中国癌症杂志 2013 年第 23 卷第 10 期 799 AI of (21.00±0.04)% in the chemotherapy group, higher than that in the saline group (8.58±0.01)%, the difference was sig

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绎橘京柯
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1 798 中国癌症杂志 2013 年第 23 卷第 10 期 CHINA ONCOLOGY 2013 Vol.23 No F-SFB-Annexin B1 探测化疗后肿瘤细胞凋亡的实验研究郑宇佳王明伟张建平徐俊彦杨忠毅程竞仪张勇平章英剑复旦大学附属肿瘤医院核医学科, 复旦大学上海医学院肿瘤学系, 上海 [ 摘要 ] 背景与目的 : 诱导细胞凋亡是肿瘤化疗的机制之一, 分子影像能在活体内无创动态地检测细胞凋亡, 有助于药物筛选和疗效分析本研究旨在探讨 N- 琥珀酰亚胺 -4- 氟苯甲酸酯偶联的氟 -18- 膜联蛋白 B1( 18 F-SFB-AnnexinB1) 显像剂早期评价化疗诱导细胞凋亡的可行性方法 : 以 SFB 作为中间体将 18 F 标记到 AnnexinB1 上了解 18 F-SFB-Annexin B1 在健康小鼠体内的生物分布特性建立 Walker-256 荷瘤小鼠模型, 随机分为两组, 化疗组腹腔注射环磷酰胺 (CTX 200 mg/kg,n=3), 对照组注射等体积无菌 0.9% 的氯化钠溶液 (n=3) 24 h 后静脉注射 18 F-SFB-Annexin B1, 分别于注射后 h 进行 PET/CT 显像比较肿瘤 / 肌肉放射性摄取率比值 (T/M) 与原位缺口末端标记 (TUNEL) 染色法测定凋亡指数 (AI) 的关系结果 : 18 F-SFB- Annexin B1 放化纯度 >95%, 生物分布显示肾脏放射性最高, 其次为肝脾和心肌, 显像剂在体内清除速率快化疗组与对照组各时间点 T/M 比值分别为 4.38± ± ± ±0.17 和 2.35± ± ± ±0.47, 差异有统计学意义 (F 分别为 ,P 均 <0.05) TUNEL 染色 AI 分别为 (21.00±0.04)% 和 (8.58±0.01)%, 差异有统计学意义 (F=21.539,P<0.05), 且 T/M 值与 AI 间有很好的相关性 (r=0.91,p<0.05) 结论: 18 F-SFB-AnnexinB1 能早期反映化疗诱导的细胞凋亡, 有望用于活体细胞凋亡分子显像和早期疗效判断 [ 关键词 ] 膜联蛋白 B1; 凋亡 ; 放射性核素显像 ; 化学疗法 ; 疗效评价 DOI: /j.issn 中图分类号 :R73-36 文献标志码 :A 文章编号 : (2013) Experimental study on tumor response to chemotherapy with 18F-SFB-Annexin B1 ZHENG Yu-jia, WANG Ming-wei, ZHANG Jian-ping, XU Jun-yan, YANG Zhong-yi, CHENG Jing-yi, ZHANG Yongping, ZHANG Ying-jian (Department of Nuclear Medicine, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai , China) Correspondence to: ZHANG Ying-jian yjzhang111@yahoo.com.cn [Abstract] Background and purpose: One of the main mechanism of chemotherapy is inducing tuomr apoptosis. Molecular imaging can allow noninvasively and dynamically monitor tumor apoptosis in vivo, and help to drug screening and therapeutic evaluation. The purpose of this study was to evaluate the feasibility of 18 F-SFB-Annexin B1 in detecting apoptosis at an early phase after chemotheraphy. Methods: Annexin B1 was labeled with 18 F using SFB as a chelating agent. Tissue distribution of 18 F-SFB-Annexin B1 was studied in healthy mice by the dissection method. W256 tumor-bearing rats were injected with 18 F-SFB-Annexin B1 intravenously at 24 h after the treatment of cyclophosphamide (CTX 200 mg/kg) or saline. Then imaging was acquired at 1, 2, 3, and 4 h postinjection on a PET/ CT, and the tumor-to-muscle ratio of SUV max (T/M) and the AI from TUNEL testing were compared. Results: 18 F-SFB- Annexin B1 had a radiochemical pruity (RCP)>95%. Biodistribution of this probe showed a predominant uptake in the kidney, then was liver, spleen, and myocardium, rapid clearance from blood and urinary was observed. The radios of T/M were 4.38±0.56, 6.75±1.16, 6.44±1.12, 4.81±0.17, respectively at 1, 2, 3, 4 h post injection of the chemotherapy group, much higher than that of the saline group (2.35±0.14, 2.99±0.55, 3.04±0.41, 2.33±0.47, respectively). The differences between the two groups were significant (F=23.790, , , , respectively, all P<0.05). TUNEL staining revealed that chemotherapy treatment significantly increased the percentage of apoptosis cells with an 通信作者 : 章英剑 yjzhang111@Yahoo.com.cn

2 中国癌症杂志 2013 年第 23 卷第 10 期 799 AI of (21.00±0.04)% in the chemotherapy group, higher than that in the saline group (8.58±0.01)%, the difference was significant (F=21.539, P<0.05). The radios of T/M were significantly correlated with the values of AI (r=0.91, P<0.05). Conclusion: 18 F-SFB-Annexin B1 can be used to apoptosis imaging and early therapeutic evaluation in vivo because it can reflect apoptosis at an early stage after chemotheraphy. [Key words] Annexin B1; Apoptosis; Radionuclide imaging; Chemotherapy; Response evaluation 位于细胞膜内层的磷脂酰丝氨酸 (PS) 翻转到细胞膜表面是凋亡发生的特征之一, 膜联蛋白 Ⅴ(AnnexinⅤ) 是膜联蛋白家族中的一员, 具有 Ca 2+ 依赖性 PS 结合活性, 可以反映凋亡, 在监测神经元退行性变心脑血管缺血 - 再灌注损伤移植器官排斥反应和评价肿瘤治疗疗效等方面具有良好应用前景 [1-7], 其中 99m Tc-AnnexinⅤ 已进入临床研究, 用于头颈部肿瘤淋巴瘤乳腺癌和肺癌等恶性肿瘤疗效评价 [8-10], 是目前应用最多的 SPECT 细胞凋亡显像探针 Annexin B1 是膜联蛋白家族新成员, 由我国科学家孙树汉教授等首次克隆成功 [11] 99m Tc-Annexin B1 在小鼠胸腺肝脏凋亡模型中均能良好地显示凋亡, 结果与原位缺口末端标记法 (TUNEL) 检测一致 [12-13] 本研究在 18 F 标记 Annexin B1 体外探测 anti-fas 抗体诱导 Jurkat 细胞凋亡和体内探测家兔肾脏缺血 - 再灌注损伤凋亡基础上 [14], 进一步探讨其评价肿瘤化疗后凋亡的可行性 1 材料和方法 1.1 实验动物雄性昆明小鼠 (n=12,20~25 g) 用于生物分布实验, 雄性 SD 大鼠 (n=6,180~200 g) 用于荷瘤模型制备所有实验动物均购于复旦大学实验动物科学部 1.2 仪器和试剂 Annexin B1 由上海第二军医大学医学遗传学教研室提供医用回旋加速器正电子药物合成仪和显像设备均为德国 Siemens 制造, 型号分别为 RDS Eclipse ST Explora GN 和 Biograph 16HR,γ 计数器为上海核所日环光电仪器有限公司 SN-695B 型,TUNEL 试剂盒环磷酰胺 (CTX) 分别购自德国 Merck 和 Baxter Oncology GmbH 公司 1.3 实验方法 F-Annexin B1 标记根据文献 [15-16] 的方法制备通过耦合剂 N- 琥珀酰亚胺 -4- 氟苯甲酸酯 (N-succinimidyl- 4-fluorobenzoate, SFB) 将 18 F 标记到 Annexin B1 上, 检测其标记率放射化学纯度和稳定性正常小鼠体内生物分布昆明小鼠随机分为 4 组, 每组 3 只尾静脉注射 0.74 MBq(0.4 ml)/ 只 18 F-SFB-Annexin B1, 分别于注射后 h 取各主要脏器称重放射性计数, 计算每克组织百分注射率 (%ID/g) 化疗诱导肿瘤凋亡抽取 Walker-256 癌肉瘤腹水种鼠淡黄色浑浊腹水, 经 0.9% 的氯化钠溶液 1 1 稀释后, 以 1 ml/ 只接种于小鼠右侧腋窝处皮下待肿瘤长至直径 1 cm 时, 随机分为化疗组和对照组, 每组各 3 只化疗组小鼠腹腔注射 CTX (200 mg/kg), 对照组小鼠注射等体积无菌 0.9% 的氯化钠溶液,24 h 后进行 18 F-SFB- Annexin B1 PET/CT 显像荷瘤大鼠凋亡显像荷瘤大鼠尾静脉注射 3.7 MBq(0.5 ml)/ 只 18 F-SFB-Annexin B1,10 min 后腹腔注射 1% 戊巴比妥钠 (30 mg/kg) 麻醉分别于注射显像剂后 h 进行 PET/CT 静态显像 1 个床位 / 只大鼠, 每个床位采集 10 min, 图像分析采用感兴趣区 (region of interest,roi) 技术, 取右侧腋窝肿瘤部位和同层面对侧上肢肌肉组织作为 ROI, 分别测量两者最大标准摄取值 (maximum standard uptake value,suv max ), 计算肿瘤与肌肉 SUV max 之比 ( 即 T/M) TUNEL 检测细胞凋亡显像结束后立即处死小鼠, 取肿瘤组织 4%

3 800 郑宇佳, 等. 18 F-SFB-Annexin B1 探测化疗后肿瘤细胞凋亡的实验研究甲醛溶液中固定,24 h 后石蜡包埋切片, 每片厚 4 μm 每个样品取 2 张相邻切片按试剂盒说明书进行 TUNEL 法检测, 以细胞核内有棕黄色颗粒者为凋亡阳性细胞每张切片随机选取 5 个视野 ( 200), 计数凋亡细胞数占细胞总数百分比作为凋亡指数 (apoptosis index,ai), 以 AI 反映各组肿瘤细胞凋亡情况统计学处理数据分析采用 SPSS 17.0 统计软件计量数据均用 x±s 表示, 组间比较采用 one-way ANO- VA, T/M 值与 AI 值作直线相关分析 P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 F-SFB-Annexin B1 的质量产物标记率 (27.8 ± 6.9)%(n=5), 放射化学纯度 (96.4 ± 1.3)%(n=5), 分别在小牛血清和 PBS 体系内室温放置 3 个半衰期 (6 h), 放射化学纯度仍 >90% 2.2 正常小鼠体内生物分布小鼠 18 F-SFB-Annexin B1 体内生物分布情况 ( 表 1) 肾脏放射性最高, 其次为肝脏脾脏及心肌,2 h 时上述脏器放射性摄取率均降至较低水平, 显像剂主要经泌尿系统排泄血液中放射性清除速率快,30 min 时即可降至 ( ± )%ID/g, 其余脏器各时间点放射性摄取率变化不明显 2.3 荷瘤大鼠活体显像 Walker-256 癌肉瘤腹水接种成瘤率 100% 两组荷瘤大鼠尾静脉注射 18 F-SFB-Annexin B h 后的 PET/CT 图像均见肿瘤显影, 内部坏死灶因无血液供应呈放射性分布缺损 ( 图 1) 化疗组 h 的 T/M 值分别为 4.38± ± ±1.12 和 4.81±0.17, 对照组为 2.35± ± ±0.41 和 2.33±0.47, 差异有统计学意义 (F 分别为 ,P 均 <0.05) 1 h 时肿瘤显影最明显, 但软组织本底亦较高, 肝脏脾脏肾脏和膀胱清晰显影,2~3 h 时软组织本底放射性逐渐清除,T/M 值升高, 且肝脏脾脏放射性摄取程度明显减低, 肾脏和膀胱全程均见显影图 1 荷 Walker-256 癌肉瘤大鼠 PET/CT 凋亡显像 Fig. 1 PET/CT apoptosis imaging of Walker-256 bearing rat The first line was treated with CTX and the second line was control group. From the left to the right demonstrate static images of 1, 2, 3, 4 h postinjection of 18 F-SFB-Annexin B1, respectively. Tumor concentrating 18 F-SFB-Annexin B1 in the CTX-treated group is apparently higher than the control group. 表 1 18 F-SFB-Annexin B1 在正常小鼠体内分布 Tab. 1 Biodis ion of 18 F-SFB-Annexin B1 in normal mice (x±s, n=3) Tissue %ID/g in different tissues 0.5 h 1 h 2 h 4 h Blood ± ± ± ± Heart ± ± ± ± Liver ± ± ± ± Pancreas ± ± ± ± Spleen ± ± ± ± Kidney ± ± ± ± Bone ± ± ± ± Muscle ± ± ± ± Stomach ± ± ± ± Gastrointestinal ± ± ± ± Brain ± ± ± ±

4 中国癌症杂志 2013 年第 23 卷第 10 期 TUNEL 检测细胞凋亡 TUNEL 染色观察到化疗组小鼠有大片黄染颗粒, 表明存在大量凋亡细胞, 对照组肿瘤亦有较多黄染颗粒, 提示存在一定程度的自身凋亡 ( 图 2) 但化疗组 AI 为 (21.00±0.04)%, 对照组为 (8.58±0.01)%, 差异有统计学意义 (F=21.539,P<0.05) 表明经 CTX 处理 24 h 后, 肿瘤细胞凋亡数量明显增加 T/M 比值与 AI 间有很好的正相关性 (r=0.91,p<0.05) 图 2 肿瘤凋亡 TUNEL 检测 Fig. 2 TUNEL detecting ( 200) A: CTX-treated group; B: Control group; Brown particles as black arrows showed are apoptosis bodies or cells. 3 讨论 PS 外翻发生在凋亡形态学改变之前, 为早期检测细胞凋亡提供了有效靶点传统检测细胞凋亡的方法大都属于有创检查, 且不能连续动态监测凋亡在活体内发生发展和转归过程, 难以直观评估疗效, 临床实际应用价值有限因此, 应用现代影像示踪等技术进行活体监测凋亡已经成为生命科学领域的热点问题 [17-21], 其中使用放射性核素标记膜联蛋白的应用报道最多国内外学者已经在 99m Tc-AnnexinⅤ 监测细胞凋亡方面做了大量研究, 取得很好的结果, 并应用于多个临床试验中但 SPECT 空间分辨率较低产物体内生物分布不理想是其未在临床广泛应用的重要原因 PET/CT 是目前医学影像领域先进的分子功能显像技术, 应用正电子核素 ( 如 18 F) 标记 AnnexinⅤ 所获得的产物进行 PET 显像可以明显提高影像质量 Murakami [21] 等比较 18 F-SFB-AnnexinⅤ 和 99m Tc-HYNIC- AnnexinⅤ 在正常大鼠和心肌缺血模型大鼠体内生物分布发现, 凋亡心肌摄取两种显像剂均是正常心肌的 3 倍, 但前者在肝脾和肾的分布明显低于后者本研究中使用 [ 18 F]SFB 作为标记中间体, 成功制备 18 F-SFB-Annexin B1, 产物具有良好的体外稳定性和放化纯度, 生物分布结果显示, 18 F-SFB-AnnexinB1 在小鼠肾脏分布最高, 其次为肝脾和心肌, 但均低于 99m Tc-Annexin B1 [12] 因此, 本研究的 18 F-SFB- Annexin B1 可能较 99m Tc- AnnexinⅤ 和 99m Tc- AnnexinB1 更适合应用于临床凋亡显像, 尤其是对腹部凋亡病灶检测更具优势此外, 本研究靶 / 本底比值是 99m Tc-HYNIC-annexinⅤ 检测荷瘤鼠单次化疗 24h 后靶 / 本底比值的 2~3 倍 [22] (4.4~6.4 vs 2.1~2.5), 提示 18 F-SFB-Annexin B1 的图像质量较好, 凋亡诱导模型也较为理想放疗化疗早期即可诱导肿瘤细胞凋亡, 早期无创动态地观察治疗后凋亡发生情况, 对肿瘤治疗疗效监测临床个体化治疗方案制定和调整预后判断和新药研发等都有十分重要的意义考虑到化疗可操作性强, 本研究采用单次大剂量腹腔给予 CTX 作为诱导凋亡的方法, 结果提示凋亡诱导较为理想, 与对照组自身的凋亡现象存在差异细胞凋亡发生后会出现 2 个 PS 高峰, 分别在 1~5 h 和 9~24 h, 仅后者与凋亡有关 [7] 因此, 选择在 CTX 处理 24 h 后进行 PET/CT 显像, 结果化疗组肿瘤摄取显像剂程度和 TUNEL 检测阳性率均高于对照组的 2 倍, 且两者具有良好的正相关注射显像剂 1 h 后肿瘤显影最明显, 轮廓清晰 ( 图 1), 但该时间点肝脾肾和膀胱放射性均较高, 不利于对腹盆腔病灶的评估对于腹盆腔以外病灶, 该时间点 T/M 值较高, 可作为局部疗效评价较为适宜的显像时间随着药物在体内代谢, 放射性在各主要脏器逐渐清除, 2 h 时可见肝脾放射性分布明显减低, 因此该时间点可以作为腹腔病灶或全身疗效评价的适宜显像时间本研究进行了 1~4 h 显像, 可见膀胱在显像全程均显影, 这可能会影响对盆腔病灶疗效判断的准确性对此, 临床可以尝试使用利尿药物导尿或者大量饮水等方法加速膀胱内放射性尿液的排泄来配合凋亡显像, 从而

5 802 郑宇佳, 等. 18 F-SFB-Annexin B1 探测化疗后肿瘤细胞凋亡的实验研究提高检出率有效的放化疗在诱导肿瘤细胞凋亡的同时, 还可诱发一定量的肿瘤细胞坏死, 后者细胞膜的通透性明显增高, 继而发生裂解, 暴露于细胞基质中的 PS 亦可以与膜联蛋白结合, 从 [7] 而干扰凋亡显像效果 Van De Wiele 等对 20 例头颈部鳞癌患者进行 99m Tc-HYNIC-rh-annexinⅤ 凋亡显像结果证实, 只有在缺乏坏死的情况下, 肿瘤组织对显像剂的摄取才与 TUNEL 检测阳性率正相关自噬是一种 Ⅱ 型程序性细胞死亡, 是一个细胞通过溶酶体降解作用清除衰老受损或多余的线粒体或其他细胞器的过程 [23], 以出现双层膜结构包裹部分胞质和细胞器的自噬体为特征某些情况下, 诱导自噬可以抑制肿瘤生长, 并致自噬相关性细胞死亡, 但大多数情况下, 肿瘤细胞可利用自噬应对缺氧营养匮乏, 能清除氧自由基损伤的线粒体, 从而保护肿瘤细胞因此, 在凋亡显像研究中还要注意识别细胞坏死和自噬现象本研究是在小动物 PET/CT 引进之前的结果, 随着本科室小动物显像设备的应用, 18 F- SFB- Annexin B1 在凋亡检测中的价值会得到更好的体现另外, 大分子蛋白在体内的生物分布劣于小分子化合物, 我们今后的研究将致力于标记 Annexin B1 蛋白功能片段综上所述, 18 F-SFB- Annexin B1 能够反映化疗诱导下的肿瘤细胞凋亡, 有望成为临床 PET/ CT 监测细胞凋亡的分子影像探针 [ 参考文献 ] [1] KIM Y E, CHEN J, LANGEN R, et al. Monitoring apoptosis and neuronal degeneration by real-time detection of phosphatidylserine externalization using a polarity-sensitive indicator of viability and apoptosis [J]. Nat Protoc, 2010, 5: [2] KENIS H, ZANDBERQEN H R, HOFSTRA L, et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging [J]. J Nucl Med, 2010, 51: [3] YE F, FANG W, WANG F, et al. Evaluation of adenosine preconditioning with 99mTc-His10-annexinⅤ in a porcine model of myocardium ischemia and reperfusion injury: preliminary study [J]. Nucl Med Biol 2011, 38: [4] BLANKENBERG F G, ROBBINS R C, STOOT J H, et al. Radionuclide imaging of acute lung transplant rejection with annexinⅤ[j]. Chest, 2000, 117: [5] VANGESTEL C, VAN DE WIELE C, MEES G, et al. Singlephoton emission computed tomographic imaging of the early time course of therapy-induced cell death using technetium 99m tricarbonyl His-annexin A5 in a colorectal cancer xenograft model [J]. Mol Imaging, 2012, 11: [6] ERBA PA, MANFREDI C, LAZZERI E, et al. Time course of Paclitaxel-induced apoptosis in an experimental model of virus-induced breast cancer [J]. J Nucl Med, 2010, 51: [7] VAN DE WIELE C, LAHORTE C, VERMEERSCH H, et al. Quantitative tumor apoptosis imaging using Technetium- 99m-HYNIC AnnexinV single photon emission computed tomography [J]. J Clin Oncol, 2003, 21: [8] HAAS R L, DE JONG D, VALDES OLMOS R A, et al. In vivo imaging of radiation-induced apoptosis in follicular lymphoma patients [J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2004, 59: [9] KURIHARA H, YANG D J, CRISTOFANILLI M, et al. Imaging and dosimetry of 99mTc EC annexinⅤ in breast tumors [J]. Appl Radiat Isot, 2008,66: [10] BELHOCINE T, STEINMETZ N, HUSTINX R, et al. Increased uptake of the apoptosis-imaging agent (99m)Tc recombinant chemotherapy as a predictor of tumor response and patient prognosis [J]. Clin Cancer Res, 2002,8: [11] ZHANG Y, GUO Y J, SUN S H, et al. Non-fusion expression in Escherichia coli, purification, and characterization of a novel Ca2+- and phospholipid-binding protein annexin B1 [J]. Protein Exp Purif, 2004, 34: [12] LUO Q Y, WANG F, ZHANG Z Y, et al. Preparation and bioevaluation of (99m)Tc-HYNIC-annexin B1 as a novel radioligand for apoptosis imaging [J]. Apoptosis, 2008,13: [13] LUO Q Y, ZHANG Z Y, WANG F, et al. Preparation, in vitro and in vivo evaluation of (99m)Tc-Annexin B1: a novel radioligand for apoptosis imaging [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 335: [14] 赵庆, 章英剑, 王芳, 等. 18 F-SFB-Annexin B1 探测细胞凋亡实验研究 [J]. 中华核医学杂志, 2011, 31: [15] MARIK J, SUTCLIFFE J L. Fully automated preparation of n, c, a, -4-[18F]fluorobenzoic acid and N-succinimidyl-4- [18F] fluorobenzoate using a Siemens/CTI chemistry process control unit (CPCU) [J]. Appl Radiat Isotopes, 2007, 65: [16] WANG M W, ZHANG Y P, ZHANG Y J. Module-assisted one-pot synthesis of [18F]SFB for radiolabeling proteins [J]. J Radioanal Nucl Chem, 2011, 289: [17] LIIMATAINEN T, HAKUMAKI J M, KAUPPINEN R A, et al. Monitoring of gliomas in vivo by diffusion MRI and 1H MRS

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864 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 6 期 2016 年 6 月 of apoptosis related factors, decrease the incidence of adverse reactions, which is of great 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 6 期 2016 年 6 月 863 曲妥珠单抗联合多西紫杉醇治疗 Her-2 阳性乳腺癌的临床研究 * 周永安, 刘训碧黄石市中心医院 ( 普爱院区 ) 乳腺肿瘤外科, 湖北黄石 435000 摘要 : 目的探析注射用曲