Microsoft PowerPoint - TMO-BID-XXM- Direct PCR FAQ [Read-Only]

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葱最柴
5 years ago
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1 直接 PCR FAQ 生命科学部 2011 年 2 月

2 FAQ 通用问题 Q 1: 直接 PCR 对扩增子的长度有限制吗? A 1: 扩增子长度越短,Direct PCR 越容易成功可以扩增的最长片段取决于样品类型样品所占体积以及样品所占体积以及 PCR 反应体系的大小例如, 我们可以 : 从血样中直接扩增 75kb 7.5 的片段, 从小鼠耳朵组织扩增 3.2kb, 从石蜡包埋组织中扩增 300bp 的片段具体请参照各试剂盒的说明和相关实验数据 2

3 FAQ 通用问题 Q 2: 什么时候需要用 DNARelease 添加剂? A2:DNARelease 添加剂是专门针对小鼠组织样品进行直接 PCR 而设计的重要成分在直接 PCR 方法中, 它添加到上样 buffer 中用以电泳, 从而防止 PCR 产物在胶孔处滞留如果用稀释样品法进行实验,DNARelease 可以添加到 TE 缓冲液中以辅助 DNA 从组织样本中释放, 具体请参照 Phire Animal Tissue Direct PCR Kit. 如果发现 DNA 样品与其他组织材料滞留在胶孔处, 添加 DNARelease 到上样 buffer 中可以有效解决这一问题 3

4 FAQ 通用问题 Q 3: Direct PCR 产物应如何保存? A 3: PCR 完成后, 建议先于 1000g 离心 1-3 分钟而后取上清进行下游的分析上清最好储存于 -20 C 4

5 FAQ 通用问题 Q 4: 可以单独买稀释 buffer 吗? A 4: 稀释 buffer 包含于 Phire Plant Direct PCR Kit 和 Phire Animal Tissue Direct PCR Kit 两个试剂盒内, 不可以单独购买 5

6 FAQ 全血直接 PCR 试剂盒 Q 1: 什么类型的血样适用于 Phusion 全血直接 PCR 试剂盒? A 1: 新鲜血或储存于 4 C 冷冻血样都可用以 Direct PCR 该试剂盒还与 EDTA, 柠檬酸盐, 肝素等抗凝血剂兼容储存于 Whatman 903 和 FTA 卡上的血样也可用该试剂盒进行 Direct PCR 该试剂盒适用于多种生物血样的 PCR, 具体可参照试剂盒说明 6

7 FAQ 全血直接 PCR 试剂盒 Q 2: 可以用 Phusion 全血直接 PCR 试剂盒进行等位基因特异性 PCR 检测吗 ( 例如 HLA 分型 )? A 2: 这取决于所用引物如果是 3 端出现错配并且没有进行修饰, 那么无法使用该试剂盒因为 Phusion Blood DNA 聚合酶具有很强的 3 5 外切酶活性, 它会将 3 端的错配碱基切除再进行扩增 7

8 FAQ 全血直接 PCR 试剂盒 Q 3: 用 Phusion 全血直接 PCR 试剂盒的 PCR 产物直接进行限制性酶切实验, 酶切效果不理想, 如何提高酶切效率? A 3: 有两种情况会导致酶切失败 : 一是所用的限制性酶在 Phusion Blood PCR buffer 中无法完全释放活性, 二是限制性酶可能对反应体系中存在的抑制剂比较敏感通常情况下, 用水对 PCR 产物进行 1:2 的稀释可以有效解决这一问题, 使限制性酶更好的工作如果 PCR 产物量很高, 则需要对 PCR 产物进行更大的稀释如果稀释法没有帮助的话, 建议对 PCR 产物进行纯化而后再酶切实验证明很多限制性酶可以在血样直接 PCR 产物中很好的工作具体可参照 application protocol for PCR-RFLP directly from blood. 8

9 FAQ 全血直接 PCR 试剂盒 Q 4: 如果添加 SYBR Green 染料, 可以用 Phusion 全血直接 PCR 试剂盒进行 QPCR 检测吗? A 4: 不可以 Phusion 全血直接 PCR 试剂盒是针对终端 PCR 而非 QPCR 检测存在于 PCR 反应体系中的血样会干扰荧光信号的检测并降低反应效率 9

10 FAQ 全血直接 PCR 试剂盒 Q 5: Phusion 全血直接 PCR 试剂盒有 IVD-CE 标志吗? A 5: 没有 10

11 FAQ 动物组织直接 PCR 试剂盒 Q 1: 除了耳朵和尾巴, 可以用小鼠的其他部位进行直接 PCR 吗? A1 1: 可以该试剂盒对小鼠的耳朵和尾巴组织实施了直接 PCR 检测, 并进行了优化然而, 小鼠的其他部位组织同样适用于该试剂盒, 只需注意在直接 PCR 中只要很少量的组织样品 Harris Uni-Core 打孔器可以方便的对样品进行制备 11

12 FAQ 动物组织直接 PCR 试剂盒 Q 2: 用小鼠组织进行直接 PCR 实验, 在电泳胶上没有看到 PCR 产物, 但胶孔处有大团的 DNA 滞留, 怎么办? A2 2: 从小鼠组织进行直接 PCR 时, 非常重要的一点是将 DNARelease 添加剂添加到上样 buffer 中, 而后进行电泳分析这是因为 PCR 产物中的细胞碎片会导致 DNA 片段滞留在胶孔内, 而 DNARelease 添加剂则可以很好的解决这一问题更多信息可参照试剂盒说明当然, 减少所用组织样品量也有利于解决该问题 12

13 FAQ 植物组织直接 PCR 试剂盒 Q 1: 哪些植物适用于 Phire 植物直接 PCR 试剂盒? A1: Phire 植物直接 PCR 试剂盒已对多种植物进行了检测, 具体请参照试剂盒说明 13

14 FAQ 植物组织直接 PCR 试剂盒 Q 2: Phire 植物直接 PCR 试剂盒适用于植物的哪些部分组织? A2 2: 该试剂盒已对植物的叶片, 种子和花进行了检测和优化, 其他部分如果实和根可能也适用, 只是需要针对所用植物进行检测 14

15 FAQ 植物组织直接 PCR 试剂盒 Q 3: 可以用冷冻的叶片进行直接 PCR 吗? A3 3: 推荐使用新鲜植物叶片, 但是冷冻和干枯的叶片也可以用于实验, 我们曾经用储存于 -20 达十年之久的橡树叶片成功进行了直接 PCR 15

16 FAQ 植物组织直接 PCR 试剂盒 Q 4: 稀释 buffer 中的 DNA 样品可以储存多久? A4 4: 储存时间取决于所用的植物材料通常情况下, 稀释 buffer 中的 DNA 样品可以于 -20 储存几个月然而, 用储存了 2 年之久的 DNA 样品进行实验, 也得到了很好的结果 16

17 FAQ 植物组织直接 PCR 试剂盒 Q 5: 可以用该试剂盒进行病毒 DNA 的检测吗? A5 5: 可以有些研究者已经用该试剂盒进行病毒检测值得注意的是, 在这些应用中灵敏性非常关键, 所以需要对样本量进行滴定检测 17

18 FAQ 植物组织直接 PCR 试剂盒 Q 6: 如果需要克隆或对 PCR 产物进行测序, 可以用 Phusion 酶来代替 Phire 吗? A6 6: 可以 Phire 和 Phusion 两个酶都有很强的抗干扰能力, 二者均可用于植物组织样品的 PCR 然而, 值得注意的是, 该试剂盒是针对 Phire 进行优化的, 如果用 Phusion 的话, 结果可能会稍微差一些些 18

19 FAQ 植物组织直接 PCR 试剂盒 Q 7: 可以购买不带有打孔器或打孔垫的试剂盒吗? A7 7: 不可以该试剂盒包括了试剂和工具, 在直接 PCR 中推荐使用打孔器和打孔垫进行取样, 以保证样本均一性 19

20 FAQ 石蜡包埋组织 Q 1: 哪些石蜡样品可用于直接 PCR? A1 1: 石蜡组织切片, 组织包埋和显微玻片均可作为样品进行直接 PCR 20

21 FAQ 石蜡包埋组织 Q 2: 多久的石蜡样品组织可用于 Direct PCR? A2 2: 直接 PCR 的成功与否取决于 DNA 的完整性, 越久的石蜡组织样品 DNA 的完整性越差时间较长的样本可以用于 PCR, 但产量会比较低, 同时扩增的 DNA 片段长度也会受限 21

22 FAQ 石蜡包埋组织 Q 3: 用蛋白酶 K 处理的石蜡包埋组织进行直接 PCR, 有时无法得到 PCR 产物或产量较低, 怎么办? A 3: 如果 PCR 条件没有问题 ( 阳性对照扩增结果很好 ), 那低产可能是由于样品量不合适通常是由于 DNA 量太大或样品中的抑制因素太多, 用 1x Phusion HF Reaction Buffer 进行 1:10 或 1:100 的稀释可以解决这一问题有时也可能是由于 DNA 样品量不够, 此时则需要通过梯度检测来确定最适的样品量当分析石蜡包埋样品组织时, 值得注意的是, 样品与样品间的 DNA 完整性很不一致, 在某些样品中 DNA 可能已经降解而无法进行 PCR 分析 22

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