前言多酚类物质是植物的次级代谢物, 通常参与抵御紫外线辐射或病原体过去十年来, 人们日益关注膳食植物中的多酚类物质 [1-3] 食品中的多酚类物质可影响苦味涩味色泽味道气味和氧化稳定性所有植物性酚类化合物都是由共同的中间体苯丙氨酸或类似的前体莽草酸转化而来 [4] 在植物中发现的酚类

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缄誉戚
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1 利用 Agilent Poroshell µm 色谱柱轻松实现方法转移并改善性能应用简报食品检测与农业作者 William Long 安捷伦科技公司摘要本研究中将最初在 mm, 5 µm 色谱柱上开发的分离九种酚类化合物的方法转移至采用 4 µm 和 2.7 µm 颗粒的 Agilent Poroshell 120 EC-C18, mm 色谱柱将这些色谱柱的性能与填充以 1.8 µm 全多孔颗粒的尺寸类似的色谱柱的性能进行比较同时对梯度和流速进行扩展, 并保持恒定的保留因子, 以确定每种色谱柱的最佳流速通过切换为 Poroshell 120 EC-C18 4 µm 色谱柱并对梯度进行优化, 峰容量由 50 增加至 67 本应用简报提供了简单的方法转移指南采用 4µm 色谱柱的方法的背压低于 200 bar, 这种方法可轻松转移至任何 HPLC 系统

2 前言多酚类物质是植物的次级代谢物, 通常参与抵御紫外线辐射或病原体过去十年来, 人们日益关注膳食植物中的多酚类物质 [1-3] 食品中的多酚类物质可影响苦味涩味色泽味道气味和氧化稳定性所有植物性酚类化合物都是由共同的中间体苯丙氨酸或类似的前体莽草酸转化而来 [4] 在植物中发现的酚类 - 黄酮类化合物包括鞣花酸儿茶酚没食子酸槲皮素间苯二酚丹宁酸香草醛水杨酸乙酰水杨酸和苯甲酸环境中的酚类化合物主要在工业生产中产生这些酚类化合物包括塑料中所用的抗氧化剂农药中的酚类煤炭石油和木材的燃烧以及酚醛树脂生产过程中产生的酚类物质在许多情况下, 酚类化合物由自然过程产生但是, 当这些化合物排放到地下水时, 它们会严重影响许多水生生物因此, 酚类化合物的分析测定非常重要, 因为这些化合物具有毒性且使用广泛 [5,6] 多年来, 这类化合物的分析普遍采用 5 µm HPLC 色谱柱许多研究人员愿意为避免高压不熟悉的仪器和可能的色谱柱堵塞问题牺牲效率和稳定性与使用类似尺寸的 5µm 色谱柱的方法相比,Agilent Poroshell µm 色谱柱可改善分离能力 Poroshell µm 色谱柱的背压仅略高于 5 µm 色谱柱, 可轻松用于相同的仪器此外, 其使用与 5 µm 色谱柱相同的 2 µm 滤芯, 使其有助于避免色谱柱堵塞, 并且无需额外的样品前处理本研究将梯度方法从 mm, 5 µm 色谱柱转移至 Poroshell 120, mm, 4 µm 色谱柱或 Poroshell µm 色谱柱为确定最佳峰容量下的流速, 我们对梯度进行了扩展最后, 我们比较了各实验的背压, 证明 Poroshell 120 色谱柱能够轻松应用于任何液相色谱系统实验部分本研究采用 Agilent 1260 Infinity 液相色谱仪利用流动相 A(0.1 % 甲酸水溶液 ) 和流动相 B(0.1% 甲酸的乙腈溶液 ) 对 G1312B SL 二元泵进行设置梯度如表 1 所示, 其中将时间段相对于流速成比例缩放, 以在整个实验过程中获得恒定的保留因子泵配有脉冲阻尼器, 并移除混合柱表 mm 色谱柱采用的梯度程序 % B 时间 (min) 流速 (ml/min) 使用 G1367C 自动液体进样器, 进样量为 20 µl G1316B 柱温箱设置为 35 C G4212A 二极管阵列检测器设置为 nm, 且参比波长为 nm, 配有光程为 10 mm 且容量为 1 µl 的 G 流通池采用 Agilent Open Lab 软件 1.05C 版控制 HPLC 并处理数据色谱柱 Agilent Poroshell 120 EC-C18, mm, 4 µm ( 部件号 ) Agilent Poroshell 120 EC-C18, mm, 2.7 µm ( 部件号 ) Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18, mm, 1.8 µm ( 部件号 ) Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18, mm, 5 µm ( 部件号 ) 2

3 目标化合物及其相应的结构如图 1 所示用水将化合物稀释至 1 mg/ml 将等量样品混合得到混合样品, 并用水按 1:10 的比例进行稀释所有样品均采用硫脲作为死体积标记物以测定 t 0 硫脲氢醌间苯二酚苯酚 4- 硝基苯酚对甲酚邻甲酚 2,3- 二甲苯酚 2,5- 二甲苯酚 1- 萘酚和甲酸购自 Sigma-Aldrich 公司, 乙腈购自 Honeywell 水经 Milli-Q 系统 (Millipore) 过滤, 电阻率为 18 MW, 现场制备结果与讨论 Coman 和 Moldovan 的研究 [6] 展示了一种对饮用水和地表水中常见酚类进行分离和定量分析的优异方案本研究旨在通过提高分析的峰容量或通过大幅缩短色谱运行时间对色谱方法进行改进采用甲酸代替乙酸来降低流动相 ph 此外, 我们在水相和有机流动相中均添加了甲酸, 使基线水平更高然而, 在改变这些色谱条件时必须保持 k* 值不变, 以便在改善峰容量的同时不会影响选择性如之前一份应用简报所述 [6], 对初始梯度进行扩展, 保持色谱柱体积恒定并保持方法选择性不变在本研究中, 所采用的流速为 0.5 ml/min 至 3.5 ml/min, 以 0.5 ml/min 的间隔递增根据公式 1, 开发出表 1 所列的条件这些条件手动计算得到, 用作采用 100 mm 色谱柱的色谱程序的基础从表中可以看到, 对于色谱程序中的所有步骤, 其时间均随流速增加而成比例缩短 k* = (t g F)/(d/2)2L(D%B) 公式 1 图 1. 目标化合物其中 : t g 为梯度时间 F 为流速 L 为柱长 d 为色谱柱内径 D%B 为梯度时段内的有机相含量 3

4 图 2 为样品色谱图, 其中包括采用 1.8 µm 和 5 µm 全多孔 ZORBAX Eclipse Plus C18 以及 4 µm 和 2.7 µm Poroshell 120 EC-C18 获得的图从图中可以看出, 四种色谱柱的洗脱顺序和相对间隔均相同但是, 两种表面多孔型色谱柱 (4 µm 和 2.7 µm) 的保留时间略低于两种全多孔色谱柱 (5 µm 和 1.8 µm) 该方法可在这些色谱柱之间轻松转移图 3 示出四种色谱柱的背压和粒径之间的关系, 粒径较大的色谱柱具有较低的背压采用图 2 所示的条件 (1.5 ml/min) 时,5 µm 色谱柱和 4 µm Poroshell 120 色谱柱的背压低于 200 bar 使用 4 µm Poroshell 120 EC-C18 色谱柱的大多数方法均在该流速下运行图 2. 在 1.5 ml/min 下得到的叠加色谱图图 3. 不同色谱柱的背压与流速之间的关系 4

5 条件峰容量 nc = (t R,n t R,1 )/w 公式 2 其中 : t R,n 和 t R,1 为最后一个及第一个洗脱峰的保留时间 w 为 4s 峰宽,= (W½ /2.35) 4 W½ 为半峰高处的峰宽各色谱图的峰容量如图 4 所示在 2.5 ml/min 下, 采用 1.8 µm ZORBAX Eclipse Plus C18 色谱柱获得了最高的峰容量在更快的流速下能够获得更高的峰容量但是, 这样将超出 600 bar 的背压上限 100 mm Poroshell 120 EC- C18, 2.7 µm 色谱柱在 2 ml/min 和 3 ml/min 之间获得了次高的峰容量从图 4 中可以看出, 在较低流速下,2.7 µm Poroshell 120 和 1.8 µm ZORBAX Eclipse Plus C18 色谱柱具有几乎相同的峰容量 Poroshell 120 EC-C18, 100 mm, 4µm 色谱柱在 1 ml/min 和 2 ml/min 之间获得了次高的峰容量, 该流速处于使用 4.6 mm 内径色谱柱的大多数色谱法的起始范围内 5µm 色谱柱在 1 ml/min 和 1.5 ml/min 之间具有最佳峰容量一般来说, 对于相同尺寸的全多孔色谱柱, 较大粒径的色谱柱在较低的最佳流速下获得的峰容量也较低图 5A 和 5B 示出各种色谱柱上两个色谱峰对的分离度变化色谱峰对 6/7 为 4- 甲基苯酚和 2- 甲基苯酚, 色谱峰对 8/9 为 2,3- 二甲基苯酚和 2,4- 二甲基苯酚这些高度相关的化合物的色谱峰对代表大多数方法开发化学家每天所面对的问题如图 5B 所示,2.7 µm Poroshell 120 色谱柱在 2.5 ml/min 下获得的最佳峰分离度为 2.4,1.8 µm 色谱柱在 2.5 ml/min 下获得的最佳峰分离度为 2,4 µm Poroshell 120 色谱柱在 2.5 ml/min 下获得的最佳峰分离度为 1.9,5 µm 色谱柱在 1.5 ml/min 下获得的最佳峰分离度为 1.2 与峰容量一样, 较大粒径的色谱柱具有较低的最佳峰分离度此外, 较大粒径的色谱柱在较低流速下获得最佳峰分离度图 4. 在 0.5 ml/min 至 3.5 ml/min 流速范围内得到的峰容量优化结果图 5. 在 0.5 ml/min 至 3.5 ml/min 流速范围内得到的分离度优化结果 5

6 结论与填充以传统全多孔颗粒的色谱柱相比, 填充以表面多孔颗粒的 HPLC 色谱柱具有许多优势 Agilent Poroshell 120 EC-C18, 4 µm 色谱柱相比于 5 µm 全多孔色谱柱大幅提升了柱效和峰容量表面多孔型 2.7 µm Poroshell 120 EC-C18 色谱柱提供了与 1.8 µm Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 色谱柱类似的柱效和选择性, 同时不会产生较高的背压由于 Poroshell 120 EC-C18 和 ZORBAX Eclipse Plus C18 色谱柱之间具有类似的选择性, 因此可轻松转移方法以缩短运行时间改善通量并提高峰容量更多信息这些数据仅代表典型的结果有关我们的产品与服务的详细信息, 请访问我们的网站参考文献 1. Rainha, N.; Koci, K.; Coelho, A. V.; Lima, E.; Baptista, J.; Fernandes-Ferreira, M. HPLC UV ESI-MS analysis of phenolic compounds and antioxidant properties of Hypericum undulatum shoot cultures and wild-growing plants. Phytochem. 2013, 86, Vagiri, M.; Ekholm, A.; Andersson, S. C.; Johansson, E.; Rumpunen, K. An optimized Method for Analysis of Phenolic Compounds in Buds, Leaves, and Fruits of Black Currant (Ribes nigrum L.). J. Agric. Food Chem. 2012, 60, Proestos, C.; Sereli, D.; Komaitis, M. Determination of phenolic compounds in aromatic plants by RP-HPLC and GC-MS. Food Chem. 2006, 95, Mradu, G.; Saumyakanti, S.; Sohini, M.; Arup, M. HPLC Profiles of Standard Phenolic Compounds Present in Medicinal Plants. Int. J. Pharmacog. Phytochem. Res. 2012, 4, Coman, C.; Moldovan, Z. RP-HPLC Method for the Separation of Some Phenol Derivatives Using Gradient Elution and UV Detection. J. High Resol. Chromatogr. 2000, 23, W. J. Long; A. E. Brooks. 使用 Agilent Poroshell 120 EC-C18 色谱柱快速分析环境中的酚类, 安捷伦科技公司应用简报, 出版号 CHCN, 仅限研究使用不可用于诊断目的安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任本资料中的信息说明和指标如有变更, 恕不另行通知安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 3 月 1 日, 中国出版 CHCN

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5989_5672.qxd 使用 HPLC Online SPE 方法分析复方甘草制剂中的吗啡应用甘草, 固相萃取, 二维液相色谱, 超高效液相色谱作者肖尧李浪安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 北京,100102 摘要目的 : 建立两种复方甘草制剂中吗啡成分测定的 Online SPE-UHPLC