材 料 与 方 法 仪 器 ACQUITY UPLC Xevo TQ-S 三 重 四 级 杆 液 质 联 用 仪 ( 美 国 Waters 公 司 ); 电 喷 雾 离 子 源 (ESI), Masslynx 4.1 数 据 处 理 系 统 (Waters);Thermo 低 温 离 心 机 ;KQ

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1 [ 应 用 纪 要 ] Rapid identification of 5 illegal additives in slimming health food by Xevo TQ-S 郝 刚 苏 州 市 食 品 药 品 检 验 所, 苏 州 关 键 词 超 高 效 液 相 色 谱 - 质 谱, 多 反 应 监 测, 减 肥 类 保 健 食 品 非 法 添 加, 快 速 定 性 定 量 摘 要 建 立 了 专 属 灵 敏 的 UPLC -MS/MS 方 法 用 于 快 速 定 性 定 量 检 测 减 肥 类 保 健 食 品 中 5 种 非 法 添 加 化 学 成 分 供 试 样 品 经 甲 醇 提 取 后, 采 用 超 高 效 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 (UPLC-MS/MS), 以 BEH C 18 为 分 析 柱, 流 动 相 采 用 含 0.1% 冰 醋 酸 的 0 mmol/l 醋 酸 铵 水 溶 液 和 甲 醇 进 行 梯 度 洗 脱, 电 喷 雾 电 离 (ESI) 多 重 反 应 监 测 (MRM) 扫 描 模 式, 对 保 健 食 品 中 非 法 添 加 的 盐 酸 西 布 曲 明 酚 酞 盐 酸 芬 氟 拉 明 咖 啡 因 呋 塞 米 等 5 种 化 学 成 分 进 行 快 速 定 性 定 量 检 测 所 建 立 方 法 能 快 速 定 性 定 量 检 测 保 健 食 品 中 5 种 非 法 添 加 化 学 药 物 成 分,5 种 成 分 在 6 分 钟 内 完 全 分 离, 且 线 性 良 好, 平 均 加 样 回 收 率 在 97.7%~100.7%, 最 小 检 出 量 为 0.1~0.3 ng/ml 所 建 方 法 快 速 灵 敏 专 属 性 强, 适 用 于 减 肥 类 保 健 食 品 中 非 法 添 加 化 学 成 分 的 快 速 定 性 定 量 检 测 ABSTRACT: The aim of this study was to develop a specific, sensitive and rapid UPLC-MS/MS method to identify 5 illegal additives in slimming health food. The ultra performance liquid chromatography-electrospray ion trap mass spectrometry method was used to detect the samples extracted with methanol. The separation was performed on Waters UPLC using BEH C 18 column with a gradient elution. The mobile phase was consisted of 0 mmol/l ammonium acetate (containing 0.1% acetic acid) and methanol. Qualitative and quantitative analysis of caffeine, furosemide, fenfluramine, phenolphthalein and sibutramine was conducted in the MRM mode by UPLC-MS/MS. A good resolution of 5 chemical drugs within 6 min was obtained by UPLC-MS/MS. The calibration curves showed good linear relationship in the range of 1~00 ng/ml for each component. The determination limits was at 0.1~0.3 ng/ml, and the average recovery rate was 97.7%~100.7%. The method was proved to be specific, rapid and sensitive, which can be used to identify 5 illegal additives in weight reducing health food. 1

2 材 料 与 方 法 仪 器 ACQUITY UPLC Xevo TQ-S 三 重 四 级 杆 液 质 联 用 仪 ( 美 国 Waters 公 司 ); 电 喷 雾 离 子 源 (ESI), Masslynx 4.1 数 据 处 理 系 统 (Waters);Thermo 低 温 离 心 机 ;KQ-300DA 型 数 控 型 超 声 波 清 洗 器 ; MILLIPORE 纯 水 仪 样 品 与 试 剂 盐 酸 西 布 曲 明 对 照 品 ( 批 号 00401, 含 量 100.0%) 酚 酞 对 照 品 ( 批 号 , 含 量 100.0%) 盐 酸 芬 氟 拉 明 对 照 品 ( 批 号 0000, 含 量 100.0%) 呋 塞 米 对 照 品 ( 批 号 0110, 含 量 99.7%) 咖 啡 因 对 照 品 ( 批 号 , 含 量 100.0%) 均 购 于 中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院 ; 实 验 用 水 为 超 纯 水, 其 他 试 剂 均 为 色 谱 纯 实 验 所 用 样 品 均 为 苏 州 市 食 品 药 品 监 督 管 理 局 抽 样 样 品 UPLC 色 谱 条 件 色 谱 柱 : BEH C 18 色 谱 柱 (.1 mm 50 mm,1.7 µm) 流 动 相 : A( 含 0. 1 % 冰 醋 酸 的 0 mmol/l 醋 酸 铵 水 溶 液 ) - B( 甲 醇 ), 梯 度 洗 脱 条 件 如 表 1 所 示 柱 温 : 35 进 样 盘 温 度 : 15 流 速 : 0.3 ml/min 进 样 量 : 1 µl 质 谱 条 件 电 喷 雾 离 子 源 ; 正 负 离 子 扫 描 ; 毛 细 管 电 压 3.0 KV; 脱 溶 剂 气 温 度 :400 ; 脱 溶 剂 气 体 流 量 :600 L/h; 锥 孔 气 流 量 :150 L/h; 碰 撞 气 体 为 氩 气 ; 多 反 应 检 测 模 式 (MRM) 监 测 对 照 品 溶 液 精 密 称 取 盐 酸 西 布 曲 明 盐 酸 芬 氟 拉 明 咖 啡 因 酚 酞 呋 塞 米 对 照 品 各 10 mg, 分 别 置 10 ml 容 量 瓶 中, 加 甲 醇 溶 解 并 稀 释 至 刻 度, 摇 匀, 分 别 精 密 量 取 1 ml, 置 100 ml 量 瓶 中, 加 甲 醇 稀 释 至 刻 度, 混 匀, 作 为 5 种 对 照 品 储 备 液 (10 µg/ml) 样 品 制 备 样 品 研 细 后, 取 细 粉 适 量 ( 约 相 当 于 一 次 用 量 ) 置 于 50 ml 量 瓶 中, 加 甲 醇 约 0 ml, 超 声 15 分 钟, 放 冷 至 室 温, 加 甲 醇 至 刻 度, 摇 匀, 滤 过, 取 续 滤 液,13000 rpm 离 心 10 min, 取 上 清 液 稀 释 500 倍,13000 rpm 离 心 10 min, 取 上 清 液 1 µl 进 样 分 析 表 1. UPLC 梯 度 条 件 时 间 (min) 流 速 (ml/min) 流 动 相 A(%) 流 动 相 B(%)

3 近 年 来, 随 着 我 国 减 肥 中 成 药 和 保 健 食 品 等 健 康 产 品 市 场 销 售 不 断 增 加, 一 些 企 业 为 增 强 减 肥 效 果, 在 产 品 中 添 加 肥 胖 症 的 治 疗 药 物 ( 如 西 布 曲 明 酚 酞 等 ), 这 些 化 学 成 分 的 毒 副 作 用 与 禁 忌 症 给 消 费 者 造 成 了 极 大 危 害 在 减 肥 类 保 健 食 品 检 测 中, 国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局 保 健 食 品 风 险 检 测 有 关 检 测 目 录 和 检 测 方 法 ( 编 号 ) 规 定 了 盐 酸 西 布 曲 明 咖 啡 因 呋 塞 米 酚 酞 盐 酸 芬 氟 拉 明 等 5 种 违 法 添 加 化 学 成 分 的 检 验 方 法, 但 该 方 法 所 需 时 间 长 (50 min), 且 不 能 进 行 定 量 研 究 1 本 实 验 基 于 超 高 效 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 技 术, 采 用 多 反 应 监 测 扫 描 方 式, 建 立 了 同 时 定 性 定 量 检 测 盐 酸 西 布 曲 明 酚 酞 盐 酸 芬 氟 拉 明 咖 啡 因 呋 塞 米 等 5 种 非 法 添 加 化 学 成 分 的 分 析 方 法, 为 减 肥 类 保 健 食 品 安 全 监 控 提 供 可 靠 的 技 术 保 障 实 验 结 果 质 谱 条 件 优 化 分 别 将 5 种 对 照 品 储 备 液 用 甲 醇 稀 释 成 500 ng/ml 的 对 照 溶 液, 选 用 ESI 离 子 化 模 式, 通 过 直 接 进 样 法, 进 行 质 谱 条 件 优 化 首 先, 采 用 一 级 质 谱 扫 描 方 式 得 到 各 化 合 物 准 分 子 离 子 峰, 在 确 定 准 分 子 离 子 的 基 础 上, 进 行 锥 孔 电 压 的 优 化, 得 到 各 化 合 物 的 最 佳 锥 孔 电 压 再 通 过 Daughter Scan 扫 描 模 式, 对 各 种 化 合 物 的 分 子 离 子 进 行 二 级 碎 片 离 子 扫 描, 每 种 化 合 物 选 择 个 特 征 碎 片 离 子 作 为 检 测 离 子, 用 于 化 合 物 定 性 判 断 的 依 据, 实 验 结 果 如 图 1 所 示 各 化 合 物 的 分 子 离 子 及 特 征 碎 片 离 子 分 别 为 : 咖 啡 因 (m/z):195 > 138, 110; 呋 塞 米 (m/z):39 > 85, 05; 芬 氟 拉 明 (m/z):3 > 187, 159; 酚 酞 (m/z):319 > 5, 197; 西 布 曲 明 (m/z):80 > 15, 139 图 1. 各 化 合 物 Daughter Scan 图 :(A) 咖 啡 因 ;(B) 呋 塞 米 ;(C) 芬 氟 拉 明 ;(D) 酚 酞 ;(E) 西 布 曲 明 注 : * 为 分 子 离 子 峰 3

4 实 验 中 同 时 确 定 各 化 合 物 的 最 佳 碰 撞 能 量, 并 采 用 多 反 应 监 测 (MRM) 扫 描 模 式 对 各 化 合 物 的 检 测 离 子 进 行 扫 描, 其 中 响 应 较 高 的 离 子 对 作 为 定 量 离 子 对 各 化 合 物 质 谱 条 件 优 化 结 果 如 表 所 示 表. MRM 分 析 的 质 谱 条 件 化 合 物 离 子 化 方 式 准 分 子 离 子 (m/z) 特 征 碎 片 离 子 (m/z) 碰 撞 能 (ev) 锥 孔 电 压 (ev) 咖 啡 因 ESI * * * 197 5* 15* 139 呋 塞 米 ESI 芬 氟 拉 明 ESI 酚 酞 ESI 西 布 曲 明 ESI + 80 色 谱 分 离 采 用 超 高 效 液 相 色 谱 系 统, 选 用 Waters BEH C 18 分 析 柱, 在 上 述 梯 度 洗 脱 和 质 谱 分 析 条 件 下, 将 5 种 化 合 物 的 混 合 对 照 品 溶 液 (5 种 化 合 物 浓 度 均 为 00 ng/ml) 进 样 1 µl 分 析 咖 啡 因 呋 塞 米 芬 氟 拉 明 酚 酞 西 布 曲 明 等 5 种 化 合 物 的 保 留 时 间 依 次 为 :1.11 min,1.84 min,.54 min, 3.43 min,4.55 min,mrm 扫 描 模 式 下 的 TIC 图 如 图 所 示,5 种 化 合 物 在 6 min 内 完 全 分 离, 分 离 度 较 好 且 分 析 时 间 短 图. 混 合 对 照 品 溶 液 的 MRM 色 谱 图 :(A) 咖 啡 因 :(B) 呋 塞 米 :(C) 芬 氟 拉 明 :(D) 酚 酞 :(E) 西 布 曲 明 4

5 线 性 范 围 精 密 量 取 1.5 项 下 5 种 对 照 品 溶 液 各 100 µl, 充 分 混 匀, 制 成 混 合 对 照 品 溶 液 (5 种 化 合 物 浓 度 均 为 µg/ml), 用 甲 醇 溶 液 逐 级 稀 释 成 浓 度 分 别 为 00 ng/ml,100 ng/ml,50 ng/ml,0 ng/ml,10 ng/ml, 5 ng/ml,1 ng/ml 的 标 准 对 照 品 混 合 溶 液, 取 1 µl 进 样 分 析, 以 峰 面 积 为 横 坐 标 (X), 各 对 照 品 浓 度 为 纵 坐 标 (Y), 进 行 线 性 回 归, 结 果 如 表 3 所 示 表 3. 5 种 化 合 物 的 回 归 方 程 及 线 性 范 围 化 合 物 线 性 回 归 方 程 相 关 系 数 (r) 线 性 范 围 (ng/ml) 咖 啡 因 Y=177.17X ~00.95 呋 塞 米 Y=167.98X ~ 芬 氟 拉 明 Y=49.98X ~00.54 酚 酞 Y=60.47X ~01.13 西 布 曲 明 Y=815.64X ~199.0 检 出 限 取 对 照 品 溶 液, 用 甲 醇 稀 释 成 一 定 浓 度 溶 液 后 进 样 测 定, 以 信 噪 比 等 于 3, 测 得 5 种 化 合 物 的 检 出 限 分 别 为 : 咖 啡 因 0.3 ng/ml, 呋 塞 米 0.3 ng/ml, 芬 氟 拉 明 0.1 ng/ml, 酚 酞 0.1 ng/ml, 西 布 曲 明 0.1 ng/ml 精 密 度 实 验 取.3 项 下 的 50 ng/ml 浓 度 的 对 照 品 溶 液 6 份, 连 续 进 样 6 次, 测 定 峰 面 积,5 种 化 合 物 峰 面 积 的 RSD 分 别 为 : 西 布 曲 明 0.50%, 酚 酞 0.44%, 呋 塞 米 0.4%, 咖 啡 因.87%, 芬 氟 拉 明 1.18%, 结 果 表 明 仪 器 精 密 度 良 好 加 样 回 收 率 分 别 精 密 吸 取 混 合 对 照 品 储 备 液 8 ml,10 ml,1 ml 各 3 份, 共 9 份, 分 别 置 于 50 ml 量 瓶 中, 每 个 量 瓶 精 密 加 入 经 测 定 不 含 上 述 五 种 化 合 物 的 减 肥 类 保 健 品 试 样 处 理 液 0 ml, 超 声 15 分 钟, 放 冷 至 室 温, 加 甲 醇 稀 释 至 刻 度, 摇 匀, 滤 过, 取 续 滤 液,13000 rpm 离 心 10 min, 取 上 清 液 1 µl 进 样, 记 录 图 谱, 代 入 回 归 方 程, 计 算 回 收 率,5 种 化 学 成 分 的 平 均 加 样 回 收 率 分 别 为 : 咖 啡 因 97.7±.5%, 呋 塞 米 98.9±1.7%, 芬 氟 拉 明 99.1±.%, 酚 酞 98.3±1.5%, 西 布 曲 明 100.7±1.9% 5

6 样 品 测 定 结 果 按 1.6 项 下 对 10 批 减 肥 类 保 健 食 品 进 行 样 品 前 处 理, 以 所 建 质 谱 方 法 对 10 批 样 品 进 行 定 性 定 量 分 析, 结 果 发 现 与 咖 啡 因 芬 氟 拉 明 酚 酞 西 布 曲 明 保 留 时 间 一 致 的 总 离 子 流 图, 其 中 咖 啡 因 检 出 4 批 ( 其 中 批 样 品 为 左 旋 肉 碱 减 肥 咖 啡, 其 咖 啡 因 成 分 不 做 定 量 分 析 ), 芬 氟 拉 明 检 出 批, 酚 酞 检 出 10 批, 西 布 曲 明 检 出 6 批 采 用 MRM 方 式, 利 用 所 选 定 量 离 子 对 上 述 样 品 进 行 定 量 分 析, 结 果 如 表 4 所 示, 咖 啡 因 添 加 量 为 0.88~.31 mg/g, 芬 氟 拉 明 添 加 量 为 0.09~.01 mg/g, 酚 酞 添 加 量 为 0.10~0.41 mg/g, 西 布 曲 明 添 加 量 为 0.08~16.3 mg/g 10 批 供 试 样 品 中 均 未 检 出 呋 塞 米 表 4. 样 品 检 测 结 果 编 号 咖 啡 因 呋 塞 米 芬 氟 拉 明 酚 酞 西 布 曲 明 mg/g 4.5 mg/g 16.3 mg/g / mg/g 9.37 mg/g mg/g 5.48 mg/g mg/g 0.5 mg/g 5.31 mg/g mg/g mg/g.38 mg/g 0.08 mg/g mg/g mg/g mg/g - 9 / mg/g 10.0 mg/g mg/g - 6

7 讨 论 参 考 文 献 非 法 添 加 化 学 成 分 现 象 的 日 益 严 重, 不 仅 影 响 了 我 国 保 健 食 品 行 业 的 健 康 发 展, 也 给 广 大 消 费 人 群 造 成 了 极 大 危 害 目 前, 国 内 减 肥 类 保 健 食 品 具 有 品 种 繁 多 销 售 量 大 需 求 广 泛 等 特 征, 其 常 见 的 非 法 添 加 化 学 成 分 主 要 包 括 西 布 曲 明 酚 酞 咖 啡 因 等 物 质 这 些 违 禁 药 物 严 重 威 胁 了 服 用 者 的 生 命 健 康, 如 西 布 曲 明 是 抑 制 中 枢 神 经 的 化 学 药 物, 服 用 后 通 过 抑 制 食 欲 来 达 到 减 肥 的 效 果, 但 易 诱 发 心 梗 卒 中 心 脏 骤 停 等 严 重 心 血 管 疾 患 而 长 期 或 过 量 服 用 酚 酞, 可 造 成 人 体 电 解 质 紊 乱, 诱 发 心 律 失 常 神 志 不 清, 甚 至 致 癌 此 外, 咖 啡 因 是 一 种 神 经 兴 奋 剂, 长 期 使 用 可 能 会 导 致 头 痛 失 眠 神 经 质 颤 栗 坐 立 不 安 -4 或 心 跳 加 速 等 不 良 反 应 这 些 违 禁 药 物 的 添 加 具 有 添 加 量 少, 添 加 种 类 多 等 特 点, 因 此, 开 发 灵 敏 度 高 专 属 性 强 的 分 析 方 法 已 成 为 当 务 之 急 1. 食 药 监 办 许 [010] 114 号 文 件 附 件 : 减 肥 类 保 健 食 品 违 法 添 加 药 物 的 检 测 方 法. 黎 银 波, 孟 庆 玉, 钟 庆 元, 等 UPLC-MS/MS 法 快 速 检 测 减 肥 类 保 健 食 品 中 7 种 违 法 添 加 的 药 物 [J], 中 南 药 学,01,10(10): 张 翠 英, 李 振 国, 刘 乃 强 UPLC-MS/MS 法 检 测 减 肥 制 剂 中 非 法 添 加 麻 黄 碱 西 布 曲 明 和 芬 氟 拉 明 [J] 中 国 卫 生 检 验 杂 志,011,1(8): 曾 涛, 常 用 减 肥 药 物 的 不 良 反 应 [J] 中 国 药 师,007,10(6): 本 实 验 基 于 UPLC-MS/MS 的 超 高 分 辨 能 力 超 高 分 析 速 度, 及 质 谱 提 供 的 结 构 信 息, 开 发 了 同 时 定 性 定 量 检 测 盐 酸 西 布 曲 明 盐 酸 芬 氟 拉 明 咖 啡 因 酚 酞 呋 塞 米 等 5 种 减 肥 类 保 健 食 品 中 常 见 非 法 添 加 化 学 药 物 的 检 测 方 法 通 过 MRM 扫 描 模 式, 针 对 每 个 化 合 物 选 取 两 个 特 征 碎 片 离 子 作 为 定 性 依 据, 同 时 选 择 其 中 响 应 较 高 的 反 应 离 子 对 作 为 定 量 离 子 对, 从 而 实 现 对 上 述 5 种 化 学 添 加 药 物 的 同 时 定 性 定 量 分 析, 并 将 上 述 方 法 应 用 于 10 批 减 肥 类 保 健 食 品 的 非 法 添 加 检 测 工 作, 结 果 表 明, 抽 取 的 10 批 减 肥 类 保 健 食 品 均 添 加 了 酚 酞, 而 西 布 曲 明 芬 氟 拉 明 咖 啡 因 等 成 分 也 有 检 出, 且 10 批 固 体 类 保 健 食 品 的 非 法 添 加 量 为 mg/g 数 量 级 综 上, 本 实 验 所 建 方 法 具 有 专 属 性 强 灵 敏 度 高 分 析 时 间 短 能 同 时 进 行 定 性 定 量 分 析 等 优 点, 改 进 了 现 行 的 国 家 标 准 检 验 方 法 1, 提 高 了 减 肥 类 保 健 食 品 非 法 添 加 的 检 验 效 率, 为 该 类 保 健 食 品 的 安 全 监 控 提 供 了 可 靠 的 技 术 保 障 沃 特 斯 中 国 有 限 公 司 沃 特 世 科 技 ( 上 海 ) 有 限 公 司 北 京 : 上 海 : 广 州 : 成 都 : 香 港 : 年 沃 特 世 公 司 印 制 于 中 国 免 费 售 后 服 务 热 线 :800 (400)