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1 发 酵 乳 杆 菌 菌 株 的 多 相 分 类 鉴 定 杨 振 宇, 高 学 军, 王 庭 柱 东 北 农 业 大 学 教 育 部 乳 品 科 学 重 点 实 验 室 (150030) 摘 要 : 对 9 株 发 酵 乳 杆 菌 菌 株 (2 株 德 氏 乳 杆 菌 保 加 利 亚 亚 种 1 株 德 氏 乳 杆 菌 德 氏 亚 种 3 株 嗜 酸 乳 杆 菌 1 株 发 酵 乳 杆 菌 1 株 干 酪 乳 杆 菌 1 株 布 氏 乳 杆 菌 ) 进 行 MRS 固 体 平 板 培 养 基 划 线 分 离 和 形 态 学 比 较 观 察, 并 采 用 生 化 试 验 和 特 异 性 PCR 以 及 RAPD 对 其 进 行 鉴 定 通 过 菌 体 常 规 磷 钨 酸 负 染 色 标 本 的 透 射 电 镜 观 察, 描 述 了 各 菌 体 的 大 小 形 状 以 及 裂 殖 方 式 ; 依 据 各 菌 种 生 化 代 谢 差 异 及 其 代 谢 酶 编 码 基 因 序 列 差 异 分 别 设 计 生 化 试 验 和 菌 种 特 异 性 PCR 引 物, 生 化 试 验 得 到 了 6 个 发 酵 型, 将 其 鉴 定 为 6 个 菌 群, 而 特 异 性 PCR 扩 增 在 菌 株 水 平 上 将 其 鉴 定 为 9 株 菌 (2 株 德 氏 乳 杆 菌 保 加 利 亚 亚 种 1 株 德 氏 乳 杆 菌 德 氏 亚 种 3 株 嗜 酸 乳 杆 菌 1 株 发 酵 乳 杆 菌 1 株 干 酪 乳 杆 菌 1 株 布 氏 乳 杆 菌 ), 这 得 到 了 RAPD 鉴 定 结 果 (20 个 随 机 引 物 的 RAPD 筛 选 也 得 到 了 9 个 不 同 的 基 因 型 ) 的 验 证 实 验 还 获 得 了 5 个 种 特 异 性 PCR 引 物 德 氏 乳 杆 菌 保 加 利 亚 亚 种 的 LbdbmanLF-R 干 酪 乳 杆 菌 的 LbcmanNF-R 嗜 酸 乳 杆 菌 的 LbarbsK1F-R 发 酵 乳 杆 菌 的 LbpmelAF-R 德 氏 乳 杆 菌 德 氏 亚 种 的 LbddlacZF-R. 以 及 可 能 是 嗜 酸 乳 杆 菌 菌 株 AS 的 株 特 异 性 的 PCR 引 物 LbamanNF-R 关 键 词 : 德 氏 乳 杆 菌 保 加 利 亚 亚 种, 德 氏 乳 杆 菌 德 氏 亚 种, 嗜 酸 乳 杆 菌, 发 酵 乳 杆 菌, 干 酪 乳 杆 菌, 电 镜, 生 化 鉴 定,PCR 1. 引 言 乳 杆 菌 (Lactobacillus), 在 全 世 界 的 工 业 应 用 中 占 有 重 要 的 作 用, 可 作 为 发 酵 乳 的 发 酵 剂 有 一 些 乳 杆 菌 株 是 益 生 菌, 常 用 于 新 鲜 的 发 酵 产 品 或 囊 形 保 健 品 ( 如 冻 干 粉 ) 中, 在 人 和 动 物 胃 肠 道 以 及 许 多 食 品 饲 料 和 饮 料 的 制 作 过 程 中 起 主 要 作 用 [1,2] 德 氏 乳 杆 菌 (Lact. delbrueckii), 依 据 生 态 学 生 境 和 发 酵 性 能 的 差 异, 依 据 生 态 学 生 境 和 发 酵 性 能 的 差 异, 可 将 其 分 为 三 个 亚 种 : 常 用 于 蔬 菜 发 酵 的 德 氏 亚 种 (Lact. d. delbrueckii) 以 及 目 前 用 于 乳 品 的 保 加 利 亚 亚 种 (Lact. d. bulgaricus) 和 乳 酸 亚 种 (Lact. d. lactis), 后 两 者 与 其 它 微 生 物, 如 嗜 热 链 球 菌 (Streptococcus thermophilus) 和 嗜 酸 乳 杆 菌 [3,4] (Lact. acidophilus) 一 起 广 泛 地 应 用 于 Yogurt 发 酵 乳 以 及 乳 酪 的 制 造 工 业 中 干 酪 乳 杆 菌 ('Lactobacillus. casei') 群 含 有 许 多 重 要 的 益 生 菌 株, 如 Lact. casei Shirota 和 Lact. [5,6] rhamnosus GG, 它 们 可 见 于 初 乳 中, 特 别 是 在 成 熟 乳 酪 中 大 量 存 在 布 氏 乳 杆 菌 (Lact. buchneri) 是 在 酒 发 酵 过 程 中 的 害 菌 或 酸 败 菌, 此 外,Lact. buchneri 在 酵 母 发 酵 淀 粉 乳 酪 橄 榄 发 酵 和 青 贮 饲 料 中 也 常 见 近 年 来, 越 来 越 多 的 证 据 表 明, 食 品 工 业 和 胃 肠 微 生 物 学 者 需 要 灵 敏 可 靠 的 方 法, 来 确 定 和 分 析 食 品 中 及 宿 主 胃 肠 道 中 微 生 物 的 含 量, 尤 其 是 对 LAB( 特 别 是 乳 杆 菌 和 双 歧 杆 菌 ) 的 关 注, 这 主 要 是 因 为 :(i) 这 些 微 生 物 有 益 于 健 康 ;

2 (ii) 它 们 可 包 埋 于 许 多 食 品 中 作 为 益 生 菌 ; 以 及 (iii) 满 足 立 法 工 业 体 和 消 费 者 的 关 于 安 全 性 及 完 整 标 示 的 需 要 传 统 的 鉴 定 方 法 主 要 依 赖 于 表 型 分 析, 其 中 有 些 技 术 已 被 证 明 适 用 于 某 些 乳 酸 菌 的 鉴 定, 但 表 型 分 析 存 在 一 些 缺 点, 例 如 重 现 率 低 某 些 技 术 的 不 定 性 ( 主 要 是 由 细 菌 生 长 的 可 塑 性 引 起 的 ) 低 辨 识 能 力 以 及 相 似 的 表 型 特 性 并 不 等 同 于 相 似 的 或 者 关 系 密 切 的 基 因 型 [6] 近 年 来, 为 了 克 服 传 统 表 型 分 类 学 方 法 的 缺 陷, 已 经 建 立 了 一 系 列 的 干 酪 乳 杆 菌 和 发 酵 乳 杆 菌 分 子 鉴 定 方 法, 包 括 遗 传 探 针 技 术 和 遗 传 指 纹 技 术,PCR 技 术 的 创 立 打 开 了 乳 酸 菌 快 速 [7,8] [9] 鉴 定 的 大 门, 干 酪 乳 杆 菌 菌 种 特 异 性 引 物 和 发 酵 乳 杆 菌 菌 种 特 异 性 引 物 已 经 建 立, RAPD 技 术 已 经 广 泛 地 用 于 菌 株 水 平 的 鉴 别 [10~12], 此 外, 还 建 立 了 许 多 PCR 衍 生 的 鉴 定 技 术 ( 如 S-PCR rep-pcr AP-PCR LCR 和 小 卫 星 序 列 多 态 性 ) 以 及 基 于 16S rrna 基 因 和 16S~23S rrna 基 因 间 隔 区 的 PCR 及 其 RFLP, 即 ARDRA 技 术 [1,7,10,13] 本 试 验 即 是 进 行 表 型 特 性 及 其 分 子 水 平 的 研 究, 包 括 形 态 学 观 察 生 化 试 验 RAPD 和 特 异 性 PCR 通 过 透 射 电 镜 观 察 各 菌 体, 依 据 各 菌 种 之 间 生 化 代 谢 的 差 异, 设 计 生 化 试 验, 并 比 对 其 代 谢 酶 编 码 基 因 的 序 列, 尽 可 能 设 计 菌 种 水 平 的 较 短 的 PCR 引 物, 力 求 做 出 这 些 菌 种 不 同 菌 株 的 PCR 鉴 定, 另 外 也 筛 选 了 20 个 随 机 引 物, 进 行 菌 株 RAPD 分 析, 并 同 生 化 鉴 定 及 特 异 性 PCR 结 果 进 行 验 证, 为 乳 酸 菌 相 关 科 学 研 究 和 工 业 化 生 产 提 供 理 论 和 技 术 基 础 2. 材 料 和 方 法 2.1 菌 株 及 其 培 养 条 件 试 验 所 用 株 有 德 氏 乳 杆 菌 保 加 利 亚 亚 种 株 AS AS , 德 氏 乳 杆 菌 德 氏 亚 种 株 AS (ATCC 9649), 嗜 酸 乳 杆 菌 株 AS AS (ATCC 4395) AS , 发 酵 乳 杆 菌 株 AS (ATCC 14931), 干 酪 乳 杆 菌 株 AS 1.29 以 及 布 氏 乳 杆 菌 AS 1.13 ( 对 照 ) 所 用 菌 株 是 由 东 北 农 业 大 学 食 品 学 院 于 国 萍 和 孟 祥 晨 教 授 惠 赠 菌 株 的 纯 培 养 通 过 在 无 抑 制 作 用 的 MRS 平 板 培 养 基 上 反 复 划 线 获 得 ; 增 殖 培 养 在 液 体 MRS 培 养 基 中 过 夜 生 长 进 行 2.2 菌 株 的 电 镜 观 察 菌 株 增 殖 培 养 后, 进 行 常 规 磷 钨 酸 负 染 色 透 射 电 镜 标 本 的 制 作 [14], 置 JEM-1200EX 型 电 镜 下 观 察 并 照 相 2.3 生 化 实 验 据 文 献 [15~17], 选 取 苦 杏 仁 苷 阿 拉 伯 糖 山 梨 醇 乳 糖 核 糖 蔗 糖 和 甘 露 糖 代 谢 为 切 入 点, 设 计 生 化 试 验 [17], 各 反 应 体 系 均 为 3 ml; 而 苦 杏 仁 苷 和 阿 拉 伯 糖 发 酵 试 验 采 用 细 菌 微 量 生 化 鉴 定 管 ( 购 自 北 京 陆 桥 技 术 有 限 责 任 公 司 ) 各 菌 株 生 化 试 验 均 各 做 10 个 平 行 - 2 -

3 2.4 模 板 DNA 的 制 备 采 用 CTAB 法 制 备 菌 株 DNA 样 品 [18], 紫 外 (DU640 型 分 光 光 度 计,BECKMAN) 测 定 OD 260 和 OD 280 选 取 纯 度 介 于 1.8 和 2.0 之 间 的 样 品, 稀 释 至 浓 度 48 ng/µl 作 为 模 板 备 用 2.5 RAPD 随 机 引 物 : 选 取 20 种 RAPD 随 机 引 物 [18], 引 物 合 成 于 上 海 英 骏 生 物 技 术 有 限 公 司 随 机 引 物 的 PCR 筛 选 : 扩 增 反 应 的 体 积 为 25µl, 其 中 含 Taq DNA 聚 合 酶 1.25 U,10 PCR reaction buffer 2.5µl, 模 板 DNA 1µl,dNTP 浓 度 为 200 µmol/l,mgcl 2 浓 度 为 1.5 mmol/l, 随 机 引 物 浓 度 为 800 µmol/l, 补 充 去 离 子 水 至 25 µl 扩 增 反 应 执 行 于 96 孔 梯 度 PCR 仪 (Biometra) 中, 程 序 为 [20] 改 进 靳 淼 等 的 方 法, 即 复 性 温 度 为 34 取 10 µl 扩 增 产 物 进 行 电 泳, 电 压 为 100V, 琼 脂 糖 凝 胶 为 1%( 含 EB 0.5µg/l), 用 GDS-8000 凝 胶 成 像 系 统 (UVP) 观 察 电 泳 结 果, 筛 选 出 合 适 的 引 物 后, 以 提 取 的 各 菌 株 DNA 为 模 板, 分 别 进 行 PCR 扩 增 和 凝 胶 电 泳, 并 拍 照 PCR 相 关 试 剂 均 购 自 天 根 生 化 科 技 ( 北 京 ) 有 限 公 司 2.6 特 异 性 PCR 引 物 设 计 : 选 取 甘 露 糖 乳 糖 核 糖 代 谢 为 切 入 点, 查 找 其 代 谢 关 键 酶 ( 编 码 基 因 ) [20], 分 别 为 甘 露 糖 磷 酸 转 移 酶 IIAB(manL) 甘 露 糖 磷 酸 转 移 酶 IID (mann) β- 半 乳 糖 苷 酶 (lacz) α- 半 乳 糖 苷 酶 (mela) 核 糖 激 酶 (rbsk), 应 用 DNAman 软 件 比 对 相 应 核 苷 酸 序 列,Oligo6.0 设 计 菌 种 特 异 性 PCR 引 物, 详 见 表 1, 合 成 于 上 海 英 骏 生 物 技 术 有 限 公 司 表 1 所 设 计 引 物 的 信 息 引 物 名 称 序 列 (5 ~3 ) 靶 基 因 扩 增 子 大 小 退 火 温 度 LbdbmanLF TGGGCGACGGTCACATTAAGAT manl 263(bp) 57.1 LbdbmanLR AAACAACAAGAAGGCGTGCGTAG LbcmanNF GCTGGGAGCAAGATTACCGAAGA mann 417(bp) 56.9 LbcmanNR CATCAAGCCGACAACGTGGAAGACA LbamanNF ATGGCGTTGA mann 685(bp) 41.6 LbamanNR ACGGGTAACCT LbarbsK1F AGTGAAGGCGGCTATATTACTC rbsk 685(bp) 51.1 LbarbsK1R ATGGTTGGGCACCTAAAC LbbdrbsK2F AGGCGGCTATA rbsk 287(bp) 44.7 LbdbrbsK2R TGGGCACCTAA LbpmelAF ACCAACTCTACGAACGCCTAA mela 416(bp) 58.1 LbpmelAR CGGTGTCTGGACTGTCAATC LbddlacZF CAATGAATACTACCCGAACCA lacz 480(bp) 54.2 LbddlacZR TTAGCGGAAGCAACGAAT 特 异 性 PCR 扩 增 :PCR 反 应 体 系 为 25 µl, 其 中 含 TaqDNA 聚 合 酶 2.5 U,10 PCR reaction buffer 2.5 µl, 模 板 DNA 1 µl,dntp 浓 度 为 200 µmol/l,mgcl 2 浓 度 为 1.5 mmol/l, 每 对 引 物 浓 度 为 400 µmol/l, 补 充 去 离 子 水 至 25 µl 扩 增 程 序 如 下 :94 预 变 性 3 min,94 变 性 30 s, 退 火 温 度 复 性 30 min,72 延 伸 30 min, 进 行 30 个 循 环 后 72 延 伸 7 min 取 9 µl - 3 -

4 扩增产物进行电泳 电压为 100 Ｖ 琼脂糖凝胶为 1% 含 EB 0.5 µg/l 用凝胶成像系统 观察电泳结果并拍照 3. 结果 3.1 菌株的分离纯化 菌株经过反复平板划线基本得到纯化 无论是从菌落形态还是镜检观察均为均一的形 态 共得到 9 株乳酸菌 即 AS AS AS AS AS AS AS AS 1.29 AS 菌株的菌落特征描述 菌株的菌落特征描述 9 株菌菌落均粗糙 无色素 其中 AS AS AS AS AS AS AS 1.29 菌落为白色到浅灰色 直径 1-3mm AS 1.29 倾倒平板培养 基的深层菌落光滑 透镜成菱形 AS AS AS 菌落在显微镜下 一 般显示缠绕或微毛状物 从似暗影的菌堆中心放射伸出 深层菌落呈放射或分枝形的不规则 AS AS 1.13 菌落为近乎透明 菌落通常扁平 圆形或不规则 菌株的光镜观察 菌株的光镜观察 9 株菌均为 G 性菌 菌体细胞为杆状 大多数单个或成对或者短链 但 AS 1.29 大多数 成链 少见成对 大多两端呈圆形 而 AS 1.29 菌体细胞两端呈方形 菌株的电镜观察 菌株的电镜观察 11 株菌中 在裂殖方式上均为二等分裂殖 其中 AS AS 为长杆状 其 它菌体细胞呈短杆状 AS 1.29 两端呈方形 电镜照片 40K 见图 1 AS AS AS AS 1.13 AS AS AS AS AS 1.29 图 1 菌株的电镜照片 40K 3.2 生化实验 9 株菌的生化鉴定 苦杏仁苷的发酵实验 AS AS AS AS 1.29 为阳性 甘露醇 AS 1.29 为阳性 阿拉伯糖 AS AS 1.13 为阳性 半乳糖 AS

5 AS AS AS AS AS 为 阳 性 ; 核 糖 AS 1.29 AS 1.13 AS 为 阳 性 ; 甘 露 糖 AS AS AS AS AS AS 1.29 为 阳 性 判 定 的 结 果 是, 尽 管 AS 在 阿 拉 伯 糖 发 酵 结 果 不 符 外, 其 余 都 与 各 自 菌 种 在 文 献 中 所 描 述 的 相 对 应 3.3 菌 株 的 RAPD 分 型 筛 选 20 个 随 机 引 物, 发 现 引 物 BA63(GGGGGTCTTT) 可 得 到 最 好 的 多 态 性, 并 可 对 各 菌 株 做 出 最 大 限 度 的 鉴 别, 见 图 2, 所 以 引 物 BA63 的 RAPD 将 这 些 菌 株 鉴 别 为 9 株 图 2 随 机 引 物 BA63 的 RAPD 图 谱 泳 道 M 为 DNA MarkerⅤ, 泳 道 1~9 分 别 为 AS AS AS AS AS AS AS 1.29 AS AS 特 异 性 PCR 鉴 定 基 于 rbsk 的 特 异 性 PCR 鉴 定 : 基 于 rbsk 设 计 了 2 个 引 物, 分 别 是 LbarbsK1F-R 和 LbbdrbsK2F-R, 前 者 是 嗜 酸 乳 杆 菌 种 特 异 性 的, PCR 扩 增 只 有 菌 株 AS AS AS 获 得 了 685bp 的 特 异 性 的 唯 一 条 带, 其 余 菌 株 均 无 带, 见 图 3; 后 者 是 德 氏 乳 杆 菌 保 加 利 亚 亚 种 菌 株 特 异 性 的, 只 有 AS AS 有 287bp 的 特 异 性 条 带, 且 AS AS 均 有 一 条 >100bp 的 非 特 异 性 条 带,AS 有 三 条 带, 多 出 的 一 条 是 >300bp 大 小 的 片 段, 见 图 4 图 3 引 物 对 LbarbsK1F-R 的 特 异 性 PCR 图 谱 泳 道 M( 左 ) 为 DNA Marker II,M( 右 ) 为 DNA MarkerⅠ, 泳 道 1~9 同 图 2, 泳 道 10 为 空 白 对 照 图 4 引 物 对 LclrbsKF-R 的 特 异 性 PCR 图 谱 泳 道 M 为 100 bp DNA Ladder, 泳 道 1~10 同 图 基 于 lacz 的 德 氏 乳 杆 菌 德 氏 亚 种 特 异 性 PCR 鉴 定 : 基 于 lacz 设 计 了 的 引 物 LbddlacZF-R, 只 有 AS 获 得 了 480bp 的 特 异 性 的 唯 一 条 带, 其 余 菌 株 均 无 带, 见 图 5-5 -

6 图 5 引 物 对 LbddlacZF-R 的 特 异 性 PCR 图 谱 泳 道 M 为 为 DNA Marker II, 泳 道 1~10 同 图 基 于 manl 的 德 氏 乳 杆 菌 保 加 利 亚 亚 种 特 异 性 PCR 鉴 定 : 基 于 manl 设 计 的 引 物 LbdbmanLF-R, 只 有 菌 株 AS AS 获 得 了 263bp 的 特 异 性 的 唯 一 条 带, 其 余 菌 株 均 无 带, 见 图 6 图 6 引 物 对 LbdbmanLF-R 的 特 异 性 PCR 图 谱 泳 道 M 为 为 DNA Marker II, 泳 道 1~10 同 图 基 于 mann 的 特 异 性 PCR 鉴 定 : 基 于 mann 设 计 了 2 个 引 物 对, 分 别 是 LbcmanNF-R 和 LbamanNF-R, 前 者 是 干 酪 乳 杆 菌 种 特 异 性 的,PCR 扩 增 仅 有 AS 1.29 得 到 了 417bp 的 特 异 性 唯 一 条 带, 其 余 均 无 带, 见 图 7; 后 者 是 嗜 酸 乳 杆 菌 菌 株 特 异 性 的, 扩 增 后 有 的 菌 株 呈 现 一 定 的 多 态 性, 共 鉴 定 出 了 3 个 基 因 型, 只 有 AS AS AS 有 675bp 的 特 异 性 条 带, 且 只 有 AS 是 唯 一 条 带, 另 外 2 株 还 有 与 形 成 唯 一 条 带 的 AS 一 样 大 小 的 扩 增 子 (>600bp),AS 和 AS 比 AS 多 一 条 带 (<500bp), 而 AS 有 三 条 带, 多 出 的 一 条 是 >900bp 大 小 的 片 段, 见 图 8 图 7 引 物 对 LbcmanNF-R 的 特 异 性 PCR 图 谱 泳 道 M 为 DNA MarkerⅠ, 泳 道 1~10 同 图 3 图 8 引 物 对 LbamaNF-R 的 特 异 性 PCR 图 谱 泳 道 M( 左 ) 为 DNA MarkerⅠ, 泳 道 M( 右 ) 为 DNA Marker II, 泳 道 1~10 同 图 基 于 mela 的 发 酵 乳 杆 菌 特 异 性 PCR 鉴 定 : 依 据 mela 基 因 设 计 的 引 物 LbpmelAF-R, 只 有 菌 株 AS 获 得 了 416bp 的 特 异 性 的 唯 一 条 带, 其 余 菌 株 均 无 带, 见 图 9 图 9 引 物 对 LbpmelAF-R 的 特 异 性 PCR 图 谱 - 6 -

7 4. 讨 论 泳 道 M 为 DNA MarkerⅠ, 泳 道 1~10 同 图 9 生 化 试 验 将 这 9 株 菌 鉴 定 为 6 个 发 酵 型, 即 6 个 菌 群, 每 一 群 与 其 在 文 献 中 描 述 的 发 酵 型 一 致, 可 以 做 出 亚 种 水 平 的 鉴 定, 但 是 AS 除 外, 虽 然 在 阿 拉 伯 糖 的 发 酵 上 与 文 献 描 述 (90% 以 上 的 菌 株 阴 性 ) 的 不 相 一 致, 但 是 进 一 步 的 特 异 性 PCR 和 RAPD 还 是 将 其 鉴 定 为 嗜 酸 乳 杆 菌 本 研 究 也 说 明 生 化 试 验 在 种 水 平 的 鉴 定 上 尚 有 一 定 的 指 导 意 义 在 RAPD 检 测 中, 随 机 引 物 BA63 得 到 了 最 好 的 多 态 性, 最 大 限 度 的 将 9 个 菌 株 鉴 别 为 9 株 菌, 可 见 RAPD 作 为 一 项 简 单 快 速 的 指 纹 技 术, 对 菌 株 水 平 的 鉴 别 与 鉴 定 依 然 有 很 大 的 优 势 在 特 异 性 PCR 鉴 定 中, 综 合 这 7 个 图 谱 的 结 果, 可 以 得 出 结 论, 即 可 对 9 个 菌 株 进 行 菌 株 水 平 的 鉴 定, 此 外, 本 试 验 还 发 现 了 5 个 菌 种 特 异 性 PCR 引 物, 即 嗜 酸 乳 杆 菌 的 LbarbsK1F-R, 德 氏 乳 杆 菌 德 氏 亚 种 的 LbddlacZF-R, 德 氏 乳 杆 菌 保 加 利 亚 亚 种 的 LbdbmanLF-R, 干 酪 乳 杆 菌 的 LbcmanNF-R, 以 及 发 酵 乳 杆 菌 的 LbpmelAF-R; 另 外, 引 物 LbamanNF-R 可 能 是 菌 株 AS 的 株 特 异 性 PCR 引 物, 其 变 异 后 mann 可 能 有 核 苷 酸 的 丢 失 并 以 1 株 布 氏 乳 杆 菌 (Lactobacillus buchneri) 作 为 对 照, 以 达 到 更 加 可 靠 的 分 类 和 鉴 别 综 上 所 述, 本 试 验 中 对 菌 株 进 行 表 型 特 性 及 其 分 子 水 平 的 鉴 定 研 究, 得 到 了 菌 株 水 平 的 鉴 定 结 果, 表 明 只 有 多 相 鉴 定 才 能 够 做 出 乳 杆 菌 菌 株 水 平 上 的 准 确 分 类 经 证 实, 所 设 计 的 特 异 性 PCR 引 物 是 有 效 的, 这 种 基 于 表 型 特 性 差 异 的 分 子 水 平 鉴 定 方 法 是 可 靠 的 本 试 验 选 取 了 5 个 代 谢 酶 基 因 为 靶 标, 而 且 有 的 引 物 也 很 长 ( 远 大 于 10-mer), 没 有 得 到 较 大 的 多 态 性, 已 将 9 株 菌 鉴 定 到 了 菌 株 的 水 平 如 果 选 择 足 够 多 的 代 谢 酶 为 靶 标, 据 此 设 计 足 够 多 的 PCR 引 物, 并 尽 可 能 降 低 引 物 的 长 度, 更 可 能 将 更 多 的 细 菌 鉴 定 到 菌 株 的 水 平, 这 对 其 他 乳 酸 菌 乃 至 其 他 微 生 物 的 分 类 鉴 定 也 有 一 定 的 借 鉴 意 义 5. 结 论 本 实 验 通 过 对 9 株 发 酵 乳 杆 菌 菌 株 进 行 多 相 分 类 鉴 定 得 出 如 下 结 论 : 证 实 了 形 态 学 观 察 在 细 菌 鉴 定 中 的 指 示 价 值 ; 证 实 了 生 化 试 验 在 种 水 平 鉴 定 上 的 指 导 意 义 验 证 了 RAPD 对 菌 株 水 平 的 鉴 别 与 鉴 定 的 巨 大 优 势 ; 在 特 异 性 PCR 鉴 定 中, 验 证 了 对 菌 株 进 行 表 型 特 性 的 分 子 水 平 的 研 究, 得 到 了 菌 株 水 平 的 鉴 定 结 果, 表 明 只 有 多 相 鉴 定 才 能 够 做 出 乳 杆 菌 菌 种 在 菌 株 水 平 上 的 准 确 分 类 此 外, 获 得 了 5 个 种 特 异 性 PCR 引 物 LbdbmanLF-R LbcmanNF-R LbarbsK1F-R LbpmelAF-R LbddlacZF-R, 以 及 可 能 是 嗜 酸 乳 杆 菌 菌 株 AS 的 株 特 异 性 的 PCR 引 物 LbamanNF-R 参 考 文 献 [1] G. Giraffa, P. De Vecchi and L. Rossetti. Note: Identification of Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus and subspecies lactis dairy isolates by amplified rdna restriction analysis[j]journal Appl Microbiol Nov;85 [2] SOILE TYNKKYNEN, REETTA SATOKARI, MARIA SAARELA. et al. Comparison of Ribotyping, - 7 -

8 Randomly Amplified Polymorphic DNA Analysis, and Pulsed-Field Gel Electrophoresis in Typing of Lactobacillus rhamnosus and L. casei Strains[J]APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 1999, Sept, 65(9), [3] T. Guarneri, L. Rossetti and G. Giraffa. Rapid identification of Lactobacillus brevis using the polymerase chain reaction[j]letters in Applied Microbiology 2001, 33: [4] SANDRA TORRIANI, GIACOMO ZAPPAROLI, AND FRANCO DELLAGLIO1. Use of PCR-Based Methods for Rapid Differentiation of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and L. delbrueckii subsp. Lactis[J] APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 1999, 65 (10): [5] L.J.H. Ward and M.J. Timmins. Giraffa. Differentiation of Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei and Lactobacillus rhamnosus by polymerase chain reaction[j]letters in Applied Microbiology. 1999, 29: [6] Collins, M.D., Phillips, B.A., and Zanoni, P. Deoxyribonucleic acid homology studies of Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei sp. nov., subsp. paracasei and subsp. tolerans, and Lactobacillus rhamnosus sp. nov., comb. nov[j]int. J. Syst. Bacteriol. 1989, 39: [7] Ulrich RL, Hughes TA. A rapid procedure for isolating chromosomal DNA from Lactobacillus species and other Gram-positive bacteria[j]lett Appl Microbiol, 2001, 32(1): [8] L.Cocolin, M. Manzano, C. Cantoni. et al. Development of a rapid method for the identification of Lactobacillus spp. isolated from naturally fermented Italian sausages using a polymerase chain reaction temperature gradient gel electrophoresis[j]letters in Applied Microbiology. 2000, 30: [9] Muller MR, Ehrmann MA, Vogel RF. Multiplex PCR for the Detection of Lactobacillus pontis and Two Related Species in a Sourdough Fermentation[J] Appl Environ Microbiol May;66(5): [10] Prodelalova J, Spanova A, Rittich B. Application of PCR, rep-pcr and RAPD techniques for typing of Lactococcus lactis strains. Folia Microbiol (Praha), 50: 150-4, Feb, [11] Rossetti L, Giraffa G. Rapid identification of dairy lactic acid bacteria by M13-generated, RAPD-PCR fingerprint databases. J Microbiol Methods, 63: , Feb, [12] Samarzija D, Sikora S, Redzepovic S. Application of RAPD analysis for identification of Lactococcus lactis subsp. cremoris strains isolated from artisanal cultures. Microbiol Res, 157: 13-7, Jan, [13] Quenee P, Lepage E, Kim WS. Minisatellite polymorphism as a tool to distinguish closely related Lactococcus lactis strains. FEMS Microbiol Lett, 248: 101-9, Jan, [14] 袁 肖 寒, 高 学 军, 李 霞. 浓 缩 嗜 热 链 球 菌 的 超 微 结 构 研 究. 乳 业 科 学 与 技 术,110:16-18, [15] Holt J, Krieg N, Sneath P. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Ninth Edition [16] 东 秀 珠, 蔡 妙 英. 常 见 细 菌 系 统 鉴 定 手 册, 北 京 : 科 学 出 版 社,2001. [17] 凌 代 文, 东 秀 珠. 乳 酸 细 菌 分 类 鉴 定 及 实 验 方 法, 北 京 : 中 国 轻 工 业 出 版 社,1999. [18] 丛 玉 婷, 高 学 军, 刘 衍 芬 等. EZAL-MY96 乳 酸 菌 种 菌 株 分 离 鉴 定. 生 物 技 术,14:38-40, [19] 靳 淼, 高 学 军, 雷 蕾. 引 进 直 投 型 酸 奶 发 酵 剂 乳 杆 菌 的 分 离 鉴 定. 中 国 乳 品 工 业,31:14-6, [20] 和 Polyphasic taxonomy methods for identification of bacillus strains from fermented milk YANG Zhen-yu, GAO Xue-jun, WANG Ting-zhu (The Key Laboratory of Dairy Science of Ministry of Education, Northeast Agricultural U niversity, Harbin , China) Abstract In this paper, the isolation and identification of 9 bacillus strains(2 Lb. delbrueckii subsp. Bulgaricu strains, 1 Lb. delbrueckii subsp. Delbrueckii strain, 3 Lb. acidophilus strains, 1 Lb. fermentum strain, 1 Lb. casei strain, 1 Lb. buchneri strains) were studied. The lactic acid bacteria were isolated by MRS plate streaking cultivation and morphological observation (light and electron microscope examination), and were identified by biochemical essay, specific PCR and RAPD technique. The result of plate streaking cultivation was 9 strains; The size, shape and schizogenesis styles of every strain which was negatively stained by PTA were obtained by TEM observation; The biochemical essay and the specific PCR primers were designed based on the differences of each strains at the level of species and between their genes coding these biochemistry metabolic enzymes respectively, and the result of biochemical identification had 6 distinct fermentation types which classified these strains as 6 microbial population. the PCR amplifications classified these strains as 9-8 -

9 strains, which was consistent with the RAPD result, one of which 20 random primers obtained 9 distinct genotypes too, the 9 stains were 2 Lb. delbrueckii subsp. Bulgaricu strains, 1 Lb. delbrueckii subsp. Delbrueckii strain, 3 Lb. acidophilus strains, 1 Lb. fermentum strain, 1 Lb. casei strain, 1 Lb. buchneri strains. 5 species-specific PCR primers were acquired, They were LbdbmanLF-R of Lb.delbrueckii subsp. Bulgaricu strains LbcmanNF-R of Lb. casei strain LbarbsK1F-R of Lb. acidophilus strains LbpmelAF-R of Lb. fermentum strain LbddlacZF-R of Lb.delbrueckii subsp.delbrueckii strain.and even one strain-specific primers of Lb. acidophilus AS which was LbamanNF-R was gained. Key words: Lb. delbrueckii subsp, Lb. acidophilus, Lb. fermentum, Lb. casei,electron microscope, Biochemical identification, PCR 作 者 简 介 : 杨 振 宇 (1982-), 男 ( 汉 族 ), 山 东 招 远 人, 硕 士, 主 要 从 事 乳 酸 菌 的 生 化 与 分 子 生 物 学 研 究 - 9 -