第 38 卷第 1 期 南京医科大学学报 ( 自然科学版 ) ACTA UNIVERSITATIS MEDICINALIS NANJING(Natural Science) 1371 217 年江苏省食源性疾病中致泻大肠埃希氏菌的感染状况及耐药性分析 * 唐震, 沈赟, 秦思, 郑东宇, 马恺, 乔昕, 周永林 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 219 [ 摘要 ] 目的 : 了解江苏省食源性疾病病例中致泻大肠埃希氏菌的感染 耐药及病原学特征, 为疾病防控及临床治疗提供依据 方法 : 收集 217 年江苏省 48 家食源性疾病哨点医院腹泻患者粪便或肛拭子标本, 采用传统分离培养结合荧光定量 PCR 方法, 检测 5 种致泻大肠埃希氏菌并进行分型鉴定, 对其感染状况进行流行病学分析 ; 采用微量肉汤稀释法测定 266 株致泻大肠埃希氏菌对 8 类 14 种抗菌药物的耐药性 结果 : 在 9 884 份粪便或肛拭子样本中, 检出 289 份致泻大肠埃希氏菌 (2.92%),5 种病原型别中检出率最高为肠黏附性大肠埃希氏菌 (EAEC,1.53%), 其次为肠产肠毒素大肠埃希氏菌 (ETEC,.81%) 和肠致病性大肠埃希氏菌 (EPEC,.54%), 有 2 株菌为双重菌合并感染 ; 致泻大肠埃希氏菌夏秋季节检出较高, 其中 8 月份检出率最高 ; 男性 女性检出率分别为 2.78% 和 3.8%, 差异无统计学意义 (χ 2 =.81,P>.5); 在年龄分布上,<1 岁组检出最高 (4.55%),1~5 岁组其次 (4.6%), 不同年龄组检出率有统计学意义 (χ 2 =45.78,P<.1); 致泻大肠埃希氏菌呈现较高的耐药率 (91.35%), 耐药率最高的抗菌药物是氨苄西林 (64.3%), 其次是萘啶酸 (6.9%) 和四环素 (51.9%); 多重耐药率达到 6.9%, 其中 1 株菌耐受 14 种抗菌药物 结论 : 江苏省食源性致泻性大肠埃希菌中 EAEC 感染率最高, 多重耐药情况较为严重,<5 岁的婴幼儿需要重点关注 [ 关键词 ] 致泻大肠埃希氏菌 ; 食源性疾病 ; 感染 ; 耐药 [ 中图分类号 ] R117 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] 17 4368(218)1 1371 5 doi:1.7655/nydxbns21818 Infection status and drug resistance of diarrheogenic Escherichia coli in foodborne diseases in Jiangsu Province,217 Tang Zhen,Shen Yun,Qin Si,Zheng Dongyu,Ma Kai,Qiao Xin,Zhou Yonglin * Center of Disease Control and Prevention of Jiangsu Province,Nanjing 219,China [Abstract] Objective:To analyze pathogenic characteristics of diarrheogenic Escherichia coli(dec)in the patients with food borne diseases in Jiangsu Province;to understand drug resistance status and provide effective basis for better prevention,control and clinical treatment in the future. Methods:The fecal specimens of diarrhea patients in 48 food borne disease sentinel hospitals in Jiangsu Province were collected in 217,5 kinds of DEC were detected by traditional separation culture method combined with fluorescence quantitative PCR. The infection characteristics were analyzed by epidemiological description. At the same time,266 DEC strains were subjected to drug resistance test against 14 antibiotics of 8 categories by micro broth dilution method. Results:Among 9 884 samples of fecal or anal swabs,a total of 289 DEC were detected(accounted for 2.92%),the highest detection rate in 5 types was EAEC (accounted for 1.53%),followed by ETEC(accounted for.81%)and EPEC(accounted for.54%),2 samples were double bacteria combined infection. The positive DEC detection rate was relatively higher in summer,the highest rate was observed in August. The proportions of male and female infection(2.78% and 3.8%,respectively)were approximately equal and no statistical difference was found between different genders(χ 2 =.81,P>.5). For age distribution,the highest rate was detected among the 1 year old group (accounted for 4.55%),followed by 1 5 year old group(accounted for 4.6%),the detection rate of different age groups was statistically significant(χ 2 =45.78,P <.1). The DEC demonstrated high drug resistance rate(accounted for 91.35%),among which ampicillin had the highest drug resistance rate(64.3%),followed by nalidixic acid(6.9%)and tetracycline(51.9%);multi drug [ 基金项目 ] 江苏省科技强卫重点学科项目 (ZDXKA2168) 通信作者 (Corresponding author),e mail:1585829@qq.com
1372 南京医科大学学报 第 38 卷第 1 期 resistance rate was 6.9%,1 strains was resistant to all 14 kinds of antibiotics. Conclusion:The infection rate of EAEC in DEC is the highest among food borne DEC in Jiangsu province. Infants younger than 5 years old require emphasized focus. The multi drug resistance of DEC is relatively serious,which needs to more attention. [Key words] diarrheogenic Escherichia coli;food borne disease;infection;drug resistance [Acta Univ Med Nanjing,218,38(1):1371 1375] 食品安全问题一直是社会关注的重要问题 我国发生的食物中毒事件中, 细菌性食物中毒的人数最多, 占总中毒人数的 45.8% [1] 致泻大肠埃希氏菌 (diarrheagenic Escherichia coli,dec) 是一类常见的能引起人体以腹泻症状为主的大肠埃希氏菌, [2] 可通过污染食物引起人类发病 最常见的 DEC 主要包括 5 种, 分别为肠致病性大肠埃希氏菌 (EPEC) 肠产肠毒素大肠埃希氏菌 (ETEC) 肠侵袭性大肠埃希氏菌 (EIEC) 肠出血性大肠埃希氏菌 (EHEC) 和肠黏附性大肠埃希氏菌 (EAEC) 近年 [3] 来急性腹泻粪便标本中 DEC 的检出率有所增加 此外, 该菌对常用抗菌药物出现的较高耐药性引起了广泛关注 为了解江苏省 DEC 的感染 耐药状况及病原学特征, 现对 217 年江苏省 48 家哨点医院的食源性疾病病例标本进行检测及耐药实验, 为疾病防控及临床治疗提供依据 1 对象和方法 1.1 对象 217 年 1 12 月在江苏省 48 家食源性疾病病原学监测哨点医院, 选取有腹泻症状 ( 每日排便 3 次, 且粪便性状异常, 稀便 水样便 黏液便或脓血便等 ) 的就诊患者, 由哨点医院收集患者的人口学 社会学信息 临床症状 食物暴露危险因素等流行病学资料, 采集粪便或肛拭子标本, 共计 9 884 份 1.2 方法 1.2.1 细菌模板制备取腹泻患者粪便标本或肛拭子悬液接种于 5 ml EC 肉汤 ( 北京陆桥公司 ) 中,37 培养 18 h, 取适量细菌 1 r/min 离心 5 min, 去上清, 沉淀用灭菌超纯水悬浮, 测定细菌浓度约为 3 1 9 CFU/mL;1 煮沸 1 min, 置于冰浴中冷却 ;4 1 r/min 离心 1 min, 取上清 1 μl 作为 PCR 模板 1.2.2 大肠埃希氏菌多重 PCR 分型采用荧光定量 PCR 方法对菌悬液进行 5 种致泻大肠埃希氏菌 (ETEC EPEC EHEC EIEC 和 EAEC) 的分型实验, 具体操作按照 ABT 5 种 DEC 多重 PCR 检测试剂盒 ( 北京卓诚惠生有限公司 ) 说明书进行 1.2.3 细菌的分离与鉴定 将经多重 PCR 毒力基因检测为阳性的肉汤培 养液接种大肠显色平板 ( 广东环凯公司 ) 中进行单 菌落分离培养, 挑取显色平板上蓝绿色菌落, 每个 [4] 平板挑取 5 个或以上可疑菌落, 采用朱敏等报道 的方法进行单个毒力基因确认实验, 并采用全自动 微生物生化鉴定系统 (VITEK 2) 及 GN 卡 ( 法国生物 梅里埃公司 ) 对毒力基因阳性的单个菌株进行生化 鉴定, 根据毒力基因和生化鉴定的结果判定是否为 DEC 1.2.4 药敏试验 MIC 测定 各区市监测实验室将鉴定后确定为 DEC 的菌 株定期上送至省疾控中心实验室进行药敏试验 实验参照美国临床实验室标准化委员会 (CLSI 216 版 ) 发布的抗菌药物种类, 使用微量肉汤稀释 法以全自动药敏加样判读系统及阴性药敏检测板 ( 美国赛默飞世尔公司 ) 测定 DEC 对 8 类共 14 种抗 菌药物的药物敏感型, 抗菌药物为 : 氨苄西林 / 舒巴 坦 (AMS) 头孢噻肟 (CTX) 头孢他啶 (CAZ) 甲氧 苄氨嘧啶 / 磺胺甲噁唑 (SXT) 亚胺硫霉素 (IPM) 四 环素 (TET) 头孢唑啉 (CFZ) 头孢西丁 (CFX) 庆大 霉素 (GEN) 氨苄西林 (AMP) 氯霉素 (CHL) 环丙 沙星 (CIP) 萘啶酸 (NAL) 阿奇霉素 (AZM), 判定结 果分为耐药株 R 中介 I 敏感株 S, 实验采用大肠埃 希氏菌国际标准株 ATCC 25922 作为质控对照 1.3 统计学方法 采用 SPSS 13. 软件进行流行病学数据统计分 析, 检测阳性率比较采用 χ 2 检验,P.5 为差异有 统计学意义 2 结果 2.1 病原检出分布 在全省 48 个监测哨点医院共收集 9 884 例食源 性腹泻患者信息, 其中男 5 215 例, 女 4 669 例, 年龄 最小 48 d, 最大 85 岁 采集 9 884 份粪便或肛拭子 标本, 检出 DEC 阳性 289 份, 总阳性率为 2.92%, 毒
第 38 卷第 1 期 唐震, 沈赟, 秦思, 等. 217 年江苏省食源性疾病中致泻大肠埃希氏菌的感染状况及耐药性分析 [J]. 南京医科大学学报 ( 自然科学版 ),218,38(1):1371-1375 1373 力基因检测与系统生化实验结果吻合 ; 经分型鉴定后确定 EAEC 最多, 为 151 份 (1.53%), 其次为 ETEC 和 EPEC 较多, 分别为 8 份 (.81%) 和 53 份 (.54%), 不同病原之间检出率差异有统计学意义 (χ 2 = 273.3,P<.1) 2 份样本为混合感染, 分别为 ETEC/ EAEC 混合和 EPEC/EAEC 混合 表 1 9 884 例食源性疾病患者 5 种 DEC 检出情况 Table 1 Detection of 5 kinds of DEC in 9 884 patients with foodborne diseases 病原类型阳性数构成比 (%) 检出率 (%) ETEC 8 27.68.81 EIEC 2.69.2 EAEC 151 52.25 1.53 EPEC 53 18.34.54 EHEC 1.35.1 ETEC/EAEC 1.35.1 EPEC/EAEC 1.35.1 合计 289 1. 2.92 2.2 流行病学特征 DEC 男性阳性检出率为 2.78%(145/5 215), 女性为 3.8%(144/4 669), 差异无统计学意义 (χ 2 =.81,P>.5) <1 岁年龄组阳性率最高, 为 4.55%, 其次是 1~5 岁为 4.6%, 其他年龄段阳性率均低于 4.%; 各年龄组阳性率差异有统计学意义 (χ 2 =45.78,P<.1, 表 2),DEC 感染全年均有病例发生,4~11 月出现明显高峰, 阳性率也在 5~1 月呈现高峰 ( 图 1) 2.3 耐药情况各监测点上送 DEC 共 266 株, 省级实验室进行耐药实验结果显示,266 株 DEC 仅有 23 株菌对该 14 种抗菌药物表现为敏感或中介, 其余 243 株 (91.35%) 菌均表现为不同程度的耐药, 对氨苄西林耐药率最高, 达 64.3%, 其次是萘啶酸 (6.9%) 四环素 (51.9%) 甲氧苄氨嘧啶 / 磺胺甲噁唑 (44.7%), 亚胺硫霉素的耐药率最低 (.8%); 对抗菌素耐药谱进行分析表明, 耐 3 种抗菌药物及以上菌株有 162 株 ( 占 6.9%), 耐 7 种抗菌药物及以上的菌株有 41 株 (15.4%), 最高有 1 株菌耐所有 14 种抗菌药物 ( 表 3) 3 讨论本文研究了江苏省食源性疾病患者中 DEC 的感染情况, 对其引起食源性疾病的流行病学发病特征 耐药特征等方面进行了阐述 研究显示, 我省 DEC 的总体检出率为 2.92%, 男女性阳性率无显著差异 表 2 病例数 ( 例 ) 图 1 Figure 1 9 884 例食源性疾病患者不同年龄 性别 DEC 检出情 况 Table 2 年龄 特征 <1 岁 1~5 岁 6~15 岁 16~25 岁 26~35 岁 36~45 岁 46~55 岁 56~65 岁 66~75 岁 75 岁 性别 男 女 合计 2 1 8 1 6 1 4 1 2 1 8 6 4 2 1 月 2 月 217 年江苏省食源性疾病患者 DEC 检出率及季节分布 [5] 泰国 Ratchtrachenchai 等的一项结果显示,12 岁以 下儿童 5 种 DEC 的阳性检出率及排序分别为 EAEC (1.2%) EPEC(3.2%) ETEC(3.%) EIEC(.5%) STEC(.4%) 本文的阳性检出率虽然较泰国的 低, 但 5 种 DEC 的构成比大致相当, 其中 EAEC 检出 率最高, 与河南 上海等地 5 种致泻大肠感染情况调 查基本一致 [4,6] Detection of DEC in 9 884 patients with foodborne diseases with different age and gender 病例数 813 1 698 659 1 317 1 671 952 1 44 841 549 34 5 215 4 669 9 884 阳性数总例数阳性率 3 月 阳性数 4 月 37 69 16 52 56 22 15 13 6 3 145 144 289 5 月 Prevalence and seasonal distribution of DEC in patients with foodborne diseases in Jiangsu Province in 217 6 月 阳性率 (%) 8 月 9 月 5. 4.5 4. 3.5 3. 2.5 2. 1.5 1..5. 文献报道,DEC 是婴幼儿腹泻和旅行者腹泻的 主要致病菌之一, 会引起小范围暴发甚至全球性的 流行 [7-1] 本资料显示,<1 岁的婴儿和 1~5 岁组的 幼儿感染率最高, 分别为 4.55% 和 4.6%, 提示婴幼 儿是 DEC 的易感人群, 可能与该年龄段婴幼儿免疫 7 月 4.55 4.6 2.43 3.95 3.35 2.31 1.44 1.55 1.9.88 2.78 3.8 2.92 1 月 11 月 χ 2 值 45.78.81 12 月 P 值 <.1 >.5 阳性率 (%)
1374 南京医科大学学报 第 38 卷第 1 期 表 3 266 株 DEC 对常用抗菌药物的耐药率 Table 3 Resistance rate of 266 strains of DEC to commonly used antibacterial drugs 耐药 (R) 中介 (I) 敏感 (S) 抗菌药物氨苄西林 / 舒巴坦 (AMS) 头孢噻肟 (CTX) 头孢他啶 (CAZ) 甲氧苄氨嘧啶 / 磺胺甲噁唑 (SXT) 亚胺硫霉素 (IPM) 四环素 (TET) 头孢唑啉 (CFZ) 头孢西丁 (CFX) 庆大霉素 (GEN) 氨苄西林 (AMP) 氯霉素 (CHL) 环丙沙星 (CIP) 萘啶酸 (NAL) 阿奇霉素 (AZM) 6 71 19 119 2 138 92 17 76 171 44 31 162 95 22.6 26.7 7.1 44.7.8 51.9 34.6 6.4 28.6 64.3 16.5 11.7 6.9 35.7 87 3 22 1 68 14 1 11 3 32.7 1.1 8.3...4 25.6 5.3.4. 4.1 1.1.. 119 192 225 147 264 127 16 235 189 95 211 232 14 171 44.7 72.2 84.6 55.3 99.2 47.7 39.8 88.3 71.1 35.7 79.3 87.2 39.1 64.3 力较为低下, 胃肠功能较弱有关, 食用污染食物后 容易引起腹痛腹泻 ;5~9 月 DEC 的发病率较高, 提示 夏季依然是 DEC 的高发季节, 夏季气温较高, 为细 菌滋生繁殖提供了良好的条件, 今后须进一步加强 对低年龄段婴幼儿及夏季腹泻患者的监测 DEC 是常见的食源性致病菌, 传统的检验多采 用增菌 选择性平板分离 可疑菌落生化鉴定 血清 分型等方法, 该方法检验周期长, 费时费力, 漏检现 象多, 且血清凝集方法因其血清型别众多 易出现 交叉凝集现象, 实验往往不能进行到底, 同时进口 血清价格昂贵, 不利于检验人员常规使用 本研究 采用增菌后直接多重荧光定量 PCR 毒力基因检测, 结合典型菌落生化鉴定方法进行鉴定检测, 在一定 程度上优化了实验步骤, 且保证了阳性检出率 [11] 本资料中,<5 岁的婴幼儿 DEC 检出率为 4.34%, 与 文献报道一致, 说明该方法可作为 DEC 的检测鉴定 方法 DEC 种类多, 经常有 2 种及以上病原体合并 感染的现象 [12] 本研究 289 例阳性病例中仅有 2 例 出现了合并感染的现象, 不同类别的 DEC 致病原理 和临床表现不尽相同, 合并感染通常会导致临床症 状更为复杂和严重 文献报道, 食源性致病菌中耐药株, 甚至多重 耐药株不断出现并有上升趋势, 耐受的抗菌药物种 类也日趋增多 [13-14] 大肠杆菌长期寄存在人体的肠 [15] 道内, 极易产生耐药性, 姬华等已经证明大肠杆 菌能以多种方式与沙门氏菌 志贺氏菌等食源性致病 菌交换耐药基因, 增强耐药能力 本资料中,266 株 DEC 中有 243 株菌 (91.35%) 表现为不同程度的耐 药, 耐药率最高的是 β 内酰胺酶类抗菌药物氨苄西 林, 耐药率高达 64.3%, 其次是喹诺酮类的萘啶酸 (6.9%) 四环素类的四环素 (51.9%), 耐药抗菌药 [16] 物种类与张恩等的研究一致 ; 另外有 9 株菌对三 代头孢药物 ( 头孢噻肟和头孢他啶 ) 耐药, 提示 DEC 耐头孢类药物现象严重, 对临床常见的抗菌药物的 高耐药率会给患者的临床治疗带来一定的难度, 需 要引起更多的关注 随着农业和临床抗菌药物的 广泛使用, 多重耐药的大肠杆菌分离率越来越高, 本 研究中耐受 7 种抗菌药物及以上的菌株有 41 株, 最多 1 株耐受 14 种抗菌药物, 说明本省 DEC 多重耐药谱极 广, 耐药情况复杂, 提示需要加强对临床和养殖业抗 菌药物使用的管理, 同时继续加强对 DEC 耐药性监 测和研究, 为更好地防控疾病积累数据 [ 参考文献 ] [1] 卫生部办公厅关于 28 年全国食物中毒报告情况的 通报 [Z]. 北京 : 中华人民共和国卫生部,29 [2] GB4789.6 216 食品安全国家标准 食品微生物学 检验, 致泻大肠埃希氏菌检验 [S]. 北京 : 中国标准出版 社,216 [3] Nyholm O,Halkilahti J,Wiklund G,et al. Comparative ge nomics and characterization of hybrid Shigatoxigenic and Enterotoxigenic Escherichia coli(stec/etec)strains[j]. PLoS One,215,1(8):135936
第 38 卷第 1 期 唐震, 沈赟, 秦思, 等. 217 年江苏省食源性疾病中致泻大肠埃希氏菌的感染状况及耐药性分析 [J]. 南京医科大学学报 ( 自然科学版 ),218,38(1):1371-1375 1375 [4] 朱敏, 谢志强, 赵嘉咏, 等. 河南省腹泻病人 5 种致泻大肠埃希菌感染调查 [J]. 现代预防医学,21,37(6): 1148-115 [5] Ratchtrachenchai OA,Subpasu S,Hayashi H,et al. Preva lence of childhood diarrhoea associated Escherichia coli in Thailand[J]. J Med Microbiol,24,53(3):237-243 [6] 李勇, 顾文超, 唐海丰, 等. 上海市普陀区 212 年 216 年 4 种致泻性大肠埃希菌的监测分析 [J]. 中国卫生检验杂志,217,27(23):3465-3468 [7] Lääveri T,Antikainen J,Pakkanen SH,et al. Prospective study of pathogens in asymptomatic travellers and those with diarrhoea:aetiological agents revisited[j]. Clin Mi crobiol Infect,216,22(6):535-541 [8] Sakkejha H,Byrne L,Lawson AJ,et al. An update on the microbiology and epidemiology of enteropathogenic Esche richia coli England 21 212[J]. J Med Mierobiol, 213,62(1):1531-1534 [9] Croxen MA,Law RJ,Scholz R,et al. Recent advances in understanding enteric pathogenic Escherichia coli[j]. Clin Microbiol Rev,213,26(4):822-88 [1] Humphries RM,Linscott AJ. Laboratory diagnosis of bac terial gastroenteritis[j]. Clin Microbiol Rev,215,28 (1):3-31 [11] 徐丹戈, 黄世旺, 李剑, 等. TaqMan MGB 荧光定量聚合酶链反应快速检测肠聚集性大肠埃希菌 agg R 基因 [J]. 国际流行病学传染病学杂志,214,41(3):155-158 [12] 商晓春, 周晓红, 帅慧群, 等. 婴幼儿感染性腹泻病原学特征分析 [J]. 疾病监测,215,3(1):855-86 [13] Magiorakos AP,Srinivasan A,Carey RB,et al. Multidrug resistant,extensively drug resistant and pandrug resistant bacteria:an international expert proposal for interim stan dard definitions for acquired resistance[j]. Clin Microbi ol Infect,212,18(3):268-281 [14] Pan HJ,Zhang JM,Kuang D,et al. Molecular analysis and anti microbial susceptibility of enterotoxigenic Escherich ia coli from diarrheal patients[j]. Diag Microbiol Infect Dis,215,81(2):126-131 [15] 姬华, 张玫, 卢士玲, 等. 食源性大肠杆菌耐药性与毒力特征的研究进展 [J]. 食品工业科技,214,35(7): 364-367 [16] 张恩, 谢服煜, 周铁丽, 等. 2921 株大肠埃希菌的临床分布与耐药分析 [J]. 中国微生态学杂志,215,27 (9):162-165 [ 收稿日期 ] 218-6-26 连续性数据分组 连续性量值如速率 高度 时间 年龄等分组表示不科学的情形是很常见的 例如 年龄 ( 岁 ) 数据分组为 :1 以下,1~2,2~3,,6~7,7 以上 这是不准确 不科学的 这里其实涉及了极限数值的表示方法 GB/T 817-28 给出的下列允许用语和表示方式 : 从 A 到 B A ~ B, A X B; 超过 A 到 B >A ~ B, A< X B; 至少 A 不足 B A~<B, A X <B; 超过 A 不足 B >A~<B, A< X <B 上述关于年龄不科学的分组可作如下修改 : 1. 如果 1 在第 2 组, 则表示为 : 年龄 ( 岁 ) <1,1~<2,2~<3,,6~<7, 7 2. 如果 1 在第 1 组, 则表示为 : 年龄 ( 岁 ) 1,>1~2,>2~3,,>6~7,>7