技术手册 MagneSil 固定组织基因组 DNA 纯化系统 MagneSil Genomic, Fixed Tissue System MD1490 产品使用说明 CTB319 修订时间 2011.9
MagneSil 固定组织基因组 DNA 纯化系统 所有技术文献的英文原版均可在 www.promega.com/tbs 网站获得 请访问该网址以确定您所使用的技术手册是否为最新版本 如果您在使用本试剂盒的过程中有任何问题, 请与 Promega 北京技术服务部联系 电子邮件 :chinatech@promega.com.cn 1. 产品描述... 1 2. 产品组分和储存条件... 3 3. 从福尔马林固定 石蜡包埋的组织样品中提取 DNA... 3 A. 蛋白酶 K DTT 孵育缓冲液/ 蛋白酶 K 溶液和 1 洗涤缓冲液的配制... 4 B. 从福尔马林固定 石蜡包埋的组织中提取 DNA... 6 4. 疑难解答... 7 5. 相关产品... 8 1. 产品描述病理学家经常使用福尔马林固定 石蜡包埋的组织样品进行形态学的观察 PCR 扩增技术的出现, 使得人们可以将这些样品的基因分型与形态学联系起来 然而, 组织固定的过程会导致蛋白质与 DNA 之间和不同的 DNA 链之间发生交联 交联会造成 DNA 扩增效率的下降, 因此使用这种类型的样品, 通常会得到较差的扩增结果 MagneSil 固定组织基因组 DNA 纯化系统是专门为从蛋白酶 K 消化过夜的福尔马林固定样品中纯化 DNA 而设计的 利用从这一系统纯化得到的 DNA 曾经成功地扩增出长达 1.8kb 的片段 ( 图 1) 与其它纯化方法如酚- 氯仿抽提相比, 这一系统的优势在于它可以去除包括很小的 DNA 片段在内的大多数 PCR 扩增抑制剂 MagneSil 固定组织基因组 DNA 纯化系统适用于小量的组织样品, 例如薄切片样品 为了帮助去除抑制剂, 这一系统使用小量的可与 DNA 结合的顺磁性磁 第 1 页
珠, 故而该系统的 DNA 结合能力被限制在几百纳克的水平 正因为如此, 与其它纯化方法相比, 若使用这一系统对大体积组织样品的 DNA 进行纯化, 反而会导致 DNA 回收率低且质量较差 组织在福尔马林中储存时间过长会导致 DNA 过度的交联和 / 或降解, 因而不适合作为扩增的模板 图 1. 使用 MagneSil 固定组织基因组 DNA 纯化系统从福尔马林固定 石蜡包埋的 10μm 薄切片中纯化的 DNA 的分析结果 纯化的 DNA 进行 PCR 扩增, 扩增产物使用 ABI PRISM 310 或 3100 基因分析仪进行分析 A. 使用 16 对荧光标记的引物进行扩增 扩增产物的大小范围在 104 到 420 个碱基之间 B. 使用 amelogenin 引物对扩增一个 972 个碱基的片段 C. 从 APC 基因中扩增的一个 1.8kb 的片段 扩增时增加延伸时间有助于平衡大片段和小片段扩增产物的产量, 并增加大片段扩增产物的产量 取决于福尔马林固定造成的交联程度的不同, 结果会有差异 如需参考使用 MagneSil 固定组织基因组 DNA 纯化系统的文献, 请访问 : www.promega.com/citations/ 第 2 页
2. 产品组分和储存条件产品名称 包装规格 目录号 MagneSil 固定组织基因组 DNA 纯化系统 100 次 MD1490 每个试剂盒包含纯化 100 个样品的足量试剂 MagneSil 固定组织基因组 DNA 纯 化系统包括以下组件各一个 : MD1170:MagneSil 固定组织基因组 DNA 纯化系统样品处理组件 包括 : 孵育缓冲液 (Incubation Buffer) 蛋白酶 K(Proteinase K) 二硫苏糖醇 (DTT),1M 35ml 2 10mg 1.125ml MD1180:MagneSil 固定组织基因组 DNA 纯化系统纯化组件 包括 : 磁珠 (Resin) 裂解缓冲液 (Lysis Buffer) 2 洗涤缓冲液 (2 Wash Buffer) 洗脱缓冲液 (Elution Buffer) 0.9ml 40ml 30ml 15ml 注意 :MD1170 和 MD1180 为独立包装, 储存温度不同, 分开发货 储存条件 : 将蛋白酶 K 和 DTT 储存于 -20 将孵育缓冲液储存于-20 到 25 之间 其它试剂储存于室温 产品有效期见组件标签 3. 从福尔马林固定 石蜡包埋的组织样品中提取 DNA 需要用户自备的材料 : 95-100% 乙醇 异丙醇 56 加热器 水浴或热循环仪 65 加热器 水浴或热循环仪 涡旋混合器 1.5ml 离心管 ( 目录号 V1231) 带滤芯的吸头 MagneSphere Technology 磁力分离架 (12 孔位 )( 目录号 Z5342) 第 3 页
3.A. 蛋白酶 K DTT 孵育缓冲液 / 蛋白酶 K 溶液和 1 洗涤缓冲液的配制 蛋白酶 K 储液 1. 向每个装有蛋白酶 K 冻干粉的瓶中加入 550μl 不含 DTT 的孵育缓冲液, 轻柔晃动使之溶解 这样配制的蛋白酶 K 的终浓度为 18mg/ml 2. 将蛋白酶 K 分装成小份 反复冻融五次不会明显降低蛋白酶 K 的活性 每个样品需使用 10μl 1M DTT 1. 将 DTT 分装成小份并冻存于 -20 孵育缓冲液 / 蛋白酶 K 溶液注意 : 此溶液需要在每次进行 DNA 纯化前新鲜配制 1. 配制孵育缓冲液 / 蛋白酶 K 溶液需将孵育缓冲液 1M DTT 和蛋白酶 K 储液按照下表列出的比例混合 每个样品需配制 100μl 孵育缓冲液 / 蛋白酶 K 溶液 孵育缓冲液 1M DTT 18mg/ml 蛋白酶 K 终体积 800μl 100μl 100μl 1ml 2. 轻柔混匀, 置于冰上备用 1 洗涤缓冲液 1. 向 2 洗涤缓冲液中加入 15ml 95-100% 乙醇和 15ml 异丙醇 2. 盖好盖子, 颠倒数次混匀 3. 标记已添加乙醇和异丙醇的记号 将此瓶标注为 1 洗涤缓冲液 室温储存 将瓶盖盖紧以避免挥发 第 4 页
图 2. 从福尔马林固定 石蜡包埋的组织中提取 DNA 的流程示意图 详细操作方法见 3.B 第 5 页
3.B. 从福尔马林固定 石蜡包埋的组织中提取 DNA 强烈建议带手套操作并使用带滤芯的吸头以避免交叉污染 1. 将样品放入 1.5ml 离心管中 ( 如 1.5ml 微量离心管, 目录号 V1231) 2. 加入 100μl 新鲜配制的孵育缓冲液 / 蛋白酶 K 溶液 56 温浴过夜 薄组织切片无需进行脱石蜡处理 3. 取出离心管, 加入 2 倍体积的裂解缓冲液 注意 : 如果裂解缓冲液中有沉淀形成, 可将溶液置于 37-60 温育 4. 将装有磁珠的瓶子高速涡旋振荡 10 秒直至磁珠完全混匀 向蛋白酶 K 处理过的样品中加入 7μl 磁珠悬液 为了保持结果均一, 吸取磁珠时要保持其重悬的状态 5. 将样品 / 裂解缓冲液 / 磁珠混合物高速涡旋振荡 3 秒 在室温孵育 5 分钟 6. 高速涡旋振荡 2 秒后将离心管置于磁力架上 磁珠与液相将很快分离 注意 : 如果磁珠没有在离心管一侧形成明显的沉淀, 可将离心管涡旋振荡混匀并迅速放回到磁力架上 7. 小心地去除所有的溶液, 注意不要扰动离心管一侧的磁珠 8. 向装有磁珠的离心管中加入 100μl 裂解缓冲液 将离心管从磁力架上拿开并高速涡旋振荡 2 秒 9. 将离心管放回到磁力架上并去除所有的裂解缓冲液 10. 加入 100μl 预先配制好的 1 洗涤缓冲液 将离心管从磁力架上拿开并高速涡旋振荡 2 秒 11. 将离心管放回到磁力架上并小心地去除所有的洗涤缓冲液 12. 重复第 10 步和第 11 步两次, 共用 1 洗涤缓冲液洗 3 次 确保最后一次洗涤后所有的溶液都被去除 13. 打开离心管盖晾 5 分钟, 将置于磁力架上离心管中的磁珠晾干 晾干不要超过 20 分钟, 这可能会造成 DNA 难于被洗脱 14. 加入 25μl 洗脱缓冲液 15. 盖上盖子, 将离心管高速涡旋振荡 2 秒然后将其置于 65 温育 5 分钟 16. 将离心管从加热器中取出, 高速涡旋振荡 2 秒后迅速将其置于磁力架上 第 6 页
17. 小心的将含有 DNA 的溶液转移到适当的容器中 我们推荐使用聚丙烯容器以降低结合在容器壁上的 DNA 的量 注意 :DNA 溶液可以短期存放于 4, 或长期存放于 -20 或 -70 4. 疑难解答如果您的问题在此没有列出, 请与当地的 Promega 分公司或经销商联系 联系方式请参见 www.promega.com 电子邮件:techserv@promega.com 问题 扩增效果差 可能的原因和解释 样品过度交联或过度降解 纯化更多的样品 增加每个扩增循环的延伸时间 产率低 样品量过多 磁珠的结合能力为几百纳克 DNA 减少样品量或加入更多磁珠 2 洗涤缓冲液中未加入乙醇和异丙醇 确保在 2 洗涤缓冲液中加入这两种试剂, 并在瓶子的标签上标注清楚 吸取磁珠前未充分重悬 将装磁珠的瓶子高速涡旋振荡 10 秒或更长时间直至磁珠充分混匀 在吸取时保持磁珠处于重悬状态 蛋白酶 K 消化不充分 将大块的组织切成小块后再加入孵育缓冲液 / 蛋白酶 K 溶液 孵育缓冲液 / 蛋白酶 K 溶液必须为每次 DNA 纯化前新鲜配制 洗涤步骤后磁珠过度晾干 晾干磁珠的时间不要超过 20 分钟 在凝胶上无法看到扩增产物 无法形成磁珠 沉淀 可用的 DNA 量不足 可使用荧光标记的引物 涡旋振荡 / 混合后将离心管放置在磁力架上之 前磁珠发生沉降 重复涡旋振荡 / 混合步骤并迅 速将离心管放回到磁力架上 第 7 页
问题最终的洗脱溶液中含有磁珠 ( 混入 DNA 样品中的磁珠可能会影响下游检测的结果 ) 可能的原因和解释快速吸取可能会导致磁珠连同液体一起被转移 在洗脱过程中, 磁珠也可能会聚集在最终洗脱液的凹液面处 将洗脱后的溶液涡旋振荡 使之混匀, 放在磁力架上并小心的将洗脱液转 移到一个新管中 5. 相关产品产品名称 包装规格 目录号 MagneSphere Technology 磁力分离架 (2 孔位 ) 1.5ml Z5332 MagneSphere Technology 磁力分离架 (12 孔位 ) 1.5ml Z5342 ART 20P 吸头,20μl 960/ 包装 DY1071 ART 200 吸头,200μl 960/ 包装 DY1121 ART 1000E 吸头,1000μl 800/ 包装 DY1131 离心管,1.5ml 1000/ 包 V1231 如需 PCR 扩增相关产品的完整列表, 请访问 :www.promega.com 第 8 页