibrosis; diethylnitrosamine; animal model 肝纤维化是由各种致病因子所致肝内结缔组织合成分泌异常增多, 导致肝内弥漫性细胞外基质 (fibrillar extracellular matrix, ECM) 过度沉积的病理过程, 是由包括病毒性自身免疫性药源性胆汁淤积性以及代谢 [1-2] 异常等多种原因引起的持续性病理改变, 也是肝脏向肝硬化肝癌等进一步发展的重要中间环节基础及临 [2-7] 床研究已经证实, 肝纤维化是一个可逆过程尽管早期诊断并及时干预原发病所致的肝脏炎症性坏死, 可在一定程度上防止肝纤维化的发展, 但目前尚无疗效肯定的直接抗肝纤维化药物因此, 为更好地研究肝纤维化的发生机制探索相关药物在治疗肝纤维化时的合理给药途径并验证疗效, 建立稳定可靠的肝纤维化动物模型收稿日期 :2014-02-11 基金项目 : 国家科技重大专项 (2012ZX10002003) National Science and Technology Major Project (2012ZX10002003). 作者简介 : 王坤元, 在读硕士研究生,E-mail: wangkunyuan@sina.cn 通信作者 : 侯金林, 教授, 主任医师, 博士生导师,E-mail: jlhousmu@163.com 具有重要意义传统的肝纤维化模型一般以小鼠大鼠或家兔为实验动物, 所建立的肝纤维化模型包括中毒性肝损伤模型胆汁淤积性肝损伤模型免疫性肝损伤模型及转基 [8] 因动物模型等斑马鱼作为一种新兴的模式生物, 其基因组与人类基因组具有高度同源性, 这一优势使其在 [9] 各种疾病模型的建立和药物筛选中得以普遍应用此外, 斑马鱼凭借自身饲养管理经济方便分子遗传操作简便易行等优点也受到了越来越多国内外学者的青睐以斑马鱼为实验动物的疾病模型已广泛涉及各个 [10-12] 系统, 如造血心血管肾脏骨骼及神经等近年来, 斑马鱼在肝脏疾病研究中的应用日益增多, 以斑马鱼构建的酒精性与非酒精性脂肪肝模型药物性肝损伤 [13-15] 模型及肝癌模型等已见诸文献报道 2006 年, Mizgireuv 首次采用二乙基亚硝胺 (DEN) 诱导斑马鱼肝 [16-17] 脏肿瘤形成 ; 随后,Fujisawa 采用同种药物成功构建

778 http://www.j-smu.com J South Med Univ, 2014, 34(6): 777-782 [18] 斑马鱼肝脏肿瘤模型 2008 年,Rekha 首次应用硫代乙酰胺 (TAA) 在 HCV 转基因斑马鱼中成功诱导脂肪性 [19] 肝病肝硬化及肝细胞癌 ;2012 年,Liu 成功构建肝内特异性表达 HBX 及 HCV 核心蛋白的转基因斑马鱼, 并 [20] 观察到明显的肝纤维化和胆管细胞癌目前所报道的斑马鱼肝纤维化病变模型大多建立在转基因模型基础上由于种属差异性的存在, 斑马鱼肝纤维化模型的构建无法完全参考传统肝纤维化模型的构建方法基于物种自身特点, 中毒性肝损伤法和转基因法在诱导建立斑马鱼肝纤维化模型时具备更强的可行性相较于转基因法, 药物诱导建立肝纤维化模型的方法具有技术难度小工作量少和实验周期短等特点二乙基亚硝胺 (DEN) 是一种具有细胞毒性的致癌剂, 具有明显的肝脏亲和性 DEN 经微粒体转化后, 可引起核酸和蛋白质等大分子甲基化, 导致肝细胞坏死, 刺激肝内 ECM 的合成与分泌, 从而促进纤维化的形成此外,DEN 具有水溶性理化性质稳定的特点, 能够采用直接浸泡的方式给药, 满足斑马鱼疾病模型的建立为此, 本研究采用 DEN 肝毒性药物诱导斑马鱼肝脏损伤, 由于肝纤维化常为肝脏肿瘤形成前的病理过程, 因此我们采取多时间点采集标本并予以组织病理学改变的评估方法, 判断 DEN 所诱导的斑马鱼肝脏肿瘤形成的早期, 是否存在肝脏的纤维化病理改变 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物 3 月龄健康 AB 品系野生型斑马鱼 ( 由南方医科大学广东省人类疾病斑马鱼模型与药物筛选重点实验室惠赠 ) 1.1.2 实验主要试剂及仪器二乙基亚硝胺 (DEN)( 美国 Sigma); 苏木素伊红高锰酸钾草酸硫酸铁铵 Gomori 氏银氨染液甲醛二甲苯酒精等 ( 华俊医疗器械公司 ); 天狼星红苦味酸染液 ( 罗基生物技术有限公司 ); 闽江 HR3 480 鱼缸 ( 永鑫水族馆 ); 光学显微镜 ( 日本 OLYMPUS 公司 ) 1.2 方法 1.2.1 斑马鱼饲养实验选用 3 月龄 AB 品系野生型斑马鱼, 于 28.5 恒温环境中饲养, 自动计时器控制每日 14 h 光照和 10 h 黑暗时间交替循环 1.2.2 肝纤维化诱导将 3 月龄斑马鱼随机分为 DEN 处理组及对照组 (60 条 / 组 ), 分别饲养于不同的鱼缸中 DEN 处理组于饲养缸中直接投放药物, 每 2 周更换缸内液体 1 次, 于浸泡后 2 4 6 周末分别随机选取各组斑马鱼 (20 条 / 组 ) 评估肝纤维化病变进展 1.2.3 肝指数检测将斑马鱼浸入冰水混合物中麻醉后, 立即置于天平称取整体湿重量, 随后在显微镜下分离斑马鱼肝脏, 称量肝组织湿重量并记录, 以检测造模期间 DEN 处理组和对照组斑马鱼肝脏形态学改变肝 [21] 指数 = 斑马鱼肝脏湿重量 / 斑马鱼整体湿重量 1.2.4 石蜡切片制作 4% 多聚甲醛固定斑马鱼肝脏 96 h, 流水冲洗后, 依次采用梯度酒精二甲苯石蜡浸泡组织,65 石蜡包埋制备石蜡标本, 石蜡切片机切取石蜡切片 (4 μm/ 片 ) 1.2.5 HE 染色 HE 染色, 即苏木精 - 伊红染色, 是目前用于观察组织形态学最常用的染色方法本研究利用 HE 染色观察 DEN 处理组与对照组斑马鱼肝脏组织病理学改变, 以评估肝脏组织结构完整性, 肝细胞变性坏死及炎性细胞浸润等炎症改变情况石蜡切片常规脱蜡至水, 先以苏木素染色 5 min, 自来水冲洗,1% 盐酸酒精进行分化, 后以 1% 伊红浸染 3 min, 梯度酒精脱水二甲苯透明中性树胶封片并覆盖玻片显微镜下观察并拍照 1.2.6 Gomori 氏网状纤维染色网状纤维由含糖蛋白的胶原蛋白组成, 易与氨性银结合, 即带正电荷的二氨合银离子能被网状纤维所吸附, 经甲醛还原后形成棕黑色金属银, 从而使网状纤维显色结果显示网状纤维呈黑色, 背景呈黄色本研究利用 Gomori 氏网状纤维染色观察 DEN 处理后斑马鱼肝脏网状纤维合成分泌情况, 从而评估肝纤维化病变进展情况石蜡切片常规脱蜡至水, 于载玻片上滴加 0.25% 高锰酸钾水溶液氧化 5 min, 蒸馏水冲洗 2 次, 随后以 2% 草酸水溶液漂白组织至白色, 蒸馏水冲洗 2 次, 再以 2% 硫酸铁铵溶液媒染 5 min, 蒸馏水充分冲洗后滴加 Gomori 氏银氨染液反应 5 min, 蒸馏水稍洗, 最后滴加 10% 中性甲醛还原 1 min, 于蒸馏水中浸洗 10 min 后常规脱水透明后加盖玻片封固 1.2.7 天狼星红苦味酸染色天狼星红染液为强酸性染料, 能够与胶原纤维中的碱性基团结合反应, 使胶原纤维产生明显的双折光现象, 提高分辨率在普通光学显微镜下天狼星红染色可见胶原纤维呈红色, 本研究利用该染色方法对 DEN 处理后胶原纤维的合成分泌情况进行评估石蜡切片常规脱蜡至水, 于载玻片上滴加饱和苦味酸天狼星红染液反应 1 h, 自来水冲洗, 常规脱水透明后加盖玻片封固 1.2.8 统计方法数据采用 SPSS13.0 软件处理, 两组间比较采用独立样本 t 检验及非参数检验,P<0.05 认为差异具有统计学意义 2 结果 2.1 DEN 处理浓度筛选预实验中分别采用低浓度 (150 mg/l) 和高浓度

J South Med Univ, 2014, 34(6): 777-782 http://www.j-smu.com 779 (250 mg/l)den 干预, 实验证实, 与对照组相比,250 mg/l DEN 处理组斑马鱼死亡率显著升高 DEN 处理 4 周后,250 mg/l 处理组死亡率为 91.7%, 剩余样本数无法满足统计学需求, 该组实验提前到达终点 150 mg/l DEN 处理组与对照组无斑马鱼死亡, 因此, 选择 150 mg/l 作为建模给药浓度 2.2 一般情况与对照组相比,DEN 处理第 1 周, 斑马鱼食欲明显减退, 游动减少, 第 2 周起食欲逐渐增加, 游动亦增多, 考虑系斑马鱼对 DEN 逐渐耐受所致实验过程中,DEN 处理组与对照组斑马鱼体表肛门腮等处鳞片光滑, 均未见立鳞烂鳃出血溃疡以及脊柱弯曲等形态学异常 2.3 肝指数检测与对照组相比,DEN 处理组斑马鱼在处理 2 周 4 周及 6 周末肝指数无明显差异,P 值均 >0.05( 表 1), 结果表明造模期间 DEN 并未引起斑马鱼肝脏形态发生明显改变 2.4 组织病理切片 HE 染色观察斑马鱼肝脏结构改变及炎症反应 HE 染色结果显示, 对照组斑马鱼肝脏组织结构正常, 肝细胞排列整齐 ( 图 1A);DEN 处理 2 周末斑马鱼肝组织仅观察到局部少量炎性细胞浸润 ( 图 1B); 处理 4 周后肝脏炎性细胞广泛浸润, 肝细胞变性局部融合性坏死 ( 图 1C); 至 6 周末观察发现, 斑马鱼肝脏组织结构紊乱, 肝细胞变性坏死, 炎症反应严重, 疑似纤维结节形成 ( 图 1D) 2.5 组织病理切片 Gomori 氏网状纤维染色观察斑马鱼表 1 斑马鱼肝脏指数 Tab.1 Liver index of zebrafish in different groups (Mean±SD, n=10) Group DEN treatment time(week) 2 4 6 Control DEN-treated 0.0167±0.0154 0.0139±0.0203 0.0215±0.0152 0.0145±0.0091 0.0300±0.0200 0.0472±0.0410 The liver index of zebrafish in DEN-treated group and control group has no statistically significant difference in the respective processing time points (P>0.05 vs control). 肝脏纤维化病变 Gomori 氏网状纤维染色能将网状纤维浸染呈黑色, 结果显示, 对照组斑马鱼肝组织未观察到纤维组织合成分泌增多 ( 图 2A);DEN 处理给药 2 周末也未见纤维组织增多 ( 图 2B); 处理 4 周末部分斑马鱼肝脏可见网状纤维异常增多, 弥漫性沉积于肝组织中, 形成纤维间隔 ( 图 2C); 至 6 周末大多数斑马鱼肝脏纤维组织合成分泌异常增多, 纤维结节形成 ( 图 2D) 2.6 组织病理切片苦味酸天狼星红染色观察斑马鱼肝脏胶原纤维合成分泌情况苦味酸天狼星红染色方法是胶原纤维的特异性染色方法, 在普通光学显微镜下呈红色结果显示对照组和 DEN 处理 2 周组斑马鱼肝脏均未见胶原纤维合成分泌增多 ( 图 3A B); 造模 4 周末斑马鱼肝组织也未观察到明显增多的胶原纤维 ( 图 3C); 至 DEN 处理 6 周后, 斑马鱼肝脏组织可观察到胶原纤维过度沉积 ( 图 3D) A B C D 图 1 斑马鱼肝组织 HE 染色观察 Fig.1 HE staining of zebrafish liver tissue in control group (A) and DEN-treated groups at 2 weeks (B), 4 weeks (C) and 6 weeks (D) (Original magnification: 400).

780 http://www.j-smu.com J South Med Univ, 2014, 34(6): 777-782 A B C D 图 2 斑马鱼肝组织 Gomori 氏网状纤维染色 Fig.2 Gomori staining of zebrafish liver tissue in control group (A) and DEN-treated groups at 2 weeks (B), 4 weeks (C) and 6 weeks (D) (Original magnification: 400). A B C D 图 3 斑马鱼肝组织苦味酸天狼星红染色 Fig.3 Sirius red staining of zebrafish liver tissue in control group (A) and DEN-treated groups at 2 weeks (B), 4 weeks (C) and 6 weeks (D) (Original magnification: 400). 2.7 斑马鱼肝脏炎症反应及肝纤维化病变发生率上述病理染色结果显示,DEN 对斑马鱼肝脏损伤病变严重程度具有时间依赖性, 随着 DEN 处理时间延长, 斑马鱼肝脏炎性病变的发生率分别为 60%(2 周 ) 80%(4 周 ) 及 100%(6 周 ), 肝脏纤维病变的发生率则由 30%(4 周 ) 增加到 80%(6 周 ), 见图 4 在造模 2 周 4 周

Histopathology constituent ratio J South Med Univ, 2014, 34(6): 777-782 http://www.j-smu.com 781 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 6 周末,DEN 处理组分别较相应的对照组肝脏病变严重, 两者肝脏病变程度具有统计学差异,P 值分别为 0.004(2 周 ) 小于 0.001(4 6 周 ) 3 讨论 Control DEN 2 w DEN 4 w DEN 6 w 图 4 斑马鱼肝脏组织病理学改变构成比 Fig.4 Histopathology constituent ratio of zebrafish liver. 肝纤维化是肝脏长期受到刺激所引起的弥漫性细胞外基质过度沉积的病理改变过程, 可进一步发展为肝硬化甚至肝癌尽管早期针对病因治疗及时干预原发疾病能够有效控制疾病进展, 然而, 目前临床尚无疗效肯定的直接抗肝纤维化药物肝纤维化动物模型能够应用于肝纤维化发病机制的研究, 药物筛选以及肝纤维化疾病防治的策略等, 是肝纤维化研究的基础因此, 建立稳定可靠的肝纤维化动物模型具有重要意义 DEN 作为一种经典的肝纤维化造模毒性药物, 在啮齿类动物模型中多采用腹腔注射途径给药基于物种自身特性, 斑马鱼的给药途径有腹腔注射和直接浸泡两种方式, 腹腔注射有助于药物浓度的控制及药效发挥, 然而, 由于斑马鱼体型小且无法长时间脱离水面, 该方法要求实验人员操作迅速, 动作轻柔, 技术难度较高此外,DEN 为水溶性物质, 在室温下理化性质较稳定, 符合建立斑马鱼模型的药物条件且能够采用直接浸泡的方式给药因此, 本研究采用将 DEN 直接投放入饲养缸的方法诱导斑马鱼肝纤维化的形成在鱼龄的选择上, 尽管孵育 5 d 大的斑马鱼各个器官均已发育完整, 然而由于 DEN 为强致癌药物, 并且通过前期的预实验发现 DEN 对胚胎的致死作用强, 处理组样本例数无法满足后续实验所需, 为此本研究选用成鱼进行造模据报道,DEN 已用于诱导斑马鱼肝脏肿瘤的形成,Mizgireuv [17] 等学者采用 2 月龄幼鱼成功建立肝脏肿瘤模型, 考虑到 2 月龄斑马鱼尚未成年, 存在毒性药物对其致死致癌作用较强, 肝纤维化向肝癌过渡时间短等情况, 我们最终选择采用 3 月龄成年斑马鱼诱导建模 Normal Inflamation 研究表明,DEN 肝纤维化模型的建立具有造模时间短动物死亡率低纤维化模型相对稳定且与人类肝硬化早期改变相似等优 [22] 点在以大鼠为实验动物的肝纤维化模型中,DEN 处理 4 周末大鼠肝细胞点状坏死及炎性细胞浸润 ;8 周末, 肝细胞严重炎症反应可见灶性坏死, 门管区出现纤维组织增生 ; 至 9~12 周造模结束时, 增生的胶原束包 [22-24] 绕并分割肝小叶, 假小叶形成与大鼠病理改变相似, 斑马鱼肝脏炎症反应和纤维化程度随着 DEN 给药时间的延长逐渐严重 4 周末处理组 80% 的斑马鱼肝脏出现明显的炎症反应, 其中 30% 的斑马鱼肝脏炎症反应与肝纤维化并存, 网状纤维过度沉积 ; 至造模 6 周结束时处理组全部斑马鱼肝脏均可见炎性细胞浸润局部肝细胞变性坏死, 其中 80% 的斑马鱼肝组织网状纤维和胶原纤维合成分泌异常增多, 可见纤维结节形成由此可见, 尽管斑马鱼肝脏组织结构与哺乳类动物存在种属差异性, 但是,DEN 诱导的斑马鱼肝纤维化模型与哺乳类肝纤维化模型疾病发展演变过程相类似, 这将为哺乳类肝纤维化动物模型难以实现的药物筛选研究提供良好的动物模型与传统肝纤维化动物模型相比, 斑马鱼肝纤维化模型具有以下优势 :1 价格低廉, 饲养管理经济方便 ;2 建模周期短,4~6 周能够诱导肝纤维化的形成 ;3 死亡率低,150 mg/l 浓度 DEN 处理组斑马鱼在造模期间少见死亡现象 ;4 水溶性造模药物可直接加入饲养缸中, 操作简单易行 ;5 繁殖周期短样本量大, 一对成鱼可产几十到几百个受精卵, 易于获得足够的样本量 ;6 生长发育快, 大部分器官 24 h 内发育成熟,3 个月即成年, 能够有效地缩短实验周期可见, 斑马鱼肝纤维化模型弥补了传统肝纤维化动物样本量少, 饲养管理耗费大死亡率高等不足值得提出的是, 斑马鱼全身血容量少血液采集困难, 难以检测转氨酶等肝纤维化评估指标 ; 另外, 由于存在种属差异性, 本研究无法直接采用现有的肝纤维化评分系统评估肝纤维化病变严重程度研究发现, 斑马鱼肝脏胆管系统的组织结构与哺乳类差异较大, 斑马鱼肝内静脉和胆管随机分布, 动脉难以观测, 不同于哺乳动物所具有的典型的门管区, 动脉静脉和胆管 3 种管道 [25] 伴行分布的特点鉴于此, 在哺乳动物肝纤维化分级评估中常用的 ISHAK 和 METAVIR 评分系统 ( 主要依据肝脏炎症坏死部位纤维化部位和肝脏细胞结构血管结构改变对肝纤维化严重程度进行评估 ) 无法直接应用于斑马鱼肝脏纤维化评估和分级其次, 肝组织穿刺活检是国际公认的评价肝纤维化程度的金标准, 肝组织穿活检能够检测肝脏纤维化病变的活动程度, 并对纤 Liver fibrosis

782 http://www.j-smu.com J South Med Univ, 2014, 34(6): 777-782 维化的分级进行准确评估同时, 肝组织活检对肝脏损伤的预测作用较 ALT 等血清学检测具有更高的敏感性和特异性, 因此本研究采用肝组织病理染色分析的方法评估肝纤维化病变情况, 符合临床诊断标准再者, 目前学术界尚无针对斑马鱼肝脏纤维化的评价标准, 本实验应用斑马鱼建立肝纤维化模型亦属学术界首次, 因此仅以肝组织病理切片染色, 观察是否存在肝脏纤维组织增生作为肝纤维化发生与否的评价标准, 仅讨论纤维化的发生与否, 对于肝纤维化病变严重程度的具体评分, 尚有待研究人员进一步讨论制定本研究首次单用 DEN 作为肝毒性药物成功诱导建立斑马鱼肝纤维化模型, 较之于鼠兔等模型, 药物可以通过直接投放至饲养缸的方式给予, 且斑马鱼饲养管理经济方便繁殖周期短, 使其具有操作简单实验耗费低及样本量大等优点, 将为进一步研究肝纤维化的发病机制及药物筛选提供了实验基础致谢 : 本研究以南方医科大学广东省人类疾病斑马鱼模型与药物筛选重点实验室为平台, 特此感谢张文清教授张译月教授以及斑马鱼实验室全体成员的支持与帮助! 参考文献 : [1] Li JT, Liao ZX, Ping J, et al. Molecular mechanism of hepatic stellate cell activation and antifibrotic therapeutic strategies[j]. J Gastroenterol, 2008, 43(6): 419-28. [2] Friedman SL. Mechanisms of hepatic fibrogenesis[j]. Gastroenterology, 2008, 134(6): 1655-69. [3] Muhanna N, Abu Tair L, Doron S, et al. Amelioration of hepatic fibrosis by NK cell activation[j]. Gut, 2011, 60(1): 90-8. [4] Thomas JA, Pope C, Wojtacha D, et al. Macrophage therapy for murine liver fibrosis recruits host effector cells improving fibrosis, regeneration, and function[j]. Hepatology, 2011, 53(6): 2003-15. [5] Kawelke N, Vasel M, Sens C, et al. Fibronectin protects from excessive liver fibrosis by modulating the availability of and responsiveness of stellate cells to active TGF-β[J]. PLoS One, 2011, 6(11): e28181. [6] Ellis EL, Mann DA. Clinical evidence for the regression of liver fibrosis[j]. J Hepatol, 2012, 56(5): 1171-80. [7] Marcellin P, Gane E, Buti M, et al. Regression of cirrhosis during treatment with tenofovir disoproxil fumarate for chronic hepatitis B: a 5-year open-label follow-up study[j]. Lancet, 2013, 381 (9865): 468-75. [8] Starkel P, Leclercq IA. Animal models for the study of hepatic fibrosis[j]. Best Pract Res Clin Gastroenterol, 2011, 25(2): 319-33. [9] Grunwald DJ, Eisen JS. Headwaters of the zebrafish -- emergence of a new model vertebrate[j]. Nat Rev Genet, 2002, 3(9): 717-24. [10]Staudt D, Stainier D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish[j]. Annu Rev Genet, 2012, 46: 397-418. [11]Wingert RA, Davidson AJ. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation[j]. Kidney Int, 2008, 73(10): 1120-7. [12]Rinkwitz S, Mourrain P, Becker TS. Zebrafish: an integrative system for neurogenomics and neurosciences[j]. Prog Neurobiol, 2011, 93(2): 231-43. [13]Passeri MJ, Cinaroglu A, Gao C, et al. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation[j]. Hepatology, 2009, 49(2): 443-52. [14]Thakur PC, Stuckenholz C, Rivera MR, et al. Lack of de novo phosphatidylinositol synthesis leads to endoplasmic reticulum stress and hepatic steatosis in cdipt-deficient zebrafish [J]. Hepatology, 2011, 54(2): 452-62. [15]North TE, Babu IR, Vedder LM, et al. PGE2-regulated wnt signaling and N-acetylcysteine are synergistically hepatoprotective in zebrafish acetaminophen injury[j]. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(40): 17315-20. [16]Mizgireuv IV, Revskoy SY. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish[j]. Cancer Res, 2006, 66(6): 3120-5. [17]Mizgirev I, Revskoy S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors[j]. Nat Protoc, 2010, 5(3): 383-94. [18]Fujisawa K, Terai S, Hirose Y, et al. Senescence marker protein 30 (SMP30)/regucalcin (RGN) expression decreases with aging, acute liver injuries and tumors in zebrafish[j]. Biochem Biophys Res Commun, 2011, 414(2): 331-6. [19]Rekha RD, Amali AA, Her GM, et al. Thioacetamide accelerates steatohepatitis, cirrhosis and HCC by expressing HCV core protein in transgenic zebrafish Danio rerio[j]. Toxicology, 2008, 243(1/2): 11-22. [20]Liu W, Chen JR, Hsu CH, et al. A zebrafish model of intrahepatic cholangiocarcinoma by dual expression of hepatitis B virus X and hepatitis C virus core protein in liver[j]. Hepatology, 2012, 56(6): 2268-76. [21]Jia R, Cao L, Du J, et al. The protective effect of silymarin on the Carbon tetrachloride (CCl4)-induced liver injury in common carp (Cyprinus carpio)[j]. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 2013, 49(3): 155-61. [22] 王晓昆, 唐瑛. 肝纤维化动物模型研究进展 [J]. 动物医学进展, 2007, 28(3): 95-8. [23] 李彦, 李小弟, 廖明. 二乙基亚硝胺诱发大鼠肝纤维化 - 肝癌动物模型的建立 [J]. 实验动物科学, 2013, 30(5): 20-3. [24] 玉苏甫吐尔逊, 哈木拉提吾甫尔, 阿不都卡德尔库尔班, 等. 二乙基亚硝胺诱发大鼠肝硬化模型的建立及病理学研究 [J]. 新疆医科大学学报, 2011, 34(3): 261-4. [25] 初晓红, 濮俊毅, 姚一琳, 等. 斑马鱼肝脏胆管系统的研究 [J]. 实验动物与比较医学, 2010, 30(3): 167-73. ( 编辑 : 孙昌朋 )