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48 临床与病理杂志 J Clin Pathol Res 2015, 35(1) http://www.lcbl.net doi: 10.3978/j.issn.2095-6959.2015.01.014 View this article at: http://dx.doi.org/10.3978/j.issn.2095-6959.2015.01.014 CREPT 与 CyclinD3 在非小细胞肺癌中的表达及相关性研究 李维妙, 夏靖华, 王雪娇, 王磊, 文苗苗, 孙盈, 范亮波, 邢昊, 程庆书, 张志培 ( 第四军医大学唐都医院胸腔外科, 西安 710038) [ 摘要 ] 目的 : 检测 CREPT(cell-cycle related and expression-elevated protein in tumor) 与细胞周期蛋白 D(CyclinD3) 在非小细胞肺癌 (non-small cell lung cancer,nsclc) 中的表达, 分析二者在促进 NSCLC 发生发展过程中的作用 方法 : 免疫组织化学法检测 CREPT CyclinD3 在 271 例 NSCLC 及相应正常组织中的表达情况, 统计学分析二者间的相关性及其在临床病理因素中的差异性 结果 :CREPT 和 CyclinD3 定位于细胞核与细胞质中, 在 NSCLC 组织中高表达, 癌组织与正常组织中阳性表达率差异性极显著 ( ) CREPT CyclinD3 在腺癌 鳞癌间表达无统计学差异 ( P=0.638, P=0.503); 在总 NSCLC 腺癌 鳞癌的病理分级间, 表达均具有极显著性差异 ( ); 在总 NSCLC 组织 TNM 分期 淋巴结是否转移间的表达差异性显著 ( P=0.025, P=0.001; P=0.003, P=0.026); 在总 NSCLC 腺癌 鳞癌中,CREPT 和 CyclinD3 表达秩相关系数 r 分别是 0.458 0.393 0.468;, 二者具有正相关性 结论 :CREPT 和 CyclinD3 是 NSCLC 组织与相应正常组织表达的差异蛋白, 二者的过表达可能在 NSCLC 的发生发展过程中起作用 [ 关键词 ] 非小细胞肺癌 ;CREPT;CyclinD3 Expression and correlation of CREPT and CyclinD3 in non-small cell lung cancer LI Weimiao, XIA Jinghua, WANG Xuejiao, WANG Lei, WEN Miaomiao, SUN Ying, FAN Liangbo, XING Hao, CHENG Qingshu, ZHANG Zhipei (Department of Thoracic Surgery, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi an 710038, China) Abstract Objective: To investigate the expression of CREPT and CyclinD3 in NSCLC, and the role of them in NSCLC occurrence and development process. Methods: The expression of CREPT and CyclinD3 in 271 pairs of NSCLC and corresponding normal tissues were detected by immunohistochemical method. The correlation between CREPT and CyclinD3 expression as well as the difference in clinico-pathological parameters were analyzed by statistical method. Results: Positive staining of CREPT and CyclinD3 were in cytoplasm and nucleus. The positive expression rates of the CREPT and CyclinD3 protein in NSCLC was significantly higher than those in the corresponding normal tissue (all ). The expression of CREPT and CyclinD3 were no significant differences in among groups of lung adenocarcinoma and squamous cell lung cancer (P=0.638; P=0.503), but 收稿日期 (Date of reception):2014 11 06 通信作者 (Corresponding author): 张志培,Email: zzpzyy@fmmu.edu.cn; 程庆书,Email: chechest@fmmu.edu.cn

CREPT 与 CyclinD3 在非小细胞肺癌中的表达及相关性研究李维妙, 等 49 Keywords there were extremely significant difference in pathological grading groups of NSCLC, adenocarcinoma, squamous cell carcinoma (all ). There were significant difference in the CREPT and CyclinD3 expression among various groups of clinical stages and lymph node metastasis or not (P=0.025, P=0.001; P=0.003, P=0.026). The protein expression level of CREPT was positively related with that of CyclinD3 in NSCLC, adenocarcinoma, squamous cell carcinoma(r=0.458, r=0.393, r=0.468; all ). Conclusion: Our data suggest that CREPT and CyclinD3 were differentially expressed proteins in NSCLC tissues and corresponding normal tissues and those over-expressed proteins being crucial for NSCLC occurrence and development non-small cell lung cancer; CREPT; CyclinD3 肺癌是全世界公认的恶性肿瘤之一, 其中非 小细胞肺癌 (non-small cell lung cancer,nsclc) 占肺癌总数的 75%~85%, 严重危害人类的生命安 全 [1] 了解 NSCLC 发生发展原因, 对 NSCLC 的 预防与治疗具有重大意义 肿瘤发生发展是多 因素影响 十分复杂的问题, 细胞周期失调是肿 瘤发生发展的关键因素之一, 而细胞周期蛋白 D(CyclinD) 作为细胞周期的启动因子, 在调控细 胞周期过程中具有重要作用, 其与细胞周期蛋白 依赖性激酶 (cyclin-dependent kinase, CDKs) 结 合后, 能促进 G1-S 期的转换, 导致细胞增殖 CyclinD3 作为细胞周期蛋白 D 的亚型之一, 广泛 表达于各类细胞中, 且已被证实在促进细胞周期 G1-S 期转换过程中具有重要作用 [2-3] CREPT 是新发现的人类肿瘤相关蛋白, 它能 够同时结合转录关键酶 RNA 聚合酶 II 和癌基因启 动子, 促进基因组形成染色质环, 增强癌基因的 转录 [4-5] 目前, 关于 CyclinD1 过表达影响 NSCLC 的研究很多 [6], 但关于 CyclinD3 在 NSCLC 中表 达的研究较少 ;CREPT 在 NSCLC 中的表达及与 CyclinD3 表达的关联性和它们对 NSCLC 发生发展 的影响 作用尚未清楚 因此, 本文检测 CREPT 与 CyclinD3 在 NSCLC 中的表达, 探讨二者间相互 关系及在 NSCLC 发生发展中的作用, 为 NSCLC 预 防 治疗提供参考 1 材料与方法 1.1 标本来源 收集 2006 年 3 月 ~2011 年 12 月第四军医大学 唐都医院胸外科手术切除原发性 NSCLC 配对标本 271 例, 正常组织为取自癌旁 5 cm 以上且病理检查 为正常形态的肺组织 其中男 204 例, 女 67 例 中 位年龄 61 岁 (36~78 岁 ) 术后 TNM 分期为 I~IV 期, 分别为 69 101 98 3 例 所取标本经中性福尔马林固定, 脱水 透明, 常规石蜡包埋 组织病理分型 分级由病理科诊断, 腺癌 116 例, 高分化 9 例, 中分化 84 例, 低分化 23 例 ; 鳞癌 155 例,I 级 6 例, II 级 101 例,III 级 48 例 该研究已通过第四军医大学唐都医院伦理委员会批准, 所有入组患者或其家属均已签署书面知情同意书 1.2 试剂 CREPT 蛋白抗体为 GeneTex 商品化兔源性抗体,CyclinD3 蛋白抗体为 Cell Signaling 商品化鼠源性抗体,EnVision TM 两步法免疫组化试剂盒购自西安基因公司 DAKO 产品 1.3 免疫组织化学法免疫组化染色采用 EnVision TM 两步法 : 将福尔马林固定 石蜡包埋的病理组织块经 4 μm 连续切片, 二甲苯脱蜡, 梯度浓度乙醇水化 ;3 mol/l 尿素消化 ; 柠檬酸缓冲液微波修复, 冷却至室温 ;3% 新鲜配制的 H 2 O 2 溶液封闭内源性过氧化物酶活性 ;10% 羊血清封闭 ; 加一抗 4 过夜 ;37 复温 ; 加二抗,37 恒温反应 ( 除血清封闭外, 其余各步后均需用 PBS 漂洗 ) ; 加 DAB 显色, 显微镜观察, 终止显色 苏木精轻微复染, 盐酸酒精分化, 充分水洗返蓝, 梯度酒精脱水, 二甲苯透明, 中性树胶封片, 光镜下观察 对照组设阳性 阴性和空白对照, 用已知阳性表达组织作为阳性对照, 以 PBS 代替一抗作为空白对照 1.4 统计学处理采用 SPSS 17.0 对免疫组化结果数据进行统计学分析 :CREPT CyclinD3 在 NSCLC 组织和正常组织中表达的差异性用 Wilcoxon(W) 检验 ; 在组织病理分型 淋巴结是否转移中的表达差异性用

50 临床与病理杂志, 2015, 35(1) http://www.lcbl.net Mann-Whitney U 秩和检验 ; 在组织病理分级及临床 TNM 分期中的表达差异性用 Kruskal-Wallis H 秩和检验 ; 两者表达的相互关系用 Spearman 秩相关检验, 以 r 表示秩相关系数 2 结果 2.1 CREPT CyclinD3 的定位及其在 NSCLC 组织与正常组织中的表达 CREPT 和 CyclinD3 定位于细胞核与细胞质中,NSCLC 组织中高表达 ( 图 1), 总阳性率分别为 96.68%(262/271) 86.72%(235/271), 相应病例正常组织阳性率分别是 42.07%(114/271) 8.12%(22/271); CREPT CyclinD3 在腺癌 鳞癌中的阳性率分别为 96.55%(112/116) 90.52%(105/116) 96.77%(150/155) 83.87%(130/155), 相应病例正常组织阳性 率分别是 42.24%(49/116) 6.70%(8/116) 41.94%(65/155) 9.03%(14/155) 经统计学分析,CREPT CyclinD3 在总 NSCLC 腺癌 鳞癌组织与相应正常组织中的表达均有差异, 差异极显著,, 见表 1~2 2.2 NSCLC 组织病理分型 分级间 CREPT CyclinD3 表达的差异性 CREPT CyclinD3 在腺癌与鳞癌间表达无统计学差异 (P=0.638,P=0.503); 在腺癌与鳞癌的不同病理分级间,CREPT CyclinD3 表达均具有极显著性差异 (), 见表 3 2.3 NSCLC 组织 TNM 分期中 CREPT 和 CyclinD3 表达的差异性 CREPT CyclinD3 在 NSCLC 组织的不同 TNM 分期间, 表达差异显著 (P=0.025,P=0.001), 见表 3 A B C D E F 图 1 CREPT 和 CyclinD3 在 NSCLC 中的表达 Figure 1 The expression of CREPT, CyclinD3 in NSCLC A, D: lung adenocarcinoma (Envision 200); B, E: squamous cell lung cancer (Envision 200); A, B: positive staining of CREPT; D, E: positive staining of CyclinD3; C: negative staining of CREPT in normal lung (Envision 100); F: blank (Envision 200). 表 1 CREPT 在癌组织和相应正常组织中表达差异性 Table 1 The difference of CREPT expression in NSCLC and corresponding normal lung tissue 正常 NSCLC 腺癌 鳞癌 组织 + ++ +++ 合计 统计值 + ++ +++ 合计 统计值 + ++ +++ 合计 统计值 9 49 94 5 157 4 22 38 3 67 5 27 56 2 90 + 0 5 79 20 104 Z= 14.248; 0 2 36 8 46 Z= 9.341; 0 3 43 12 58 Z= 10.775; ++ 0 0 3 7 10 0 0 1 2 3 0 0 2 5 7 合计 9 54 176 32 271 4 24 75 13 116 5 30 101 19 155

CREPT 与 CyclinD3 在非小细胞肺癌中的表达及相关性研究李维妙, 等 51 2.4 CREPT 及 CyclinD3 在 NSCLC 组织是否有淋巴结转移时表达的差异性 CREPT 及 CyclinD3 在 NSCLC 组织淋巴结转移与否间的表达有显著性差异 (P=0.003,P=0.026), 见表 3 2.5 CREPT 和 CyclinD3 在 NSCLC 组织中蛋白表达相关性检验经 Spearman 秩相关检验, 在总 NSCLC 腺癌 鳞癌组织中 CREPT 和 CyclinD3 蛋白表达秩相关系数 r 分别是 0.458 0.393 0.468,, 即二者存在正相关性, 见表 4 表 2 CyclinD3 在癌组织和相应正常组织中表达差异性 Table 2 The difference of CyclinD3 expression in NSCLC and corresponding normal lung tissue 正常 NSCLC 腺癌鳞癌组织 + ++ +++ 合计统计值 + ++ +++ 合计统计值 + ++ +++ 合计统计值 36 100 107 6 249 11 46 48 3 108 25 54 59 3 141 Z= 13.604; Z= 9.071; Z= 10.775; + 0 3 19 0 22 0 2 6 0 8 0 1 13 0 14 合计 36 103 126 6 271 11 48 54 3 116 25 55 72 3 155 表 3 CREPT 和 CyclinD3 在 NSCLC 不同分组中表达的差异性 Table 3 expression of CREPT and CyclinD3 in different groups of NSCLC 组别 n CREPT 表达 CyclinD3 表达 + ++ +++ 统计值 + ++ +++ 统计值 病理分型 腺癌 116 4 24 75 13 Z= 0.471; 11 48 54 3 Z= 0.669; 鳞癌 155 5 30 110 19 P=0.638 25 55 72 3 P=0.503 病理分级 NSCLC 271 高 2 11 2 0 8 6 1 0 χ 2 =45.165; χ 2 =31.231; 中 7 41 119 18 23 81 78 3 低 0 2 55 14 5 16 47 3 腺癌 116 高 2 6 1 0 5 3 1 0 χ 2 =23.643; χ 2 =15.562; 中 2 17 57 8 6 38 38 2 低 0 1 17 5 0 7 15 1 鳞癌 155 高 0 5 1 0 3 3 0 0 χ 2 =22.022; χ 2 =17.347; 中 5 24 62 10 17 43 40 1 低 0 1 38 9 5 9 32 2 TNM 分期 NSCLC 271 I 2 20 43 4 5 31 32 1 II 5 25 55 16 χ 2 =9.325; 24 36 39 2 χ 2 =15.742; III 2 9 75 12 P=0.025 7 36 52 3 P=0.001 IV 0 0 3 0 0 0 3 0 淋巴结是否转移转移 150 7 19 100 24 Z= 2.996; 20 47 77 6 Z= 2.225; 未转移 121 2 35 76 8 P=0.003 16 56 49 0 P=0.026

52 临床与病理杂志, 2015, 35(1) http://www.lcbl.net 表 4 CREPT 和 CyclinD3 在 NSCLC 腺癌 鳞癌中表达的相关性 Table 4 The correlation of CREPT expression with CyclinD3 expression in NSCLC, lungadenocarcinoma, squamous cell cancer CyclinD3 CREPT NSCLC 腺癌鳞癌 + ++ +++ 合计统计值 + ++ +++ 合计统计值 + ++ +++ 合计统计值 6 3 0 0 9 2 2 0 0 4 4 1 0 0 5 + 15 26 13 0 54 5 13 6 0 24 10 13 7 0 30 r=0.458; r=0.393; r=0.468; ++ 15 77 82 2 176 4 32 38 1 75 11 45 44 1 101 +++ 0 2 26 4 32 0 1 10 2 13 0 1 16 2 19 合计 36 108 121 6 271 11 48 54 3 116 25 60 67 155 3 讨论 细胞周期是一个严格有序的运转过程, 有 G1/S G2/M 纺锤体组装三个控制点,G1/S 点对 启动细胞周期起关键作用 CyclinD 是细胞通过 G1/S 点进行增殖的重要蛋白, 其异常表达与肿瘤发生 发展极为密切 CyclinD3 是广泛表达的 D 类细胞周 期蛋白 [7-8], 有发现其在乳腺癌 [9-10] [11] 黑色素瘤等 [12-14] 多种肿瘤中存在异常表达情况 CyclinD3 在 [8] NSCLC 中的研究相对较少,Usuda 等的报道中推 测 CyclinD3 可能与 NSCLC 的发展相关 肿瘤相关 基因 CREPT 定位于人类 20 号染色体上, 含 7 个外显 子, 其 ORF 为 978bp, 编码 326 个氨基酸序列, 序 列相似性分析显示,CREPT 与 p15rs 有 67% 的同源 性 [5] CREPT 能加速 CyclinD1 的转录, 最终促进肿 瘤的发生发展 [4-5] 基于已证实的结论, 我们推测 CREPT 能否对 CyclinD3 表达进行调控, 影响细胞周期进展 本文 应用免疫组化法检测 271 例 NSCLC 样本中 CREPT 及 CyclinD3 蛋白表达 结果显示 :CREPT CyclinD3 在 NSCLC 组织较正常组织中高表达 ; 二者在总 NSCLC 腺癌 鳞癌分组的癌组织与正常组织中表 达均存在极显著性差异, 说明 CREPT CyclinD3 在 NSCLC 组织中同时存在过表达现象, 为 NSCLC 的差 异蛋白 ; 在腺癌 鳞癌间 CREPT CyclinD3 表达均 无统计学差异, 提示 CREPT 和 CyclinD3 在 NSCLC 中 的表达程度与组织病理分型无关 有报道 [15] CyclinD3 的过表达与肝癌组织病理 分级有关, 而 CREPT 和 CyclinD3 在总 NSCLC 腺 癌 鳞癌的组织病理分级间差异性极显著 高分化 细胞中表达的阳性强度低, 即 CREPT 和 CyclinD3 在 NSCLC 中的表达强度与组织病理分级呈负相关趋 势 提示,CREPT 和 CyclinD3 在 NSCLC 中表达高 低与分化程度有关, 分化程度的高低与细胞周期 相关 [16], 因此,CREPT 和 CyclinD3 在 NSCLC 过表 达可能会影响正常的细胞周期 在临床 TNM 分期 间,CREPT CyclinD3 表达差异性显著, 表达的阳 性强度随临床 TNM 分期的增高而增强 Hedberg [13] 的研究显示高表达的 CyclinD3 与肾细胞癌的高 TNM 分期相关, 而 CREPT 的过表达与子宫内膜癌高床分 期相关 [17], 说明 CREPT 和 CyclinD3 高表达可能在促 进 NSCLC 的发生发展方面起作用 在 NSCLC 组织 淋巴结转移与否间,CREPT 及 CyclinD3 的表达差异 性显著 淋巴结转移组中 CREPT 和 CyclinD3 表达阳 性强度较未转移组更高, 提示 CREPT 和 CyclinD3 高 表达可能促进 NSCLC 淋巴结转移 Spearman 秩相关检验 CREPT 和 CyclinD3 在 NSCLC 总样本 腺癌 鳞癌中的秩相关系数 r 分别是 0.458 0.393 0.468,, 二者在 NSCLC 中表达 存在正相关性 提示,CREPT 和 CyclinD3 中一者表 [4] 达异常会影响另一者的正常表达 有文献已经证 实 CREPT 高表达会促进 CyclinD1 基因转录 因此, 在 NSCLC 中, 可能由于 CREPT 过表达, 导致 CyclinD3 过表达, 细胞周期失调, 促进肿瘤发生发展 以上结论提示 CREPT 和 CyclinD3 是 NSCLC 组 织与相应正常组织表达的差异蛋白 ; 表达的高低 与细胞分化程度的高低和淋巴结转移与否相关, 提示 CREPT 和 CyclinD3 的过表达可能在 NSCLC 的发生发展过程中起作用 Spearman 秩相关检验 分析二者在 NSCLC 中相关性表明, 在 NSCLC 中 CREPT 的过表达可能上调 CyclinD3 的表达, 导致 细胞周期失调, 促进 NSCLC 的发生 发展及侵 袭, 但仍需通过体内外实验进行研究验证 参考文献 1. 郭继武, 马彬, 周慧银, 等. 吉非替尼治疗非小细胞肺癌的 meta 分

CREPT 与 CyclinD3 在非小细胞肺癌中的表达及相关性研究李维妙, 等 53 析 [ J]. 中国肺癌杂志, 2011, 14(4): 351-357. GUO Jibin, MA Bin, ZHOU Huiyin, et al. Gefititfinfib fior Non-small Cell Lung Cancer: meta-analysis[ J]. Chin J Lung Cancer, 2011, 14(4): 351-357. 2. Bartkova J, Lukas J, Müller H, et al. Cyclin D1 protein expression and function in human breast cancer[ J]. Int J Cancer, 1994, 57(3): 353-361. 3. Chen Q, Lin J, Jinno S, et al. Overexpression of Cdk6-cyclin D3 highly sensitizes cells to physical and chemical transformation[ J]. Oncogene, 2003, 22(7): 992-1001. 4. Lu D, Wu Y, Wang Y, et al. CREPT accelerates tumorigenesis by regulating the transcription of cell-cycle-related genes[ J]. Cancer Cell, 2012, 21(1): 92-104. 5. 吴银院. P15RS 和 CREPT 对肿瘤和 Wnt 信号通路的作用 [D]. 北京 : 清华大学, 2010. WU Yinyuan. The role of p15rs and CREPT in tumor and wnt signaling pathway[d]. Bei Jing: Tsinghua University, 2010. 6. Jin M, Inoue S, Umemura T, et al. Cyclin D1, p16 and retinoblastoma gene product expression as a predictor for prognosis in non-small cell lung cancer at stages I and II[ J]. Lung Cancer, 2001, 34(2): 207-218. 7. Bartkova J, Lukas J, Strauss M, et al. Cyclin D3: requirement for G1/S transition and high abundance in quiescent tissues suggest a dual role in proliferation and differentiation[ J]. Oncogene, 1998, 17(8): 1027-1037. 8. Usuda H, Saito T, Emura I, et al. Immunohistochemistry of cyclin D3 in pulmonary carcinomas[ J]. Virchows Arch, 1996, 428(3): 159-163. 9. Bukholm IR, Bukholm G, Nesland JM. Over-expression of cyclin A is highly associated with early relapse and reduced survival in patients with primary breast carcinomas[ J]. Int J Cancer, 2001, 93(2): 283-287. 10. Wong SC, Chan JK, Lee KC, et al. Differential expression of p16/p21/ p27 and cyclin D1/D3, and their relationships to cell proliferation, apoptosis, and tumour progression in invasive ductal carcinoma of the breast[ J]. J Pathol, 2001, 194(1): 35-42. 11. Flørenes VA, Faye RS, Maelandsmo GM, et al. Levels of cyclin D1 and D3 in malignant melanoma: deregulated cyclin D3 expression is associated with poor clinical outcome in superficial melanoma[ J]. Clin Cancer Res, 2000, 6(9): 3614-3620. 12. Ito Y, Takeda T, Wakasa K, et al. Expression and possible role of cyclin D3 in human pancreatic adenocarcinoma[ J]. Anticancer Res, 2001, 21(2A): 1043-1048. 13. Hedberg Y, Roos G, Ljungberg B, et al. Cyclin D3 protein content in human renal cell carcinoma in relation to cyclin D1 and clinicopathological parameters[ J]. Acta Oncol, 2002, 41(2): 175-181. 14. Miehlke S, Yu J, Ebert M, et al. Expression of G1 phase cyclins in human gastric cancer and gastric mucosa of first-degree relatives[ J]. Dig Dis Sci, 2002, 47(6): 1248-1256. 15. Zhu MH, Ni CR, Zhu Z, et al. Immunohistochemical demonstration of cyclins A, B, D1, D3 and E in hepatocellular carcinomas using tissue microarrays[ J]. Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi, 2003, 32(5): 440-443. 16. Wu MY, Zhuang CX, Yang HX, et al. Expression of Egr-1, c-fos and cyclin D1 in esophageal cancer and its precursors: An immunohistochemical and in situ hybridization study[ J]. World J Gastroenterol, 2004, 10(4): 476-480. 17. Wang Y, Qiu H, Hu W, et al. RPRD1B promotes tumor growth by accelerating the cell cycle in endometrial cancer[ J]. Oncol Rep, 2014, 31(3): 1389-1395. 本文引用 : 李维妙, 夏靖华, 王雪娇, 王磊, 文苗苗, 孙盈, 范亮波, 邢昊, 程庆书, 张志培. CREPT 与 CyclinD3 在非小细胞肺癌中的表达及相关性研究 [ J]. 临床与病理杂志, 2015, 35(1): 48-53. doi: 10.3978/j.issn.2095-6959.2015.01.014 Cite this article as: LI Weimiao, XIA Jinghua, WANG Xuejiao, WANG Lei, WEN Miaomiao, SUN Ying, FAN Liangbo, XING Hao, CHENG Qingshu, ZHANG Zhipei. Expression and correlation of CREPT and CyclinD3 in non-small cell lung cancer[ J]. Journal of Clinical and Pathological Research, 2015, 35(1): 48-53. doi: 10.3978/ j.issn.2095-6959.2015.01.014