安捷伦应用解决方案 单克隆抗体高分离度分离和定量 SEC 方法的开发和部分验证 配备 Agilent Bio SEC-3 色谱柱的 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统 应用简报 生物制药 mau 作者 M. Sundaram Palanisw

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1 安捷伦应用解决方案 单克隆抗体高分离度分离和定量 SEC 方法的开发和部分验证 配备 Agilent Bio SEC-3 色谱柱的 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统 应用简报 生物制药 作者 25 M. Sundaram Palaniswamy 安捷伦科技有限公司印度班加罗尔 摘要 体积排阻色谱 (SEC) 是用于高分子物质 ( 如蛋白质或聚合物 ) 表征的重要技术 它是测定和定量蛋白质类药物聚集水平的标准方法, 并且通常为监管审批所必需 本应用简报介绍了一种用于单克隆抗体 (mab) 定量分析的简单且灵敏的 SEC 方法 采用配有 Agilent Bio SEC-3 色谱柱的 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统来实现 mab 的分离和定量 Bio SEC-3 色谱柱是体积排阻色谱领域的一项突破性技术 该型色谱柱填充了涂布有专利亲水层的球形 窄粒径分布的 3 µm 硅胶填料 使用蛋白质分子量标准校正色谱柱 通过单克隆抗体的验证性研究证实了用于常规分析时方法的稳定性 此外,Bio SEC-3 色谱柱还可用于分离和检测 mab 聚集体 仪器具有生物惰性和耐腐蚀性, 再结合简单且重现性好的方法, 使得该解决方案非常适用于生物制药行业中单克隆抗体的 QA/QC 分析

2 前言 单克隆抗体 (mab) 属于免疫球蛋白 (Ig) 家族中的糖蛋白 它们可以用来治疗几种危及生命的疾病, 例如癌症 炎症性疾病, 以及器官移植 传染性疾病和心血管疾病的并发症 与其它所有蛋白质治疗药物类似,mAb 也会在其生产 储存和运输过程中发生聚集 治疗性蛋白发生聚集是非常不利的, 因为这会导致其活性丧失 溶解度下降并增强其免疫原性 1 SEC 已被广泛用于表征人 IgG 中的蛋白质聚集体 2 这是分析聚集体的标准方法, 并且是蛋白质治疗药物申请监管审批的必备方法 3 Agilent Bio SEC-3 色谱柱有多种孔径可选, 非常适合于蛋白质分析, 尤其是治疗性生物分子中二聚体和聚集体的测定 本应用简报论证了采用 Agilent 126 生物惰性四元液相色谱系统和 Agilent Bio SEC-3,Å,7.8 mm,3 µm 色谱柱, 通过 SEC 法定量 分离和监测 IgG1 完整性的适用性 并介绍了低浓度条件下 IgG1 定量 ( 使用峰面积 ) 的最优化 SEC 方法的方法验证 我们还论证了采用 126 生物惰性四元液相色谱系统和 Bio SEC-3 色谱柱分离和监测 mab 聚集体的适用性 仪器设备软件安捷伦化学工作站 B.4.2( 或更高版本 ) 仪器采用完全生物兼容且最大系统耐压为 SEC 参数 6 bar 的 Agilent 126 Infinity 生物惰性四采用 126 生物惰性液相色谱系统的 SEC 元液相色谱系统, 由以下几个模块组成 : 色谱参数见表 1 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液试剂 样品与材料相色谱泵 (G5611A) 人单克隆抗体 IgG1 是一种专有的药物分子 Agilent 126 Infinity 生物惰性高效自 DL- 二硫苏糖醇 (DTT) 二水合磷酸氢二钠 动进样器 (G5667A) 二水合磷酸二氢钠 氯化钠 盐酸 (HCl) 和氢氧化钠 (NaOH) 均购自西格玛奥德里 Agilent 1 Infinity 系列恒温器 (G133B) 奇公司 所有化学品和溶剂均为 HPLC 级, 包含生物惰性溶剂加热元件的 Agilent 高纯水使用 Milli Q 水纯化系统 (Millipore 126 Infinity 柱温箱 (G1316C 选项 19) Elix 1 型, 美国 ) 制备 配备 6 mm 最大光强高灵敏度流通池的 Agilent 126 Infinity 二极管阵列检测器 (G4212B 选项 33) Agilent Bio SEC-3,Å,7.8 mm, 填充 3 µm 填料 ( 部件号 ) 在整个样品流路中没有任何金属组件, 因此样品不会接触到金属表面 溶剂输送管路中没有任何不锈钢或铁质组件 参数 条件 流动相 A 15 mm 磷酸钠 (ph = 7.), 含 15 mm 氯化钠 ( 流动相 ) TCC 温度 室温 等度运行 流动相 A 进样体积 5 µl 流速.8 ml/ 紫外检测 22 和 28 nm 表 1 SEC HPLC 的色谱参数 2

3 校正 Bio SEC-3 色谱柱通过测定几种标准品 ( 蛋白质聚集体 甲状腺球蛋白 (67 KDa) g- 球蛋白 (158 KDa) 卵清蛋白 (44 KDa) 肌红蛋白 (17 KDa) 和维生素 B12 (1.35 KDa)) 的洗脱体积来校正 Bio SEC-3 色谱柱 以标准品的分配系数 (K) 值对它们各自分子量的对数绘制曲线 线性和范围校正曲线由范围 12.5 到 µg/ml 的 8 个 IgG1 标准浓度点构建 定量限 (LOQ) 和检测限 (LOD) 信噪比 (S/N) > 3 时的最低 IgG1 浓度定义为 LOD,S/N > 1 时的定义为 LOQ 步骤首先注入 5 µl 流动相 A 作为空白, 然后平行测定 6 次各线性水平样品 用每个浓度水平下的峰面积和保留时间 (RT) 来计算标准偏差 (SD) 和相对标准偏差 (RSD%) 值 并以较低线性水平溶液的进样分析确定 LOD 和 LOQ 以各个线性水平下的平均峰面积对 IgG1 的浓度绘制线性曲线 通过改变四个关键方法参数来评估方法的稳定性 稳定性研究改变下列四个关键方法参数来验证 SEC 分析步骤 进样体积的变化 (±1%) 缓冲液 ph 的变化 (± 1%) 流速的变化 (± 5%) 缓冲液组成的变化 (± 15 mm NaCl) 对于每个稳定性参数, 取 5 µl IgG1 进样分析,6 次重复测定计算平均峰面积和保留时间 计算与原方法相比的峰面积 / 保留时间 (RT) 的百分偏差 ( 准确度 %) 制备蛋白质聚集体用流动相将单克隆抗体稀释至终浓度为 1 mg/ml, 用来制备 IgG1 聚集体 评估了三种生成聚集体的方法 : 1. 冻融诱导聚集 : a. 使 IgG1 溶液经受循环冻融 b. 一次冻融循环包括在 2 C 下冷冻 IgG1 6, 随后在 4 C 融化 3 c. 每一次冻融循环后都取一份等分样品进行 SEC 分析 2. 热诱导聚集 : a. 将 IgG1 溶液在 7 C 下孵育 b. 每隔 1 取等分样品进行 SEC 分析来考察其聚集情况 3. ph 诱导聚集 : ph 诱导聚集的实施方法与以前介绍的方法相同 1 简而言之, 即使用移液管将 1 M HCl 溶液缓缓滴加到 IgG1 溶液中, 使其 ph 值从 6. 变到 1. 然后, 滴加 1 M NaOH 溶液调节 ph 值到 1. 最后, 再次滴加 1 M HCl 溶液将 ph 值调回 6. ph 值变化间大约有 1 的等待时间, 同时以 5 rpm 速度持续搅拌溶液 3

4 结果与讨论分离和检测 校正 Agilent Bio SEC-3 色谱柱时使用了一系列分子量已知的标准蛋白质 ( 图 1) 采用下面的公式计算每个标准蛋白质的分配系数 K: K = (Ve - V )/ (Vt - V ) Ve = 洗脱体积 Vt = 柱体积 V = 死体积 DAD1 A Sig = g B 将 Bio SEC-3 色谱柱上于 时洗脱出的 蛋白质标准液中的标准蛋白质聚集体 ( 空白峰 ) 用于计算死体积, 对应的 V=5.578 (ml) Bio SEC-3 色谱柱分离生物分子的校正曲线显示存在线性关系, 并定义了所分析蛋白质范围 ( KDa) 的排阻限度 (67 KDa)( 图 2) 然后可以使用此曲线图根据未知蛋白质的洗脱体积确定其分子量 图 1 采用 Agilent Bio SEC-3,Å,7.8 mm,3 µm 色谱柱分离标准品 B KDa R² = KDa (K) KDa g- 158 KDa KDa 4 Log 5 6 图 2 采用 Agilent Bio SEC-3,Å,7.8 mm,3 µm 色谱柱分离标准品获得的校正曲线 4

5 图 3 表明在该色谱条件下, 使用 Agilent Bio SEC-3,Å,7.8 mm,3 µm 色谱柱, 可以在 3 内对完整 IgG1 实现良好分离 图 3 中没有较早或较晚出现的洗脱峰, 这说明所制备的 lgg1 是均质的, 没有出现任何聚集或降解 保留时间和峰面积的精确度表 2 中所示为 IgG1 平行 6 次进样测定平均保留时间和峰面积的 RSD 值 保留时间和峰面积的 RSD 值分别为.8% 和.639%, 这说明方法的重现性和系统的精确度优异 DAD1 A, Sig = DAD1 B, Sig = 图 3 采用 Agilent Bio SEC-3,Å,7.8 mm,3 µm 色谱柱测定完整 IgG1 获得的 Agilent Bio SEC-3 谱图 ( 平行 6 次的重叠色谱图 ) 保留时间 表 2 保留时间和峰面积的精确度 (n = 6) 峰面积 平均值 () RSD 平均值 (/) RSD

6 稳定性改变原方法的四个关键参数来评估方法的稳定性 ( 表 3) 保留时间和峰面积 RSD 值的允许偏差分别设定为 ± 3.% 和 ± 5% 红色数字表示结果超过了允许偏差的范围 进样体积 缓冲液的 ph 值和缓冲液的组成对保留时间的影响在可接受的范围内 与实际方法相比,± 1% 的流速变化会导致保留时间 RSD 值发生显著偏离, 当然, 这种由于 SEC 色谱柱等度洗脱造成的偏差是可以预料的 IgG1 峰面积的 RSD 值在可接受的限度内 当流动相的 ph 值变化 +1% 时, 峰面积的 RSD 值超出了允许限度 在对实验条件有意进行一些更改时, 色谱模式没有发生进一步的显著变化, 这表明方法是稳定的 我们的结果表明, 方法对于常规的 QA/QC 应用是可靠的 当然, 有些参数 ( 如缓冲液 ph 值 ) 非常关键, 必须仔细控制 参数 进样体积的变化 (5 µl ± 1%) 缓冲液 ph 值的变化 (7. ± 1%) 流速的变化 (.8 ± 5%) 缓冲液组成的变化 (± 15 mm NaCl) 表 3 稳定性 ( 保留时间和峰面积的 RSD%)n = 6 变化值 保留时间偏差 ( 限度 ± 3.%) - 1% % % % % % mm NaCl mm NaCl IgG1 的浓度 (µg/ml) S/N = 信噪比平均峰面积 (LOD) (LOQ) 表 4 LOD LOQ 和 S/N 的结果 (n = 6) 峰面积偏差 ( 限度 ± 5.%) 检测限 (LOD) 与定量限 (LOQ) LOD 和 LOQ 分别为 12.5 µg/ml 和 25 µg/ml, 这表明该方法的灵敏度很高 表 4 列出了 IgG1 的 LOD 和 LOQ 观测值, 图 4 中所示为 IgG1 的 LOD 和 LOQ 以及空白的重叠色谱图 4 3 DAD1 A Sig = 22 - DAD1 A Sig = 22 - LOD DAD1 A Sig = 22 - LOQ 2 LOQ 1 LOD 图 4 IgG1 的 LOD (12.5 µg/ml) LOQ (25 µg/ml) 及空白的重叠色谱图 6

7 线性使用面积响应与 IgG1 的浓度 ( 从 LOQ 到本研究中的最高浓度水平 ) 构建 IgG1 的线性曲线 准确度结果列于表 5 观测到的准确度值为 82%-112%, 相应浓度范围为 - µg/ml, 这表明 SEC 方法可准确定量 图 5 中所示为 12.5 到 µg/ml 浓度范围内的 IgG1 线性曲线 IgG1 的浓度 (µg/ml) 平均峰面积 峰面积的标准偏差 采用标准线性方程 进行反演计算 % 准确度 变异系数 (%) 表 5 线性范围概览 (n = 6) 1 y = x R² =.9997 DAD1 A Sig= IgG1 (µg/ml) 图 5 浓度范围为 12.5 到 µg/ml 的 8 个标准浓度 IgG1 的线性曲线显示出极佳的线性相关系数值 还展示了线性范围内的重叠色谱图 7

8 分析 IgG 聚集体聚集是蛋白质类药物开发过程中面临的主要问题, 因为可能使产品的药效下降并影响其外观 尽管聚集体的浓度极低, 但它仍然对产品的品质有很大影响 通常使用 SEC 监测聚集现象, 这是由于它可以实现 按分子大小进行分离, 且使用了特别设计的 与生物分子相互作用最小的填料颗粒 我们采用 SEC HPLC 法比较了完整和经过条件诱导 ( 冻融和温度 ) 作用后的 IgG1 样品 对于聚集体的测定, 任何在色谱运行中早于 ( 左侧 ) 完整 IgG1 被洗脱出来 4,5 的峰都将被定义为聚集体 很显然, 向 IgG1 施加的诱导条件导致其构象发生了的变化 ( 图 6) 完整的 IgG1 大多为单分子构造 由于冻融和温度刺激, 峰高出现明显降低, 这可能是由于这些分子的部分去折叠造成的 35 DAD1 A Sig=22 IgG1 35 DAD1 A Sig=22 IgG IgG1 5 IgG 图 6 IgG1 的 Agilent Bio SEC-3 色谱图显示了其经过冻融和温度聚集诱导作用后的构象变化 8

9 ph 诱导的聚集体色谱图如图 7 所示, 表明 该方法可以分离和检测聚集体以及完整的 IgG1 完整 IgG1 和聚集体彼此的分离度 良好, 洗脱时间分别为 9.69 和 8.5 DAD1 A Sig=22 14 A DAD1 A Sig=22 B 图 7 经过 ph 聚集诱导的 IgG1 聚集体的 Agilent Bio SEC-3 色谱图 (A), 以及与完整 IgG1 的重叠色谱图 (B) 9

10 结论 体积排阻色谱通常按体积的大小来测定和分离蛋白质聚集体 本文中我们展示了 Agilent 126 Infinity 生物惰性液相色谱系统和 Agilent Bio SEC-3,Å,3 µm 色谱柱, 能够用于在生物制药的工艺开发和过程监测中, 对单克隆抗体进行高重现性和高分离度的分析 开发了简单 灵敏度高的 SEC 方法进行 lgg1 的鉴定和定量 在对实验条件进行一些更改时, 色谱模式没有发生显著变化, 这表明方法是稳定的 浓度范围 12.5 到 µg/ml 的 8 个标准浓度 IgG1 的线性曲线显示出极佳的线性相关系数值, 表明 SEC 方法可进行准确定量 LOD 和 LOQ 分别为 12.5 µg/ml 和 25 µg/ml, 这表明该方法的灵敏度很高 聚集诱导研究表明, 采用 Bio SEC 3 色谱柱的 SEC 法能够分离和检测 IgG1 的聚集体及其构象变化 仪器具有生物惰性和耐腐蚀性, 再结合简单且重现性好的方法, 使得该解决方案尤其适用于生物制药行业中单克隆抗体的 QA/QC 分析 参考文献 1. Basak Kükrer & Vasco Filipe & Esther van Duijn & Piotr T. Kasper & Rob J. Vreeken & Albert J. R. Heck & Wim Jiskoot, Pharm Res. 27: , Arakawa, T., Philo, J. S., Ejima, D., Tsumoto, K., Arisaka, F, Aggregation analysis of therapeutic proteins, part 1. General aspects and techniques for assessment. BioProcess International, Vol. 4, No. 1, 32-42, A. Buchacher, G. Iberer, A. Jungbauer, H. Schwinn, D. Josic, Biotechnol. Prog , Skoog, D.A.; Holler, F.J.; Nieman, T.A. Principles of Instrumental Analysis,5th Ed.; Harcourt Brace and Company, Rodriquez-Diaz, R.; Wehr, T. Use of Size Exclusion Chromatography in Biopharmaceutical Development, in Analytical Techniques for Biopharmaceutical Development; Rodriquez-Diaz, R.; Wehr, T.; Tuck, S.; Eds.; Informahealthcare: New York, 5. 1

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